Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von Entamoeba histolytica Infektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, frühe Wirts-Erreger-Interaktionen und das Invasionspotenzial von TBA zu bewerten. Histolytica. Zuerst werden die intakten Trophozoiten, die Trophozoiten, die Gesamtlysate oder die sezernierten Trophozoiten zubereitet. Inkubieren Sie dann Wirtsepithelzellen mit geeigneten Konzentrationen der verschiedenen Trophozoiten.

Analysieren Sie nun mit Hilfe der AM-Immunfluoreszenz die behandelten Epithelkulturen auf ausgewählte ABA histolytica-Proteine, die mit den Tight Junctions der Epithelzellen interagieren, und messen Sie auch Veränderungen der parazellulären Barriere durch den elektrischen Widerstand des trans-Epithels. Zusammengenommen können die Ergebnisse die Demontage von Tight Junctions durch TBA Histolytica demonstrieren und auch die Beteiligung der ausgewählten Komplexe an diesem Prozess aufzeigen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Verwendung verschiedener Produkte des Parasiten, um die Translokation von Eva-histo-Faktoren in das Wirtsepithel zu bewerten und die Beteiligung dieser Eva-Faktoren zu demonstrieren.

Seine Faktoren betreffen die Verbindungsöffnung ganzer Zellen zu sehr frühen Zeitpunkten der Infektion. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Amöbenhaftigkeit zu beantworten, wie z. B. das Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Diva-Isli-Parasiten. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie das angemessene Verhältnis der Inkubationszeiten zwischen den beiden Zellzeiten für die Co-Inkubation nicht kennen und auch nicht wissen, wie sie die verschiedenen ELI-Produkte erhalten und wie die TER gemessen werden kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf unsere Therapie von amis, da diese vir-Faktoren wie der E-H-C-P-A-D-H 112-Komplex als Ziele in neuen Behandlungsstrategien genutzt werden könnten. Vier. Diese In-vitro-Methode kann Aufschluss über die Beteiligung des Anica-Virusfaktors an der anfänglichen Interaktion an der Krankenhausstelle geben. Es kann auch auf andere Systeme wie Inbivo, Infektionsmodelle bei Hamstermäusen, Meerschweinchen und auch in menschlichen Darmbiopsien angewendet werden. Kultur.

Die MDCK-Zellen in 10 Millilitern komplementärem DMEM-Medium bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Wachsen Sie authentisch einmal 10 bis zum fünften Trophozoiten von Schlotamöben histolytica in 15 Millilitern TYIS 33, medium bei 37 Grad Celsius. Um die Trophozoiten zu lösen, kühlen Sie das Röhrchen fünf bis 10 Minuten lang in einem Eiswasserbad.

Dann die Kultur aseptisch in ein konisches Röhrchen überführen und bei 360 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Dekantieren Sie nun vorsichtig den Überstand. Geben Sie eiskaltes PBS in das Pellet und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um die Zellen nach der Zentrifugation zu dispergieren.

Bestimmen Sie die Anzahl der Trophozoiten mit einem Hämozytometer, um die Trophozoiten eine Minute lang in flüssigem Stickstoff einzufrieren, bei vier Grad Celsius aufzutauen und kräftig zu wirbeln. Aktivieren Sie nun die in den Lysaten vorhandenen Proteasen mit 0,02%Beta Mercaptoethanol. Verdünnen Sie neunmal 10 zu den sechs Trophozoiten in drei Millilitern eiskaltem PBS und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Legen Sie nun die Tropho-Suspension in einem um fünf Grad geneigten horizontalen Winkel für zwei Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um die abgesonderten Produkte zu sammeln, und zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 360 mal G. Verwenden Sie eine sterile Einwegspritze, um den Überstand vorsichtig zu sammeln, um eine Kontamination der Proben mit Trophozoiten aus dem Pellet zu vermeiden. Um dann alle übertragenen Zellen zu eliminieren, leiten Sie den Überstand durch eine 0,22 Mikrometer große Celluloseacetatmembran.

Aktivieren Sie nun die Proteasen mit 0,02%Beta-Mercaptoethanol für die Immunfluoreszenzkultur. Die MDCK-Zellen auf steriler Glasabdeckung werden in eine 24-Multiwell-Zellkulturschale gesteckt. Untersuchen Sie die Zellen am inversen Mikroskop, bis sie eine Konfluenz von 100 % erreichen.

Fügen Sie die verschiedenen Bedingungen von Trophozoiten hinzu, die in einem Milliliter warmem PBS verdünnt sind. Berücksichtigen Sie die Kontrollbedingungen von MDCK-Zellen mit PBS und ohne e histolytica sowie MDCK-Zellen mit den unterschiedlichen Bedingungen von Trophozoiten, die jedoch eine Inkubation mit primären Antikörpern emittieren. Legen Sie die Kulturplatte für zwei oder 30 Minuten in den Inkubator.

