Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen quantitativen Nierenfunktionsassay in Zebrafischen zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zebrafischembryonen im Alter von 72 HPF anästhesiert werden. Anschließend werden die Embryonen in eine Injektionsschablone überführt und so ausgerichtet, dass sich ihre Herzen links im Sichtfeld befinden.

Dann wird die Perikardialhöhle mit einem ruminen Dextran-Fluoreszenzfarbstoff injiziert, und fluoreszierende Aufnahmen der Herzregion werden mithilfe eines Epi-Fluoreszenz-Zerlege­mikroskops angefertigt. Abschließend wird die Nierenausscheidung eines Fluoreszenzfarbstoffs mittels Epi-Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine quantitative Aussage über die Nierenfunktion von Zebrabärblingen ermöglicht, ohne dass Blut- oder Harnuntersuchungen erforderlich sind, die bei Zebrabärblingen nicht durchführbar sind.

Diese Methode stellt ein leistungsstarkes Werkzeug zur Beurteilung der Nierenfunktion in Zebrafisch-Krankheitsmodellen dar. Nachdem die Nadeln gezogen und eine Form gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, gießen Sie die Form, indem Sie zunächst eine in Fischwasser hergestellte 2%aro-Lösung in eine 90-Millimeter-Petrischale geben. Stellen Sie die Form auf die Petrischale und lassen Sie die Kanten der gestapelten Objektträger in einem Winkel unter die Agar-Oberfläche eintauchen.

Lassen Sie es 30 Minuten lang ruhen. Entfernen Sie die Objektträgerform und verwenden Sie frisches Fischwasser, das Trica-Anästhetikum im Verhältnis 1 zu 25 enthält. Um den abgedruckten Objektträger abzudecken, führen Sie Zebrafisch-Injektionen mit fluoreszierendem Farbstoff durch.

Verwenden Sie eine Standard-Mikroinjektionsanlage, die aus einem Luftkompressor besteht, der mit einem Druckreglersystem verbunden ist, das in einen geraden Pipettenhalter für Kapillaren mit 1,0 mm Außendurchmesser führt. Der Pipettenhalter sollte in einem MN 33 compact untergebracht sein. Ein dreiaxiger Mikromanipulator, der mit einem magnetischen Stativ an einer Stahlgrundplatte befestigt ist, und ein Stereomikroskop ermöglichen es dem Benutzer, Embryonen zu visualisieren, zu manipulieren und zu injizieren, während Zebrafische unter den im Textprotokoll beschriebenen Standardbedingungen gehalten werden.

Verwenden Sie Wildtyp- oder transgene Zebrafischarten, wie für das Experiment geeignet. Halten Sie eine Besatzdichte von 15 Männchen und 15 Weibchen pro acht Liter Tank ein, um eine maximale Eiersammlung sicherzustellen, ohne die Fische zu stören. Stellen Sie die Laichtanks am Abend vor der Sammlung in die Wildtyp-Besatztanks ein.

Am Tag der Sammlung 30 bis 40 Minuten für die Fortpflanzung der Fische einplanen. Anschließend die Eier mit einem Sieb und frischem Aquarienwasser sammeln und abspülen. Die gereinigten Eier in eine 90 Millimeter große Petrischale mit Embryomedium geben und bei 28,5 Grad Celsius inkubieren, um die Myogenese zu hemmen.

Nach acht Stunden post fertilization (HPF) überführen Sie die lebensfähigen Embryonen mit minimalem Flüssigkeitsvolumen in frische Petrischalen, die ein bis 100 PTU in Embryomedium enthalten, und inkubieren sie weiter bei 28,5 Grad Celsius.

Verwenden Sie feine Pinzette, um die Nadelspitze zu brechen. Bewegen Sie dann das RD an die Nadelspitze, indem Sie die Puls­dauer auf die Minuten­einstellung maximieren. Sobald die Lösung die Spitze erreicht hat, schalten Sie wieder auf Millisekunden um.

