Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, angereicherte Populationen von Herzklappen- und Endothelzellen aus Embryonen und adulten Mäusen mit einem endothelialen Reporter zu isolieren. Dies wird zunächst durch eine sorgfältige Dissektion des atrialen Ventrikelkanals erreicht, der alle Mitral-, Trikuspidal-, Aorten- und Pulmonalklappensegel enthält. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Klappengewebe zu dissoziieren und einzelne Zellen freizusetzen, indem das Gewebe einer Reihe von enzymatischen Behandlungen unterzogen wird.

Dieser Vorgang wird neunmal wiederholt. Dann wird die Lösung, die Zellen und Trümmer enthält, durch einen Filter geleitet, um eine Einzelzellsuspension ohne Zelltrümmer zu gewährleisten. Der letzte Schritt besteht darin, die dissoziierten Zellen mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung zu sortieren und zu sammeln.

Letztendlich wird eine ausreichend große Population von angereicherten Klappenendothelzellen für die in vitro Kultivierung und molekulare Analyse zur Verfügung gestellt. In diesem Ansatz zeigen wir, wie man Herzklappen-Endothelzellen aus Mäusen isolieren kann. Als biomolekulare Werkzeuge sind im Mausmodell gut etabliert.

Dies ermöglicht eine erweiterte Anzahl von Versuchsdesigns, die für die Herzklappenforschung verwendet werden können. Darüber hinaus ermöglicht die Isolierung von Herzklappen-Endothelzellen in Embryonen die Durchführung bisher nicht durchführbarer Entwicklungsstudien. Fangen wir an.

Achten Sie darauf, die chirurgischen Instrumente vollständig zu sterilisieren, indem Sie sie auf einem Instrumententablett autoklavieren. Die Operationsstelle sollte desinfiziert werden, indem sie mit 70% Ethanol besprüht wird. Dazu gehören das Mikroskop und alle anderen potenziell in Kontakt gekommenen Geräte am Standort.

Die folgenden Lösungen müssen alle unmittelbar vor dem Versuch hergestellt werden. Dissoziationspuffer, Sortierpuffer und bei Kultivierung VEC-Kultur, Medien und GFP-Negativkulturmedien. Jede dieser Lösungen muss mit einem 0,2-Mikron-Filter sterilisiert werden, wonach die Lösungen auf Eis gehalten werden müssen, bis sie nach Kohlendioxid verwendet werden.

Erstickung der Maus, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Brusthöhle zu öffnen. Die Mäuse hier sind homozygot für die Bindung von zwei GFP oder sind altersangepasste Negativkontrollen, die für die Sortierung von Fakten erforderlich sind.

Legen Sie als Nächstes das Herz und die Lunge frei. Fassen Sie dann das Herz mit einer Zange an die großen Arterien und ziehen Sie es vom Körper weg. Tauchen Sie das Herz teilweise ein.

Bereiten Sie in einer Schale mit kaltem HBSS in der Schale das Herz für die Dissektion vor, indem Sie das anhaftende Lungengewebe entfernen, es ist wichtig, nicht-valvuläre Endothelzellen zu entfernen, die die Probe kontaminieren könnten. Um zuerst einen atrialen Ventrikelkanalring zu erhalten, entfernen Sie die Vorhöfe, indem Sie sie vorsichtig vom Herzen wegziehen. Schneiden Sie anschließend mit einer Rasierklinge die Ventrikel ab, wobei Sie den Schnitt direkt unter den AV-Klappen machen, die Aortenregionen sollten intakt bleiben.

Machen Sie als Nächstes einen Schnitt an einer Seite des Kanals, um den Ring zu öffnen und die Strukturen der Vorhof-Ventrikelklappe mit einer Pinzette freizulegen. Tochere das Myokard vorsichtig weg, um die Klappensegel freizulegen. Sie sind dichtes weißes Gewebe über dem Myokard.

Lösen Sie nun vorsichtig den Cordi tendai von den atrialen Ventrikelklappen, falls er noch befestigt ist. Und entfernen Sie dabei die proximalen Regionen der Lungenarterie und der Aortenwände, die die halbmondförmigen Klappenstrukturen nicht enthalten. Entfernen Sie so viel wie möglich vom verbleibenden Myokard, ohne die Klappensegel zu beschädigen, da sich das ECS lösen kann.

