Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Bakterienpellet aus einer positiven Blutkultur herzustellen, das als Probe für verschiedene Anwendungen verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem nach der Zentrifugation zunächst eine positive Blutkultur mit sterilem Wasser gemischt wird. Das Pellet wird in Ammoniumchlorid resuspendiert, um die roten Blutkörperchen nach einer zweiten Zentrifugationsrunde zu läusieren.

Das Pellet wird wieder in Wasser suspendiert. Der letzte Schritt besteht darin, das erhaltene Pellet zur bakteriellen Identifizierung durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisation, Flugzeit, Grammfärbung, Antibiotika-Empfindlichkeitstests und/oder PCR-basierte Tests zu verwenden. Letztendlich können die erzielten Ergebnisse schnell an Ärzte weitergegeben werden, um das Ergebnis von Patienten mit Blutbahninfektionen zu verbessern.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der bakteriellen Subkultur positiver Blutkulturen, besteht darin, die bakterielle Identifizierung um etwa sechs bis 24 Stunden zu reduzieren und die Zeit bis zu den Ergebnissen der Antibiotikaresistenz um etwa 24 Stunden zu verkürzen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Antibiotikabehandlung schnell anzupassen und das Outcome von Patienten mit Blutbahninfektionen zu verbessern. Obwohl diese Methode auf routinemäßige Identifizierungsmethoden wie OV und auf konventionelle antimikrobielle Nachhaltigkeitstestansätze angewendet werden kann, kann sie auch auf neue Technologien angewendet werden, die auf die Verifizierung von VUL-Faktoren und/oder resistenten Mechanismen abzielen, wie z. B. ESBL- und Carbapenemase-Aktivitäten.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da das bakterielle PAL-Präparat entscheidend ist, um genügend mikrobielles Material für nachgelagerte Anwendungen zu erhalten. Das Verfahren wird von Christian Durel, Maria Cortesi, Maria ti und Kim Giza demonstriert, die alle Labortechniker aus meinem Labor sind. Um eine positive Blutkultur für die anschließende Zentrifugation vorzubereiten. Sterilisieren Sie den Blutkulturdeckel, indem Sie 70% Ethanol auf den Deckel der Flasche geben und verbrennen. Bewegen Sie dann die Flasche zu einer Laminar-Flow-Haube.

Sammeln Sie fünf Milliliter der Blutkultur mit einer 20-Gauge-Nadelspritze. Geben Sie anschließend die fünf Milliliter Blutkultur in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 45 Millilitern sterilem Wasser und mischen Sie die Probe. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1000 g.

Bei Raumtemperatur den Überstand mit einer Laborvakuumpumpe entfernen. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter hausgemachtem Ammoniumchlorid. Lysing-Lösung.

Zerkleinern Sie das Pellet durch Schaben und Vortexen, bevor Sie die Probe 10 Minuten lang bei 140 g zentriffusionieren. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren bei Raumtemperatur den Überstand, der hauptsächlich Ablagerungen roter Blutkörperchen enthält. Wenn das Pellet hämorrhagisches Resus geblieben ist, suspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern sterilem und destilliertem Wasser, um die verbleibenden roten Blutkörperchen weiter zu läusieren und das Pellet nach dem Zentrifugieren der Probe wie zuvor zu waschen, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Wasser und wirbeln Sie das Röhrchen zur direkten Identifizierung vom Blutpellet vortexen. Füllen Sie zunächst einen Mikroliter des Pellets auf eine MALDI-Zielplatte und lassen Sie es auf einer 42 Grad Celsius heißen Heizplattform trocknen.

Überlagern Sie die Probe mit einem Mikroliter 70%iger Ameisensäure und lassen Sie sie auf der Heizplattform trocknen. Überlagern Sie die Probe anschließend mit einem Mikroliter Maldi Matrixx und lassen Sie sie erneut auf der Heizplattform trocknen. Fahren Sie mit der maldi TOF MS-Analyse mit einem MALDI TOF MS-System fort, wie von den Herstellern beschrieben.

Wenn der Identifizierungswert auf Speziesebene ungültig ist, führen Sie eine Proteinextraktion der Blutpellet-Probe durch, indem Sie zuerst 20 Mikroliter des Pellets mit einem Milliliter 70 % Ethanol mischen. Dann zentrifugieren Sie die Probe zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.000 g, verwerfen den Überstand und geben Sie 25 Mikroliter 70 % Ameisensäure und 25 Mikroliter 100 % Acetonitril kräftig in den Pelletwirbel, um das Pellet nach einer Zentrifugation bei 13.000 g für zwei Minuten wieder zu suspendieren. Bei Raumtemperatur einen Mikroliter des Überstands auf eine MALDI-Zielplatte geben und auf einer 42 Grad Celsius warmen Heizplattform trocknen lassen.

