Name: Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Lernen Sie die Präparation eines Bakterienpellets aus positiven Blutkulturen für MALDI-TOF, Gram-Färbung und Antibiotika-Sensitivitätstests. Diese Methode verkürzt die Zeit bis zur Diagnose und verbessert die Patientenversorgung bei Blutstrominfektionen erheblich.

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Wir danken den Technikern der Bakteriologie-Labor der Universitätsklinik von Lausanne für ihre Hilfe, die Techniken im Labor umzusetzen.

Dieses Protokoll wurde entwickelt und validiert nach den Forschung und Entwicklungsprozesse und ethische Regeln unserer Einrichtung, bevor er als Routinewerkzeug implementiert. 1. Herstellung einer Blutkulturbakterienpellet durch Ammoniumchlorid Erythrozyten-Lyseverfahren <ol><li> Vorbereitung einer positiven Blutkultur für nachfolgende Zentrifugation. <ol><li> Sterilisieren Blutkultur Kappe. Fügen Sie 70% Ethanol auf die Kappe der Flasche und zu brennen. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unter einer Steril ausführen nicht. </li><li> Bewegen Sie die Flasche an einer Steril. Sammeln von 5 ml der Blutkultur mit einer 20 G Spritze. </li><li> Fügen Sie die 5 ml Blutkultur in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 45 ml sterilem Wasser (H 2 O) und die Probe zu mischen. </li></ol></li><li> Herstellung einer Blutkultur Bakterienpellet durch Zentrifugation Lyse. <ol><li> Zentrifugieren der Probe bei 1.000 xg für 10 min bei RT. </li><li> Remove Überstand mit einer Labor-Vakuumpumpe (die hauptsächlich H 2 O und Blutzellen enthält). </li><li> Das Pellet in 1 ml hausgemachte Ammoniumchlorid Lyse-Lösung (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3). Brechen die Pellets durch Kratzen und durch Vortexen das Rohr und Zentrifugieren der Probe bei 140 g für 10 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen, die hauptsächlich rote Blutkörperchen Schutt. <ol><li> Wenn die Pellets blieben hämorrhagischen, das Pellet in 2 ml sterilem destilliertem H 2 0 weiter lysieren restliche rote Blutzellen und das Pellet zu waschen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 140 g für 10 min bei RT und den Überstand verwerfen. </li></ol></li><li> Resuspendieren des Pellets in 200 ul H 2 O </li></ol></li><li> Subkultur der Blutkultur auf verschiedenen selektiven und nicht-selektiven Agar-Medien. <ol><li> Sammeln von 1 ml der Blutkultur mit einer 20 G Spritze. </li><li> Impfen 1 Tropfen Blutkultur into vier Quadranten auf Blut-Agar, Schokolade-Agar, McConkey Agar-Agar und Schaedler. </li><li> Bei 37 ° C wird die Blut-Agar-und Schokoladen-Agar-Platten in einer 5% CO 2 Atmosphäre, McConkey Agar in einer Normalatmosphäre und die Scha Agarplatte in anaeroben Bedingungen. </li><li> Folgen bakterielle Wachstum auf verschiedenen Medien. </li><li> Überprüfen Sie für bakterielle Reinheit. </li></ol></li></ol> 2. Identifizierung durch MALDI-TOF-MS <ol><li> Direkte Identifizierung aus dem Blut Pellets. <ol><li> Transfer 1 ul Blut Pellet auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. </li><li> Überlagern die Probe mit 1 ul 70% iger Ameisensäure und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. </li><li> Überlagern die Probe mit 1 ul MALDI-Matrix (gesättigte Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Säure in 50% Acetonitril-2.5% Trifluoressigsäure) und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. </li><li> Fahren Sie mit MALDI-TOF-MS-Analyse mit einem MALDI-TOF-MS-System, wie durch den Hersteller beschrieben. </li><li> Wenn die Identifikations Punktzahl ist ungültig auf Artenebene (zum Beispiel mit einem Score &lt;2), führen Sie eine Proteinextraktion des Blutes Pelletprobe. </li></ol></li><li> Identifikation nach Proteinextraktion aus der Blutkultur Pellets. <ol><li> Mix 20 ul Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifugation bei 13.000 × g für 2 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 25 ul von 70% Ameisensäure und 25 ul 100% Acetonitril zum Pellet. Vortex kräftig, um die Pellets zu suspendieren. Resuspendieren harten Pellets, indem Sie sie mit Pipettenspitzen vor Verwirbelung. </li><li> Zentrifugieren bei 13.000 × g für 2 min bei RT. Übertragung 1 ul der Überstand (die extrahierten Proteine ​​enthalten) auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. Gehen Sie wie in 2.1.2 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Bakterielle Identification und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung mit einem automatisierten System-Mikrobielle <ol><li> Herstellung einer Bakteriensuspension zur Identifizierung von