Multimodale Quantitative Phase Imaging mit digitalen holografischen Mikroskopie Beurteilt Exakt Darmentzündung und Epithelial Wundheilung

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, mithilfe der digitalen holographischen Mikroskopie (DHM) eine automatisierte färbungsfreie quantitative Phasenkontrastbildgebung von Darmentzündungs-Dickdarmgewebeproben für die multimodale Beurteilung der epithelialen Wundheilung in vitro bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der gastrointestinalen Entzündung und Wundheilung über die Krankheitsaktivität bei entzündeten Menschen und Meeren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Nachweis und die Quantifizierung von Zellen und Geweben anhand physikalischer Parameter auf fleckenfreie und objektive Weise ermöglicht. Die Verfahren werden von Fittest Ketelhut, einem Techniker des Biomedical Technology Center, vorgeführt.

Richten Sie die Zellkultur ein, inkubieren Sie viermal zehn bis zur fünften, Caco zwei Zellen pro Quadratzentimeter in 35-Millimeter-Petrischalen mit hohen Kultureinsätzen in RPMI-Medium, ergänzt mit FBS und Antibiotika, bei 37 Grad Celsius bei 95 % Luftfeuchtigkeit und fünf Prozent Kohlendioxid. Behandeln Sie die Zellen nach zwei Tagen mit dem gewünschten Wirkstoff und stellen Sie die Kulturen für weitere 24 Stunden in den Inkubator. Am nächsten Tag saugen Sie den Überstand ab und entfernen die Einsätze mit einer Pinzette.

Waschen Sie die Kultur ein- bis zweimal mit einem Milliliter HEPES-gepuffertem Zellkulturmedium, um abgestorbene Zellen und verbleibende Zellbestandteile aus dem Wundbereich zu entfernen. Fügen Sie dann zwei Milliliter frisches HEPES-Puffermedium hinzu und schließen Sie die Schüssel. Platzieren Sie nun die Petrischale in das digitale holographische Mikroskop und wählen Sie das 10 x Objektiv aus.

Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware und wählen Sie den Hellfeld-Bildgebungsmodus. Stellen Sie die Heizkammer auf 37 Grad Celsius ein und stellen Sie die Kultur in die Heizkammer. Verschieben Sie anschließend das Betrachtungsfeld, bis eine geeignete Wunde mit einer einzigen riesigen Zellschicht und geraden Rändern auf beiden Seiten ohne abgestorbene Zellen oder Serum im Live-Überwachungsfenster sichtbar ist.

Nehmen Sie ein Weißlichtbild des anfänglichen Wundbereichs auf. Schalten Sie dann die Weißlichtbeleuchtung aus und wählen Sie den digitalen holografischen Mikroskopiemodus. Schalten Sie die Laserbeleuchtung ein und wählen Sie eine Belichtungszeit von weniger als drei Millisekunden für die Hologrammaufnahme.

Wenn die holographischen Interferenzstreifen ohne Zugriff mit einem ausreichenden Kontrast erscheinen, nehmen Sie ein Probenhologramm auf und rekonstruieren Sie ein quantitatives Phasenbild mit der Rekonstruktionssoftware, um die Bildqualität zu überprüfen. Starten Sie dann eine Zeitraffer-DHM-Beobachtung der Wunde, stoppen Sie die Aufzeichnung am entsprechenden Endpunkt und erhalten Sie ein endgültiges Bild der Probe unter Weißlichtbeleuchtung. Für die Induktion von akutem Dextran-Natriumsulfat oder DSS-Colitis geben Sie Mäusen ablibidim drei Gramm DSS, gelöst in 100 Millilitern autoklaviertem Wasser.

