Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, gentechnisch veränderte Astrozytommodelle aus definierten Zelltypen für die phänotypische Charakterisierung in vitro und in vivo zu generieren. Dies wird durch die Ernte von Wildtyp-Primärzellen von Nicht-Cree-exprimierenden neonatalen, bedingt gentechnisch veränderten Mäusen für in vitro-Kulturen erreicht. Im zweiten Schritt werden die Primärzellen mit einem adenoviralen Vektor infiziert, der für die Cree-Rekombination kodiert, um eine genetische Rekombination der F-flox-Allele in vitro zu induzieren.

Anschließend werden die rekombinierten Zellen seriell kultiviert, um sie phänotypisch zu charakterisieren. Letztendlich wird durch die Charakterisierung tumorogener relevanter Phänotypen in vitro und in vivo bestimmt, ob die definierten Mutationen die Gliagenesie in spezifischen neuralen Zelltypen fördern. Diese Methode kann helfen, wichtige neuroonkologische Fragen zu beantworten, wie z. B. Was sind die phänotypischen Folgen von Astrozytom-assoziierten Mutationen?

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die präklinische Medikamentenentwicklung für Astrozytome, da diese genetisch definierten Zellen in vitro und in vivo in immunkompetenten syngenetischen Mäusen verwendet werden können. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Zellentnahme und der orthotopen Injektion technisch schwierig sind und eine genaue Identifizierung der anatomischen Strukturen erfordern. Ryan Bash, ein Techniker aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen, um das Gehirngewebe zu entnehmen.

Beginnen Sie mit einer ethanolsterilisierten Präparierschere, um einen sagittalen Schnitt in die Haut über dem Schädel einer ein bis drei Tage alten euthanasierten, neugeborenen, gentechnisch veränderten Maus vom Rückenmark bis zur Nase zu machen. Machen Sie dann einen Schnitt im Schädel entlang der sagittalen Naht, beginnend am Rückenmark und über die Riechkolben hinaus. Verwenden Sie dann eine gebogene Pinzette, um jede Hemisphäre des Schädels mit einer geraden Mikrozange seitlich vom Gehirn weg zu schälen.

Als nächstes kneifen Sie vorsichtig den dorsalen Teil jeder kortikalen Hemisphäre weg, wobei Sie darauf achten, das Kleinhirn und den Riechkolben zu vermeiden, und legen Sie das Hirngewebe in eine Gewebekulturschale, die H-B-S-S-N enthält. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop zwei Paar Mikrozangen, um die Hirnhäute vorsichtig von jeder kortikalen Hemisphäre zu entfernen, und setzen Sie die Gewebekulturschale wieder auf das Eis, um das Hirngewebe zu homogenisieren. Zuerst verwendest du eine saubere Rasierklinge, um die kortikalen Halbkugeln zu würfeln.

Schieben Sie dann die Platte in eine Gewebekulturhaube und geben Sie die Gewebestücke in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Platte mit einem Milliliter eiskaltem HBSS aus und geben Sie die Wäsche ebenfalls in die Tube. Nach dem Entfernen des überschüssigen HBSS bei zwei Millilitern Raumtemperatur wird das EDTA in das Röhrchen verschoben und die Gewebefragmente weiter zugeordnet, indem man mit einer Ein-Milliliter-Pipette etwa 10 Mal auf und ab pipettiert.

Inkubieren Sie die Zellsuspension 15 bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Durch vorsichtiges Mischen der Zelllösung durch Inversion alle fünf Minuten nach der Inkubation wurden drei Milliliter des vollständigen Mediums in die Zellsuspension gemischt, um das Trypsin zu hemmen, indem 10 Mal auf und ab pipettiert wurde, wie gerade gezeigt. Schleudern Sie dann die dissoziierten Astrozyten herunter.

Entfernen Sie vorsichtig die Schlinge mit einer Ein-Milliliter-Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in vier Millilitern bei 37 Grad Celsius. Komplette Medien. Übertragen Sie dann die Astrozytensuspension in einen T 75-Gewebekulturkolben mit Schraubverschluss und halten Sie die kortikalen Astrozyten etwa 16 Stunden nach der Entnahme bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie den Kolben mit vier Millilitern 37 Grad Celsius HBSS. Fügen Sie dann vier Milliliter des kompletten Mediums hinzu und halten Sie die kortikalen Astrozyten bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Wenn die Kultur etwa 95 % Konfluenz erreicht, schütteln Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Entfernen Sie dann das Medium, das die abgelösten Zellen enthält, und waschen Sie die Platte mit vier weiteren Millilitern 37 Grad Celsius HBSS. Fügen Sie dann vier Milliliter frisches vollständiges Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden nach der Anreicherung der Kultur für kortikale Astrozyten erneut. Aktualisieren Sie die Kultur mit zwei Millilitern des vollständigen Mediums.

Dann inkubieren Sie die Zellen mit einem Milliliter eines vollständigen Mediums, das einen Mikroliter mindestens eines mal 10. pfu pro Milliliter des interessierenden Adenovirus bei 32 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid bei fünf enthält. Eine Gfab CRE-Infektion führt zu einem proliferativen Vorteil bei rekombinierten Gfab-Astrozyten, der die Reinheit der Astrozyten nach fünf bis neun Passagen in Kultur von 59 % auf mehr als 90 % erhöht. Entfernen Sie nach sechs Stunden das virushaltige Medium und inkubieren Sie die Kultur erneut in frischen, vollständigen Medien.