Platzieren Sie ein Mikrometer auf dem Mikroskopstadium und stellen Sie mit dem Druckregler und Feinjustierungen an der Nadelspitze die Größe des austretenden Tröpfchens auf einen Durchmesser von 100 Mikrometern oder ein Volumen von 0,5 Nanolitern vor der Injektion ein. Bereiten Sie zwei 35-Millimeter-Petri-Schalen vor, von denen jede fünf Milliliter Embryomedium enthält; beschriften Sie eine mit „trica“ und die andere mit „recovery“.

Fügen Sie 200 Mikroliter Stammlösung von trica der mit trica beschrifteten Schale hinzu. Sobald die Injektion erfolgen soll, wählen Sie ein einzelnes Embryo im Stadium von 72 HPF aus. Übertragen Sie eine minimale Menge Flüssigkeit in die trica-Schale und überwachen Sie die Aktivität des Embryos.

Wenn das Embryo betäubt ist, überführen Sie es in die Injektionsform und richten Sie es in der Rille so aus, dass die linke Seite nach oben zeigt, wobei das Herz auf der linken Seite des Sichtfelds positioniert wird. Um das RD in das Herz zu injizieren, durchstechen Sie mit der Nadel das Perikard und injizieren Sie ein Nanoliter RD in den Perikardraum.

Nachdem die Nadel zurückgezogen wurde, überführen Sie das injizierte Embryo mit minimalem Flüssigkeitsvolumen in die Wiederherstellungsschale und beobachten Sie es eine Minute lang. Anschließend überführen Sie das einzelne Embryo in eine 24-Well-Platte, die ein Milliliter frisches Embryomedium mit PTU enthält, und beschriften Sie entsprechend. Nach der Injektion von mindestens 10 Embryonen pro Versuchsgruppe inkubieren Sie bei 28,5 Grad Celsius für drei Stunden.

Drei Stunden nach der Injektion (HPI) anesthetisieren Sie die Embryonen wie zuvor beschrieben und überführen Sie sie in eine 35-Millimeter-Petri-Schale, die 3 % Methylcellulose enthält. Drücken Sie die Embryonen vorsichtig in die Methylcellulose und richten Sie sie so aus, dass die laterale Seite abgebildet werden kann.

Unter Verwendung eines Emissionsfilters von 570 Nanometern für UV-Licht ein Bild des Embryos aufnehmen. Den Embryo vor dem Zurücklegen in das vorgesehene Bohrloch erholen lassen, Bilder für alle injizierten Embryonen aufnehmen und anschließend bei 28,5 Grad Celsius weiter inkubieren. Nach der Aufnahme einer zweiten Bildserie bei 24 HP verwende ich die Software ImageJ, um die Fluoreszenzintensität jedes injizierten Embryos zu quantifizieren, indem ich ein Bild öffne und einen interessierenden Bereich oder ROI festlege.

Wählen Sie „Auswahl bearbeiten“, geben Sie einen Wert von 100 Quadratpixeln an und setzen Sie diesen. Positionieren Sie das Herz in der Mitte des interessierenden Bereichs (ROI) und wählen Sie „Analysieren“, „Messungen festlegen“ und setzen Sie die Messungen so, dass sie den mittleren Grauwert und die Fläche umfassen. Nehmen Sie dann die Messung vor, quantifizieren Sie die Fluoreszenz für jeden Satz von Bildern zu drei HPI und 24 HPI pro Embryo und übertragen Sie die durchschnittlichen Grauwerte in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Verarbeitung.

Verwenden Sie geeignete Software, um eine statistische Analyse durchzuführen und die Gruppen mittels des Student'schen T-Tests auf statistische Signifikanz zu vergleichen, wie hier gezeigt. Die Injektion von RD in bbbs neun Morpho-injizierte Fische führte dazu, dass 40 % der Embryonen bis fünf Tage nach der Befruchtung präne fric-Zysten entwickelten. Außerdem zeigten die Morpho-Fische eine verminderte Fähigkeit, den fluoreszierenden Farbstoff nach 24 HPI im Vergleich zu den Kontrollen zu eliminieren.

Einmal muss eine Gruppe von 10 Fischen innerhalb von 15 Minuten injiziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die optische Transparenz von Zebrafischen nutzen können, um den zeitlichen Abbau eines mikroinjizierten fluoreszierenden Farbstoffs als effektiven Messparameter für die Nierenfunktion von Zebrafischen quantitativ zu überwachen.