Bakterien und AST mit einem automatisierten mikrobiellen Systems. <ol><li> Vorbereiten einer Kunststoffröhrchen, das 3 ml steriler 0,45% iger NaCl-Lösung mit dem automatisierten mikrobielle System kompatibel. </li><li> Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Blutkulturpellet in 0,45% NaCl-Lösung, um eine Bakteriensuspension, entsprechend einer McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erhalten. Messen Sie die Trübung mit einem Densitometer Maschine. HINWEIS: Das Volumen des Blutkulturbakterienpellet variiert von 50 bis 200 ul, um ein McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erreichen. </li></ol></li><li> Impfen die automatisierten Gram-positive (GP) oder Gram-negative (GN) Karten für die Identifikation und die automatisierten AST-Karten für antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Gram-positive Kokken und Gram-negative Bakterien, wie vom Hersteller beschrieben. HINWEIS: identifizierun mit GP oder GN-Karten wird nicht angewendet, wenn MALDI-TOF-MS-Identifizierung Score-Wert&gt; 2. Überprüfen Sie die Reinheit der Bakteriensuspension durch Subkultivierung der Bakteriensuspension auf Blutagar (GP und GN) und MacConkey-Agar (GN) Platten. </li></ol> 4. Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung von Festplattendiffusionstest Die Scheibe Diffusionstest wird von der Europäischen Ausschusses für antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung (EUCAST, Version 3.0, im April 2013 www.eucast.org) beschrieben. <ol><li> Herstellung einer Bakteriensuspension antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von Plattendiffusionstest durchzuführen. <ol><li> Vorbereiten einer Glasröhrchen mit 3 ml steriler 0,9% NaCl-Lösung. </li><li> Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Blutkulturpellet in 0,9% NaCl-Lösung, um eine Bakteriensuspension, entsprechend einer McFarland Trübungs von 0,5 zu erhalten. Messen Sie die Trübung mit einem Densitometer Maschine. HINWEIS: Das Volumen der BlutkulturBakterienpellet variiert von 50 bis 200 ul, um ein McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erreichen. </li><li> Mischen Sie den Bakteriensuspension. </li></ol></li><li> Inokulation von Bakteriensuspension auf Mueller-Hinton-Agar (MH) oder Mueller-Hinton-Agar-Agar anspruchsvolle Organismen (MHF) (MH, ergänzt mit 5% defibriniertes Pferdeblut und 20 mg / l β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid). <ol><li> Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in der Bakteriensuspension und entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit durch Drehen Sie den Tupfer an der Innenwand der Glasröhre. </li><li> Verbreiten Sie die Bakteriensuspension gleichmäßig auf die gesamte Oberfläche des MH / MHF-Agar-Platte durch Tupfen in drei Richtungen oder durch Verwendung eines automatischen Plattendreher. </li></ol></li><li> Anwendung von antimikrobiellen Festplatten auf Agar-Platten angeimpft. <ol><li> Gelten genau die Scheiben auf der Oberfläche der getrockneten geimpft Agar-Platten manuell oder mit Hilfe eines Platten Anfälligkeit Spender. </li><li> Die Platte auf der entsprechenden Tempetur und die Atmosphäre wie in der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung EUCAST Plattendiffusionsmethode beschrieben (Version 3.0, im April 2013 www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5. Automatische PCR-basierten diagnostischen Test zum Nachweis von MRSA <ol><li> Mit einer Mikropipette, Transfer 50 ul der Blutkultur Pellet in die Probenflasche mit dem Reagenz MRSA automatisierte PCR-basierten diagnostischen Test-Kit und Wirbel während 20 Sekunden zur Verfügung gestellt. </li><li> Verwendung einer 1 ml-Mikropipette zu verzichten, die Probe in die Probenöffnung der Patrone. Setzen Sie die Patrone in den automatisierten PCR-System und starten Sie den Test, wie vom Hersteller beschrieben. </li></ol>

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<li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+emergency+medicine%22%5BJournal%5D)">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li>
<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Im Vergleich zu herkömmlichen positiven Blutkultur diagnostische Ansätze, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet mit Hilfe der Ammoniumchlorid-Lyse Zentrifugation Ansatz reduzieren die Zeit, um die Identifizierung von 16 bis 24 h und die Zeit bis AST von 24 bis 48 Stunden zu melden (Abbildungen 1 und berichten 3). Rasche Einführung von geeigneten Antibiotika-Therapie ist entscheidend, um das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu verb...

