Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen quantitativen Nierenfunktionstest bei Zebrafischen zu generieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Zebrafischembryonen bei 72 HPF betäubt werden. Anschließend werden die Embryonen in eine Spritzgussform überführt und so ausgerichtet, dass sich ihr Herz links vom Sichtfeld befindet.

Dann wird die Perikardhöhle mit einem Panmin-Dextra-Fluoreszenzfarbstoff injiziert und es werden Fluoreszenzbilder der Herzregion mit einem Epi-Fluoreszenz-Präpariermikroskop benötigt. Letztendlich wird die Clearance eines Fluoreszenzfarbstoffs in der Niere mit Hilfe der Epi-Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine quantitative Messung der Nierenfunktion von Zebrafischen ermöglicht, ohne dass Blut- oder Harntests erforderlich sind, die bei Zebrafischen nicht möglich sind.

Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bewertung der Nierenfunktion in Modellen für Zebrafischkrankheiten. Nachdem Sie die Nadeln gezogen und eine Form gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, gießen Sie die Form, indem Sie zuerst eine in Fischwasser hergestellte 2%aro-Lösung in eine 90-Millimeter-Petrischale gießen. Legen Sie die Form auf die Petrischale, so dass die gestapelten Gleitkanten in einem Winkel unter die Agrooberfläche eintauchen können.

Lassen Sie es 30 Minuten lang aushärten. Entfernen Sie den Objektträgerabdruck und verwenden Sie frisches Fischwasser, das Trica-Anästhetikum im Verhältnis eins zu 25 enthält. Zum Abdecken des Objektträgers prägte Aros, um Zebrafisch-Injektionen von Fluoreszenzfarbstoff durchzuführen.

Verwenden Sie ein Standard-Mikroinjektionssystem, das aus einem Luftkompressor besteht, der mit einem Druckregelsystem verbunden ist, das in einen geraden Pipettenhalter für den Einsatz mit Kapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,0 speist. Der Pipettenhalter sollte in einem MN 33 compact untergebracht werden. Dreiachsiger Mikromanipulator mit Steuerung, der durch ein magnetisches Stativ an einer Stahlgrundplatte befestigt ist, um Embryonen zu visualisieren, zu manipulieren und zu injizieren, während Zebrafische unter Standardbedingungen gehalten werden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwenden Sie je nach Versuch Wildtyp- oder transgene Zebrafischlinien. Beibehaltung einer Besatzdichte von 15 Männchen bis 15 Weibchen pro Acht-Liter-Tank, um sicherzustellen, dass möglichst viele Eier gesammelt werden, ohne die Fische zu stören. Tauchen Sie die Aufzuchtbecken am Abend vor der Entnahme in Wildtyp-Vorratsbecken ein.

Warten Sie am Tag der Entnahme 30 bis 40 Minuten, bis die Fische laichen. Verwenden Sie dann ein Netzsieb und frisches Aquarienwasser, um die Eier aufzufangen und zu spülen. Legen Sie die gereinigten Eizellen in eine 90-Millimeter-Petrischale, in der sich Embryo und Medium befinden, und inkubieren Sie sie bei 28,5 Grad Celsius, um die Myogenese zu hemmen.

Bei acht Stunden. Nach der Befruchtung oder HPF. Übertragen Sie die lebensfähigen Embryonen in minimaler Flüssigkeit in frische Petrischalen mit einem bis 100 PTU in das Embryomedium und inkubieren Sie sie weiter bei 28,5 Grad Celsius.

Verwenden Sie eine Pinzette mit feiner Spitze, um das Ende der Nadel zu brechen. Bewegen Sie dann den RD an die Spitze der Nadel, indem Sie die Pulsdauer auf die Minuteneinstellung maximieren. Wenn die Lösung die Spitze erreicht, schalten Sie zurück auf Millisekunden.

Stellen Sie ein Mikrometer auf den Mikroskoptisch und stellen Sie mit dem Druckregler und den Verfeinerungen an der Nadelspitze die Größe des Ausstoßtröpfchens auf einen Durchmesser von 100 Mikrometern oder ein Volumen von 0,5 Nanolitern vor der Injektion ein. Stellen Sie 2 35-Millimeter-Petrischalen auf. Jedes enthält fünf Milliliter Embryomedium, das eine Trica und das andere die Genesung.