Um die Identifizierung von Bakterien und die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung oder einen ST-Test durchzuführen, bereiten Sie ein Kunststoffröhrchen mit drei Millilitern steriler 0,45%iger Natriumchloridlösung vor, die mit dem automatisierten mikrobiellen System kompatibel ist. Geben Sie ein ausreichendes Volumen des Blutkulturpellets zu der Lösung und dem Wirbel, um eine Bakteriensuspension zu erhalten, die einer McFarland-Trübung von 0,6 bis 0,8 entspricht, gemessen mit einem Densitometergerät. Beimpfen Sie anschließend die automatisierten grampositiven oder grammnegativen Karten zur Identifizierung.

Impfen Sie auch die automatisierten a ST-Karten für die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von grampositiven Kokken und gramnegativen Bakterien, wie vom Hersteller beschrieben. Zur Durchführung von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests durch Disc-Diffusionsassays. Bereiten Sie zunächst ein Glasröhrchen mit drei Millilitern steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung vor.

Geben Sie dann ein ausreichendes Volumen des Blutkulturpellets in die Lösung, um eine Bakteriensuspension zu erhalten, die einer McFarland-Trübung von 0,5 entspricht, gemessen mit einem Densitometergerät. Wirbeln Sie die Bakteriensuspension vor, um die Bakteriensuspension zu impfen. Tauchen Sie zunächst ein steriles Wattestäbchen in die Bakteriensuspension und entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit, indem Sie den Tupfer an der Innenwand des Glasrohrs drehen.

Verteilen Sie dann die Bakteriensuspension gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche von Mueller. Hinweis und Schnecke oder Müller Hinweis und Schnecke für anspruchsvolle Organismen durch Abstrich in drei Richtungen oder durch Verwendung eines automatisierten Plattenrotators zum Aufbringen von antimikrobiellen Scheiben auf inokulierte Schneckenplatten. Zuerst werden die Scheiben manuell oder mit Hilfe eines Suszeptibilitätsscheibenspenders dicht auf die Oberfläche der getrockneten inokulierten Schneckenplatten aufgebracht.

Inkubieren Sie dann die Platte bei der entsprechenden Temperatur und Atmosphäre, wie in der Disk-Diffusionsmethode des Europäischen Komitees für antimikrobielle Empfindlichkeitstests beschrieben, um den automatisierten PCR-basierten Diagnosetest durchzuführen. Verwenden Sie zunächst eine Mikropipette, um 50 Mikroliter des Blutkulturpellets in das Probenreagenzfläschchen zu übertragen, das mit dem automatisierten PCR-basierten Diagnosekit MSA geliefert wurde. Drehen Sie dann das Fläschchen 20 Sekunden lang mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette.

Geben Sie die Probe in den Probenanschluss der Kartusche. Setzen Sie die Kartusche in das automatisierte PCR-System ein und starten Sie den Assay wie vom Hersteller beschrieben im Labor von Lausanne. Das Ergebnis wird dank der Konnektivität des verwendeten automatisierten PCR-Systems mit einem Laborschnittstellensystem (LIS) direkt validiert und an die Ärzte übermittelt.

Wenn ein Ergebnis ungültig ist, empfehlen wir, den Assay nach zehnfacher Verdünnung des Bakterienpellets zu wiederholen. Da dies häufig auf PCR-Inhibitoren zurückzuführen ist, ergab die Ammoniumchlorid-Hämolyse ein sehr hochwertiges Blutkulturpellet mit wenig Erythrozytentrümmern im Vergleich zur Negativkontrolle ohne Ammoniumchlorid. Die Gramfärbung einer positiven Blutkultur von Escher Coli Koagulase, negativen Staphylokokken capita und Streptokokken-Scheibe AE wurde vor und nach der Vorbereitung der Blutkultur durchgeführt.

Die bakterielle Pelletvorbereitung des Pellets mit diesem Ansatz ermöglicht es, den Mikroorganismus um das 100- bis 1000-fache zu konzentrieren. Insgesamt gibt es mehrere Downstream-Anwendungen, die ausgehend vom Blutkulturpellet durchgeführt werden können, die alle von einer kürzeren Zeit bis zum Ergebnis ohne verringerte Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Assays an isolierten Kolonien profitieren. Sobald die Pastete gemeistert ist, kann die Zubereitung in etwa 30 Minuten erledigt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blutkulturen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten mit Handschuhen und einer Haube getroffen werden sollten.