Bakteriämien und Sepsis bei hospitalisierten Patienten sind eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität. So ist die Sterblichkeit im Zusammenhang mit Infektionen Blutbahn in etwa 14% bis 37% der stationären Patienten beobachtet und kann auf 35% auf Intensivstationen Patienten 1-3 erhöhen. Die schnelle Identifizierung des Erregers ist entscheidend zu führen optimale antimikrobielle Behandlung und den erfolgreichen Abschluss der antimikrobiellen Therapie 4,5 zu erhöhen. Die schnelle Analyse von Gram Flecken aus positiver Blutkultur hat bereits einen erheblichen Einfluss auf die Anpassung der antimikrobiellen Therapie 6,7, aber eine genaue Identifizierung des Erregers erforderlich, um die am besten geeigneten Antibiotika-Behandlung für die Patienten zu schaffen. Zum Beispiel haben unterschiedliche Antibiotika-Behandlung nicht ausreichend, um folgende Bakteriämie mit Enterokokken und Streptokokken, die nur schwer durch Gram-Färbung unterscheiden, sind umgesetzt werden. Ebenso Identifikation an der Art Level ist erforderlich, um Gram-negative Enterobakterien erkennen eine chromosomale ampC Gen, das eine erhöhte Resistenz gegenüber 8-Lactamen β kodiert. Mit einer positiven Blutkultur ist die herkömmliche diagnostische Ansatz, um die Infektionserreger auf verschiedenen Agar-Platten, die mehrere Stunden zusätzliche Inkubation vor der Identifikation mit verschiedenen Ansätzen, einschließlich biochemische Tests, Wachstum auf verschiedenen Selektionsmedien und automatische Identifikationssysteme erfordert mikrobiellen Subkultur. Die Zeit, um Ergebnisse einer herkömmlichen diagnostischen Ansatz von etwa 1 bis 3 Tagen. Die Entstehung der Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF)-Technologie für die schnelle Identifizierung von Mikroorganismen wurde ein neues Werkzeug schnell Mikroorganismen von Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet, sondern auch direkt von der positiven Identifizierung Blut bereitgestellt Kulturen (Abbildung 1) 9-12. The Verwendung von MALDI-TOF, um einen infektiösen Erreger aus Blutkulturen zu identifizieren deutlich die Zeit, um Ergebnisse zu ein paar Minuten anstelle von den Stunden und Tagen nach traditionellen Verfahren erforderlich ist, reduziert. Wie von Croxatto et al. Diskutiert 13 stützt sich die Effizienz der MALDI-TOF-Identifizierung von verschiedenen Parametern wie Reinheit und Menge des Mikroorganismus. Diese beiden Kriterien sind leicht von diskreten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden, aber benötigt eine vorge analytischen Behandlung für bakterielle Anreicherung und Reinigung von komplexen Proben wie Blutkultur, die mehrere zelluläre und Protein-Komponenten, die mit MALDI-TOF-Identifikations stören kann enthalten. Verschiedene Mikroorganismen Isolierungsverfahren aus Blutkulturen wurden in einer Reihe von Studien einschließlich Saponin oder andere milde Detergentien Verfahren zur Extraktion bakterieller 9,14, Serumtrennverfahren 10 verwendet Lyse Zentrifugationsverfahren 12 </sauf&gt; und kommerziell Lösungen wie das sepsityper-Kit. Unsere Bakteriologie Diagnoselabor hat einen einfachen Blutkultur Bakterienpellet Zubereitung auf Basis von Ammoniumchlorid-Lyse Erythrozyten, die eine schnelle Identifizierung von Bakterien und Hefe durch MALDI-TOF-und automatisierte Identifikationssysteme (Abbildung 2) 15 erlauben entwickelt. Dieses Blutkultur Pelletzubereitung stellen auch eine Probe für andere direkte nachgeschalteten Anwendungen wie Gram-Färbung, automatisierte PCR-basierten diagnostischen Tests wie POCT-PCRs zum schnellen Nachweis von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und antibiotische Resistenzprüfung mit automatisierte AST-Systeme und / oder Plattendiffusionstests auf Agarplatten (Abbildung 3). In dieser Arbeit wurden die verschiedenen Schritte zur Herstellung des Blutkulturbakterienpellet beschreiben wir, wie durch Prod&#39;hom et al erläutert. 15 (Figur 4). Wir werden auch DESchreiber die Protokolle für drei der wichtigsten Anwendungen, die auf die Blutkultur Pellet durchgeführt werden können: Identifizierung mittels MALDI-TOF-15, Identifikation (ID) und Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (AST) mit den automatisierten Systemen 16 für Enterobacteriaceae und Staphylokokken und automatisierte PCR- basierten diagnostischen Test zum Nachweis von MRSA 17.