Waschen Sie anschließend die Epithelzellen fünfmal mit kaltem PBS, um ungebundene Moleküle oder Trophozoiten zu eliminieren. Fixieren und permatisieren Sie die Zellen mit einem Milliliter 96%igem Ethanol für Minuten bei minus 20 Grad Celsius in einer Feuchtkammer. Nehmen Sie die Deckgläser vorsichtig aus den Vertiefungen.

Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier vom Rand und tauchen Sie den Deckglas mit den Zellen nach unten in eine 0,5%ige BSA-Blocklösung. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Mischung aus Primärantikörpern in PBS vor.

Heben Sie die Deckgläser von der Blockierlösung ab. Trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier. Übertragen Sie die Zellen in die Antikörperlösung und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen fünfmal mit einem Milliliter PBS, um ungebundene Moleküle zu entfernen. Bereiten Sie nun eine Mischung aus den beiden fluoreszierenden Sekundärantikörpern in PBS vor. Inkubieren Sie die Proben in Sekundärantikörpern für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln für die Kernfärbung.

Inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang mit 200 Mikrolitern 0,05 millimolar Feuchtlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln. Analysieren Sie nun die Präparate durch konfokale Mikroskopie durch Zack-Schnitte und XZ-Ebenen in Co-Inkubationsexperimenten. Inkubieren Sie jede Versuchsbedingung unter Verwendung von Proteaseinhibitoren oder einem spezifischen Antikörper 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit Proteaseinhibitoren oder einer monoklonalen Antikörperkultur.

MDCK-Zellen auf sterilen transwellpermeablen Trägern in das obere Kompartiment geben, 100 Mikroliter der zellulären Suspension und in das untere Kompartiment 600 Mikroliter supplementiertes DMEM-Medium geben. Legen Sie die vorbereiteten Transwell-Filter in den Inkubator auf einem inversen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Zellen zu 100 % konfluent sind.

Sammeln und sammeln Sie das Medium aus dem oberen Fach jedes Transwells auf 50 Mikroliter dieses Mediengemisches. Fügen Sie 50 Mikroliter Trophozoiten-Suspension oder PBS-Kontrolle hinzu. Übertragen Sie nun die Mischungen in die obere Kammer jedes Transwells, in der sich die MDCK-Zellen befinden.

Tauchen Sie sofort zwei Elektroden des STX in jeden Transwell, um den elektrischen transepithelialen Widerstand zu messen. Stellen Sie sicher, dass die längere Elektrode den Boden der unteren Kammer berührt und dass die kürzere Elektrode im oberen Fach mit Medium bedeckt ist. Die E histolytica wurden unter Akzentbedingungen kultiviert und in der späten logarithmischen bis frühen stationären Wachstumsphase geerntet.

Hier wurde der Tight-Junction-Marker Null eins verwendet, um Zellkontakte von Epithelzellen sichtbar zu machen, die durch Tight- und Adhärenzverbindungen stabilisiert werden. Die Immunfluoreszenz mit dem monoklonalen Antikörper wurde verwendet, um die Wechselwirkung des von Amöben abgeleiteten Komplexes mit der epithelialen Oberfläche zu untersuchen. Die Anwendung von Trophozoiten, Trophozoiten, Gesamtlysaten oder sekretierten Produkten auf die Epithelmonoschicht führte zu einer Kolokalisation des Komplexes mit Tight Junction. Nach 30 Minuten entwickelte sich eine diskontinuierliche ZO-Eins-Färbung an den Zellgrenzen und eine Internalisierung in Vesikel.

Diese Störung war am ausgeprägtesten bei den Zellkontakten des MDCK mit Trophozoiten und Trophozoiten. Die konfokale Lasermikroskopie der Gesamtlysate zeigte, dass der Virulenzkomplex in den Interzellularraum vordrang. Die Co-Lokalisation mit dem gestörten Parasitenkontakt ze O one störte die epitheliale Barrierefunktion und führte zu einem Abfall des transepithelialen elektrischen Widerstands um 90 %.

Die Vorinkubation der Trophozoiten mit einem Antikörper gegen den Komplex oder mit Proteaseinhibitoren führte zu einem Schutz gegen den eingenommenen TER-Tropfen. Zusammen. Diese Daten deuten darauf hin, dass sowohl die proteolytische Aktivität als auch die adhäsiven Eigenschaften wichtige Virulenzfaktoren dieses Komplexes während der Invasion von e histolytica sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mechanismen analysieren können, durch die EMBA histolytica virale Faktoren Tight Junctions zu frühen Infektionszeiten öffnen. Wenn Sie diese Meisterhaftung durchführen, kann diese Analyse der Epithelschädigung in drei Stunden durchgeführt werden, sobald die Lya-Produkte und Zellkulturen bereit sind.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, sich an die genauen Wechselwirkungszeiten für Ionen zu halten. Andere Methoden, wie z.B. Immunpräzipitationsassays, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. mögliche Assoziationen zwischen Enba, histolytischen Gewaltfaktoren und Epithelproteinen nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Alside-Wechselwirkungen, um die Pathogenese von AMS bei Hamstermäusen, Meerschweinchen und in menschlichem Gewebe zu erforschen.