Eine sorgfältige Sektion ist entscheidend, um nicht-valvuläre Endothelzellen zu eliminieren, die die Probe kontaminieren könnten. Versuchen Sie also, so viel wie möglich von dem umliegenden Gewebe zu entfernen, während alle vier Klappen intakt bleiben. Zum Schluss geben Sie die abgeschnittenen Herzklappenregionen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter kaltem HBSS und halten das Röhrchen auf Eis.

Mit dieser Technik wird isoliertes Klappengewebe von adulten oder E 14,5-Tieren mit einer Pipette präpariert. Entfernen Sie das HBSS mit dem Tuch aus dem Röhrchen. Fügen Sie dann wieder einen Milliliter Dissoziationspuffer und vier Mikroliter DNAS eins hinzu.

Inkubieren Sie das Gewebe im Dissoziationspuffer und DN mit sanften Rotationen bei 37 Grad Celsius für sieben Minuten. Pipettieren Sie das Gewebe nach sieben Minuten dreimal auf und ab, um die Dissoziation der Zellen zu unterstützen. Nachdem Sie sich etwa 15 Sekunden lang abgesetzt haben, sammeln Sie den Überstand mit den dissoziierten Zellen.

Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Beenden Sie die Kollagenasereaktion im 15 Milliliter konischen mit einer Zugabe von Pferdeserum. Dies ist die erste Sammelfraktion.

Kehren Sie nun in die Röhre des abgesetzten Gewebes zurück und fügen Sie den Dissoziationspuffer und den DNAS-Puffer wieder hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang, um eine zweite Fraktion zu sammeln. Wiederholen Sie den Vorgang, bis insgesamt neun Zellsuspensionen gesammelt sind.

Führen Sie nun alle fraktionierten Sammlungen durch einen 70-Mikron-Nylonfilter in ein einzelnes Röhrchen, um eine schmutzfreie Suspension der Zellen zu ermöglichen. Sammeln Sie die Zellen zu einem Pellet, indem Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 400 GS nach unten drehen. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einen Milliliter Sortierpuffer und halten Sie es auf Eis, bis es per Fax analysiert werden kann, was im Text behandelt wird.

Protokoll Zellkultur und Färbung werden auch durch den Text Protokoll Gewebeschnitte aus zwei GFP-transgenen Verbindungen behandelt. Die Mäuse wurden von adulten Embryonen und E 14,5 Embryonen bei adulten Embryonen entnommen. Die Endothelzellen der Klappe wurden mit dem Endothelmarker CD 31 identifiziert und es wurde festgestellt, dass sie Coex-Expression von GFP aufweisen.

Die gleichen Zellen, die aus E 14,5-Embryonen isoliert wurden. Auch die co-exprimierte CD 31- und GFP-Faxanalyse identifizierte GFP-positive und -negative Zellpopulationen aus Zellen, die aus adulten und E 14,5-Embryonen hergestellt wurden. Wildtyp C 57 schwarz sechs.

Adulte Zellen wurden verwendet, um die GFP-Parameter zu bestimmen, die Genexpression in den GFP-positiven und GFP-negativen Zellpopulationen wurden durch quantitative PCR in den GFP-positiven Zellen verglichen. Die Endothelmarker waren hoch und die Myozytenmarker sehr niedrig. In GFP-negativen Zellen.

Die interstitiellen Zellmarker der Klappe waren hoch. Die beiden Zellpopulationen wurden nach zwei Wochen getrennt kultiviert. Die GFP-positiven Zellen nahmen die Morphologie an und exprimierten CD 31.

Im Gegensatz dazu nahmen die GFP-negativen Zellen nach neun Tagen eine mesenchymale Morphologie an. Diese Zellen exprimierten auch den VIC-Marker alpha SMA Nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Herzklappenbiologie den Weg, um Entwicklungs- und Krankheitsmechanismen in Mausmodellen zu erforschen, die dann auf die menschliche Bevölkerung übertragen werden können.