<table><tbody><tr><td>20 G Nadel</td><td>Terumo, Leuven, Belgien</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tube</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352070</td><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorur</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydrogencarbonat</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>F0507</td><td>Entzündlich, ätzend</td></tr><tr><td>&#945;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>70990</td><td>Akute Toxizität</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>271004</td><td>Entzündliche, akute Toxizität</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>T6508</td><td>Ätzend, akute Toxizität</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 Instrument</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>27202</td><td>Automatisiertes mikrobielles Systeminstrument</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-positive (GP) Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>21342</td><td>automatisierter GP&nbsp; Ausweis</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>22233</td><td>automatisiertes mikrobielles AST-System</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gramnegative (GN) Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>21341</td><td>automatisierter GN&nbsp; Ausweis</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>413391</td><td>automatisiertes mikrobielles AST-System</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, CA, USA&</td><td>nbsp; GXMRSA-100N-10</td><td>Nukleinsäure-Amplifikationstechnologie MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV Instrument</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td><td>GXIV-4-D</td><td>Nukleinsäure-Amplifikationstechnik Instrument</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS Gerät</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>BDAL Microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 Zielstahl BC</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>280799</td><td>MALDI Zielplatte</td></tr><tr><td>Densitometer Densicheck Instrument</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey Agar</td><td>Biolife, Mailand, Italien</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton-Agar</td><td>Oxoid, Hampshire, England</td><td>CM0337</td><td>Mueller-Hinton-Agar (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>MHF-Agar</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>43901</td><td>Mueller-Hinton-Agar-Agar (MHF)</td></tr><tr><td>BD Columbia III Agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254071</td><td>Blut-Agar</td></tr><tr><td>BD Schokoladen-Agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254089</td><td>Schokoladen-Agar</td></tr><tr><td>BD Schaedler Agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254084</td><td>Schaedler Agar</td></tr></tbody></table>

vorbereitung einer blutkultur pellet rapid identifizierung von bakterien und antibiotika empfindlichkeitsprüfung

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Blutstrominfektionen und Sepsis sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Der Erfolg von Patienten mit Bakteriämie, hängt von einer schnellen Identifizierung des Erregers zu führen optimale Behandlung mit Antibiotika. Die Analyse der Gram Flecken aus positiver Blutkultur kann schnell durchgeführt werden und bereits erhebliche Auswirkungen auf die antibiotische Therapie. Jedoch ist die genaue Identifikation des Erregers erforderlich, um die optimale gezielte Behandlung etablieren. Wir stellen Ihnen hier eine einfache und schnelle Zubereitung von Bakterienpellet einer positiven Blutkultur, die als Probe für mehrere wesentliche Downstream-Anwendungen wie Identifikation durch MALDI-TOF-MS, antibiotische Empfindlichkeitsprüfung (AST) durch Scheibendiffusionstest oder automatisierte AST-Systemen verwendet werden können und durch automatisierte PCR-basierten Diagnosetests. Die Leistung dieser direkt auf die Blutkultur Bakterienpellets angewendet unterschiedliche Identifikationssysteme und AST ist sehr similar auf die Leistung in der Regel aus isolierten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet reduziert die Zeit, um sowohl Identifikation und AST zu melden. So kann nach einer Blutkultur Positivität Identifizierung durch MALDI-TOF in weniger als 1 Stunde in der Erwägung Ergebnisse AST durch automatisierte Systeme AST oder Scheibendiffusionstests innerhalb von 8 bis 18 h, jeweils angegeben werden. Ebenso können die Ergebnisse einer schnellen PCR-basierten Assays, um den Kliniker mitgeteilt weniger als 2 Stunden nach dem Bericht einer Bakteriämie. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die rasche Erstellung eines Blutkultur Bakterienpellet hat einen signifikanten Einfluss auf die Identifizierung und AST Bearbeitungszeit und damit auf das erfolgreiche Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn.