Geben Sie 200 Mikroliter Brühe Trica in die mit Trica beschriftete Schale. Sobald Sie zur Injektion bereit sind, wählen Sie einen einzelnen Embryo mit 72 HPF aus. Übertragen Sie so wenig Flüssigkeit in die Trica-Schale und überwachen Sie die Aktivität des Embryos.

Sobald der Embryo betäubt ist, übertragen Sie ihn in die Spritzgussform und richten Sie ihn in der Wanne so aus, dass die linke Seite nach oben zeigt. Positionieren Sie das Herz auf der linken Seite des Sichtfelds. Um die RD in das Herz zu injizieren, durchstechen Sie mit der Nadel das Perikard und injizieren Sie einen Nanoliter RD in die Perikardhöhle

Nachdem Sie die Nadel herausgezogen haben, geben Sie den injizierten Embryo in minimaler Flüssigkeit in die Auffangschale und überwachen Sie ihn eine Minute lang. Übertragen Sie dann den einzelnen Embryo auf eine 24-Well-Platte, die einen Milliliter frisches Embryomedium enthält, das PTU enthält, und etikettieren Sie es entsprechend. Nach der Injektion inkubieren mindestens 10 Embryonen pro Versuchsgruppe drei Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius.

Drei Stunden nach der Injektion oder HPI anästhesierten die Embryonen wie zuvor beschrieben. Und in eine 35-Millimeter-Petrischale mit 3% Methylcellulose umfüllen. Schieben Sie die Embryonen vorsichtig in die Methylcellulose und richten Sie sie so aus, dass die laterale Seite abgebildet werden kann.

Nehmen Sie mit einem Emissionsfilter von 570 Nanometern für UV-Licht ein Bild des Embryos auf. Lassen Sie den Embryo sich erholen, bevor Sie ihn wieder in die dafür vorgesehene Vertiefung legen, erfassen Sie Bilder für alle injizierten Embryonen und inkubieren Sie dann bei 28,5 Grad Celsius weiter. Nachdem ich eine zweite Runde von Bildern bei 24 HP aufgenommen habe, verwende ich die Image J-Software, um die Fluoreszenzintensität jedes injizierten Embryos zu quantifizieren, indem ich ein Bild öffne und eine Region of Interest oder ROI anzeige.

Wenn Sie Auswahl bearbeiten wählen, legen Sie den Wert auf 100 Quadratpixel fest. Positionieren Sie das Herz in der Mitte des ROI und wählen Sie Analysieren, Messungen festlegen und stellen Sie die Messungen so ein, dass sie die mittleren Graustufen und den Bereich enthalten. Nehmen Sie dann die Messung vor, quantifizieren Sie die Fluoreszenz für jeden Bildsatz bei drei HPI und 24 HPI pro Embryo und übertragen Sie die durchschnittlichen Graustufenwerte zur weiteren Verarbeitung in eine Tabelle.

Verwenden Sie geeignete Software, um statistische Analysen durchzuführen und Gruppen auf statistische Signifikanz zu vergleichen, indem Sie den T-Test des Schülers verwenden, wie hier gezeigt. Die Injektion von RD in bbbs neun Morpho-injizierte Fische führte dazu, dass 40% der Embryonen fünf Tage nach der Befruchtung anfällige Fric-Zysten entwickelten. Darüber hinaus zeigten die Morphin-Fische im Vergleich zu den Kontrollen eine Verringerung der Fähigkeit, den Fluoreszenzfarbstoff nach 24 HPI zu beseitigen.

Einmal muss eine Gruppe von 10 Fischen innerhalb von 15 Minuten injiziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die optische Transparenz des Zebrafisches nutzen können, um die zeitliche Clearance eines mikroinjizierten Fluoreszenzfarbstoffs quantitativ zu überwachen, um die Nierenfunktion des Zebrafisches effektiv auszulesen.