Nachdem die kortikalen Astrozyten bei etwa 90% Konfluenz geerntet und die entsprechende Zellzahl in eiskalter 5%iger Methylcellulose resuspendiert werden. Legen Sie eine 250-Mikroliter-Glasspritze in einen Wiederholungs-Antigenspender und befestigen Sie dann eine stumpfe 18-Gauge-Nadel an der Spritze. Verwenden Sie die 18-Gauge-Nadel, um die kortikalen Astrozyten in die Spritze zu aspirieren und alle Luftblasen zu entfernen.

Entsorgen Sie dann die 18-Gauge-Nadel und setzen Sie eine 27-Gauge-Nadel auf die Spritze ein. Drücken Sie den Knopf am Antigenspender, bis Flüssigkeit aus der neuen Nadel ausgestoßen wird, um die Astrozyten zu implantieren. Als nächstes befestigen Sie ein drei bis sechs Monate altes immunkompetentes Empfängertier in einem stereotaktischen Rahmen und machen einen Schnitt über die etwa 0,5 Zentimeter lange sagittale Naht zwischen den Ohren und Augen.

Lokalisieren Sie den Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähte oder des BRE MA sowie den Schnittpunkt des Lambdoides in sagittalen Nähten oder dem Lambda. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich BMA und Lambda in derselben horizontalen Ebene befinden, befestigen Sie die Spritze und den Wiederholungsantigenspender an dem stereotaktischen Rahmen über dem Kopf des Tieres und bringen Sie die Spitze der Nadel in Kontakt mit dem bgma. Heben Sie die Nadel leicht von der Schädeloberfläche ab und bewegen Sie sie zwei Millimeter lateral und einen Millimeter rostral vom bgma weg.

Senke dann die Nadel vorsichtig durch den Schädel bis zu ihrem Ziel. Vier Millimeter ventral vom breg MA entfernt und aktivieren Sie den sich wiederholenden Antigen-Dispenser. Einmalig, um fünf Mikroliter der Zellsuspension zu injizieren.

Lassen Sie die Nadel zwei Minuten lang an Ort und Stelle, damit sich der Hirndruck ausgleichen kann, und ziehen Sie die Nadel dann langsam über einen Zeitraum von 30 Sekunden mit einem Wattestäbchen zurück, um Druck auf eventuell auftretende Blutungen auszuüben. Verwenden Sie zum Schluss Gewebekleber, um die Wundränder zu approximieren und den Schnitt zu schließen, und setzen Sie das Tier dann in einen sauberen, warmen Käfig, damit es sich erholen kann. Xenotransplantate etablierter humaner Zelllinien benötigen immundefiziente Wirte und dürfen die Histopathologie von humanen Astrozytomen in der Regel nicht rekapitulieren.

So bilden z.B. orthotope Xenotransplantate vom Typ U 87 MG umschriebene Tumore, die nicht in ein normales Gehirn eindringen. Im Gegensatz dazu führt die Injektion von T RRP Null-Astrozyten in die Gehirne immunkompetenter syngener Mäuse zu Tumoren, die die histologischen Merkmale ihrer menschlichen Gegenstücke rekapitulieren, insbesondere die Invasion von normalem Hirngewebe. Um das Wachstum des TRP-Null-Allotransplantats zu überwachen, wurden die Mäuse alle fünf Tage nach der Zellinjektion getötet und die Tumorlast durch Quantifizierung der Tumorfläche auf h- und e-gefärbten Hirnschnitten bestimmt.

Es wurde festgestellt, dass die Tumorfläche im Laufe der Zeit exponentiell zunimmt, und die orthotope Injektion von einmal 10 bis einem Fünftel der TP nll-Astrozyten in das Empfängergehirn führte zu neurologischer Morbidität. Mit einer medianen Überlebenszeit von 22 Tagen. Die longitudinale Bildgebung in vivo wurde verwendet, um die Kinetik des Tumorwachstums zu definieren.

Daher wurden in diesem Experiment TR-Penal-Astrozyten, die zur Expression von Luciferase entwickelt wurden, in die Gehirne von immunkompetenten Syngenen injiziert. Die Wurfgeschwister und das Tumorwachstum wurden durch serielle Biolumineszenz-Bildgebung bestimmt. Über einen Zeitraum von 16 Tagen wurde eine 15-fache Zunahme der Biolumineszenz beobachtet.

Im Anschluss an dieses Verfahren können Wirkstofftests in vitro und in vivo durchgeführt werden, um die Wirksamkeit zu bestimmen und neuartige Wirkstoffkombinationen zu testen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man kortikale Astrozyten von nicht krea-exprimierenden bedingt gentechnisch veränderten Mäusen gewinnt, wie man genetische Rekombination in vitro induziert und wie man die Tumorgenese mit orthotopen Allotransplantaten in immunkompetenten Mäusen modelliert.