In der Studie von Prod'hom et al. 15 durchgeführt wurden Bakterienpellets durch Ammoniumchlorid-Lyse Zentrifugation von 122 positive Blutkultur von 78 Patienten erhalten durch MALDI-TOF MS analysiert. Von 122 positiven Blutkultur wurden 95 (77,9%) richtig auf Artenebene und eine (0,8%) an der Gattungsebene identifiziert. Die restlichen 26 (21,3%) Blutkultur-Pellets gab keine sichere Identifizierung mittels MALDI-TOF. Unter denen waren 21 gram-positive Bakterien, darunter 13 Streptokokken und 5 Koagul...

Eine schnelle Bakterienpellet Herstellung von einer positiven Blutkultur kann als eine Probe für Anwendungen wie die Identifizierung durch MALDI-TOF, Gram-Färbung, antibiotische Resistenzprüfung und PCR-basierte Tests verwendet werden. Die Ergebnisse können schnell auf Ärzte mitgeteilt, das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu verbessern.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Bakterienpellet aus einer positiven Blutkultur herzustellen, das als Probe für verschiedene Anwendungen verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem nach der Zentrifugation zunächst eine positive Blutkultur mit sterilem Wasser gemischt wird. Das Pellet wird in Ammoniumchlorid resuspendiert, um die roten Blutkörperchen nach einer zweiten Zentrifugationsrunde zu läusieren.Das Pellet wird wieder in Wasser suspendiert. Der letzte Schritt besteht darin, das erhaltene Pellet zur bakteriellen Identifizierung durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisation, Flugzeit, Grammfärbung, Antibiotika-Empfindlichkeitstests und/oder PCR-basierte Tests zu verwenden. Letztendlich können die erzielten Ergebnisse schnell an Ärzte weitergegeben werden, um das Ergebnis von Patienten mit Blutbahninfektionen zu verbessern.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der bakteriellen Subkultur positiver Blutkulturen, besteht darin, die bakterielle Identifizierung um etwa sechs bis 24 Stunden zu reduzieren und die Zeit bis zu den Ergebnissen der Antibiotikaresistenz um etwa 24 Stunden zu verkürzen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Antibiotikabehandlung schnell anzupassen und das Outcome von Patienten mit Blutbahninfektionen zu verbessern. Obwohl diese Methode auf routinemäßige Identifizierungsmethoden wie OV und auf konventionelle antimikrobielle Nachhaltigkeitstestansätze angewendet werden kann, kann sie auch auf neue Technologien angewendet werden, die auf die Verifizierung von VUL-Faktoren und/oder resistenten Mechanismen abzielen, wie z. B. ESBL- und Carbapenemase-Aktivitäten.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da das bakterielle PAL-Präparat entscheidend ist, um genügend mikrobielles Material für nachgelagerte Anwendungen zu erhalten. Das Verfahren wird von Christian Durel, Maria Cortesi, Maria ti und Kim Giza demonstriert, die alle Labortechniker aus meinem Labor sind. Um eine positive Blutkultur für die anschließende Zentrifugation vorzubereiten. Sterilisieren Sie den Blutkulturdeckel, indem Sie 70% Ethanol auf den Deckel der Flasche geben und verbrennen. Bewegen Sie dann die Flasche zu einer Laminar-Flow-Haube.Sammeln Sie fünf Milliliter der Blutkultur mit einer 20-Gauge-Nadelspritze. Geben Sie anschließend die fünf Milliliter Blutkultur in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 45 Millilitern sterilem Wasser und mischen Sie die Probe. Zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1000 g.Bei Raumtemperatur den Überstand mit einer Laborvakuumpumpe entfernen. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter hausgemachtem Ammoniumchlorid. Lysing-Lösung.Zerkleinern Sie das Pellet durch Schaben und Vortexen, bevor Sie die Probe 10 Minuten lang bei 140 g zentriffusionieren. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren bei Raumtemperatur den Überstand, der hauptsächlich Ablagerungen roter Blutkörperchen enthält. Wenn das Pellet hämorrhagisches Resus geblieben ist, suspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern sterilem und destilliertem Wasser, um die verbleibenden roten Blutkörperchen weiter zu läusieren und das Pellet nach dem Zentrifugieren der Probe wie zuvor zu waschen, verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Wasser und wirbeln Sie das Röhrchen zur direkten Identifizierung vom Blutpellet vortexen. Füllen Sie zunächst einen Mikroliter des Pellets auf eine MALDI-Zielplatte und lassen Sie es auf einer 42 Grad Celsius heißen Heizplattform trocknen.