Nach sieben Tagen erhalten Sie sieben Mikrometer dicke Schnitte von Schweizer gerollten Dickdarmproben von den Kontrolltieren und den behandelten Tieren. Tauchen Sie jeden Abschnitt in 50 bis 100 Mikroliter PBS und decken Sie die Proben mit einzelnen Glasabdeckfolien ab. Vergewissern Sie sich, dass die Unterseiten der Objektträger frei von Staub und anderen Verunreinigungen sind.

Legen Sie dann den ersten Objektträger auf den Mikroskoptisch und passen Sie das Sichtfeld an, bis der interessierende Gewebebereich sichtbar ist. Bringen Sie die Probe in den scharfen Fokus und nehmen Sie ein Hellfeldbild in der Bildaufnahmesoftware auf. Wählen Sie dann den DHM-Bildgebungsmodus und wechseln Sie zur Laserlichtbeleuchtung.

Stellen Sie eine Belichtungszeit von weniger als drei Millisekunden ein, und vergewissern Sie sich, dass die holografischen Interferenzstreifen ohne Zugriff mit einem angemessenen Kontrast im Live-Imaging-Fenster angezeigt werden. Nehmen Sie dann ein digitales Hologramm des Gewebes auf. Endoskopisch umfasst der Nachweis einer mittelschweren bis schweren Kolitis eine Verdickung der Dickdarmwand, Veränderungen des Gefäßmusters, Fasernedudationen und die Körnung der Schleimhautoberfläche.

Die konventionelle histologische Beurteilung der Dickdarmschnitte zeigt ein ausgeprägtes Ödem in der Dickdarmwand der behandelten DSS im Vergleich zu den Kontrolltieren, die überwiegend in der Submukosa lokalisiert waren. Entsprechende quantitative DHM-Phasenkontrastbilder und zugehörige Brechungsindexkarten zeigen ebenfalls, dass diese Gewebeveränderungen ohne sichtbare Unterschiede in der Dichte des epithelialen Menstromas besonders in den nativen ungefärbten Gewebeproben sichtbar sind. Der Brechungsindex ist im Epithel, in der Submukosa und im Stroma der kolitischen Mäuse im Vergleich zu den gesunden Kontrollen signifikant reduziert, wobei eine signifikante Korrelation zwischen dem relativen Verlust des Körpergewichts und dem Brechungsindex bei den Versuchstieren besteht.

Hier wird die repräsentative kontinuierliche Überwachung eines Wundheilungsassays mittels digitaler holographischer Mikroskopie über 45 Stunden gezeigt. Dies ermöglicht die Berechnung der bedeckten Zelloberfläche, der durchschnittlichen Zelldicke und der zellulären Trockenmasse im Verlauf des Heilungsprozesses. Wir haben gezeigt, dass DHM eine kontinuierliche Überwachung der epithelialen Wundheilung ermöglicht und gleichzeitig Biokerninformationen über Zytokin-induzierte Zellveränderungen liefert.

Darüber hinaus demonstrieren wir die genaue Beurteilung histologischer Schädigungen in Colitis-Modellen und humanen Dickdarmgewebeproben mittels DHM durch Messung von Brechungsindexänderungen. Da die DHM auf der Detektion der Verzögerung der optischen Weglängen basiert, können absolute biophysikalische Parameter, wie Gewebedichte, Trockenmasse oder Zelldicke, durch fleckenfreie quantitative Phasenkontrastbildgebung analysiert werden. Die Kulmination von DHM mit gängigen Forschungsmikroskopen und die Robustheit der Technik ebnet den Weg für routinemäßige Anwendungen dieser Methode in der Zellbiologie und digitalen Pathologie.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die digitale holographische Mikroskopie für die Analyse von Geweben lebender Zellkulturen in der biomedizinischen Laborumgebung einsetzen können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die DHM ein wertvolles, neuartiges und quantitatives Werkzeug für die Bewertung absoluter Entzündungsparameter sowie für die vereinfachte Quantifizierung der epithelialen Freiwilligkeit in vitro mit einem hohen Potenzial für den translationalen diagnostischen Einsatz darstellt.