Überlagern Sie die Probe mit einem Mikroliter 70%iger Ameisensäure und lassen Sie sie auf der Heizplattform trocknen. Überlagern Sie die Probe anschließend mit einem Mikroliter Maldi Matrixx und lassen Sie sie erneut auf der Heizplattform trocknen. Fahren Sie mit der maldi TOF MS-Analyse mit einem MALDI TOF MS-System fort, wie von den Herstellern beschrieben.Wenn der Identifizierungswert auf Speziesebene ungültig ist, führen Sie eine Proteinextraktion der Blutpellet-Probe durch, indem Sie zuerst 20 Mikroliter des Pellets mit einem Milliliter 70 % Ethanol mischen. Dann zentrifugieren Sie die Probe zwei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.000 g, verwerfen den Überstand und geben Sie 25 Mikroliter 70 % Ameisensäure und 25 Mikroliter 100 % Acetonitril kräftig in den Pelletwirbel, um das Pellet nach einer Zentrifugation bei 13.000 g für zwei Minuten wieder zu suspendieren. Bei Raumtemperatur einen Mikroliter des Überstands auf eine MALDI-Zielplatte geben und auf einer 42 Grad Celsius warmen Heizplattform trocknen lassen.Um die Identifizierung von Bakterien und die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung oder einen ST-Test durchzuführen, bereiten Sie ein Kunststoffröhrchen mit drei Millilitern steriler 0,45%iger Natriumchloridlösung vor, die mit dem automatisierten mikrobiellen System kompatibel ist. Geben Sie ein ausreichendes Volumen des Blutkulturpellets zu der Lösung und dem Wirbel, um eine Bakteriensuspension zu erhalten, die einer McFarland-Trübung von 0,6 bis 0,8 entspricht, gemessen mit einem Densitometergerät. Beimpfen Sie anschließend die automatisierten grampositiven oder grammnegativen Karten zur Identifizierung.Impfen Sie auch die automatisierten a ST-Karten für die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von grampositiven Kokken und gramnegativen Bakterien, wie vom Hersteller beschrieben. Zur Durchführung von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests durch Disc-Diffusionsassays. Bereiten Sie zunächst ein Glasröhrchen mit drei Millilitern steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung vor.Geben Sie dann ein ausreichendes Volumen des Blutkulturpellets in die Lösung, um eine Bakteriensuspension zu erhalten, die einer McFarland-Trübung von 0,5 entspricht, gemessen mit einem Densitometergerät. Wirbeln Sie die Bakteriensuspension vor, um die Bakteriensuspension zu impfen. Tauchen Sie zunächst ein steriles Wattestäbchen in die Bakteriensuspension und entfernen Sie vorsichtig überschüssige Flüssigkeit, indem Sie den Tupfer an der Innenwand des Glasrohrs drehen.Verteilen Sie dann die Bakteriensuspension gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche von Mueller. Hinweis und Schnecke oder Müller Hinweis und Schnecke für anspruchsvolle Organismen durch Abstrich in drei Richtungen oder durch Verwendung eines automatisierten Plattenrotators zum Aufbringen von antimikrobiellen Scheiben auf inokulierte Schneckenplatten. Zuerst werden die Scheiben manuell oder mit Hilfe eines Suszeptibilitätsscheibenspenders dicht auf die Oberfläche der getrockneten inokulierten Schneckenplatten aufgebracht.Inkubieren Sie dann die Platte bei der entsprechenden Temperatur und Atmosphäre, wie in der Disk-Diffusionsmethode des Europäischen Komitees für antimikrobielle Empfindlichkeitstests beschrieben, um den automatisierten PCR-basierten Diagnosetest durchzuführen. Verwenden Sie zunächst eine Mikropipette, um 50 Mikroliter des Blutkulturpellets in das Probenreagenzfläschchen zu übertragen, das mit dem automatisierten PCR-basierten Diagnosekit MSA geliefert wurde. Drehen Sie dann das Fläschchen 20 Sekunden lang mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette.Geben Sie die Probe in den Probenanschluss der Kartusche. Setzen Sie die Kartusche in das automatisierte PCR-System ein und starten Sie den Assay wie vom Hersteller beschrieben im Labor von Lausanne. Das Ergebnis wird dank der Konnektivität des verwendeten automatisierten PCR-Systems mit einem Laborschnittstellensystem (LIS) direkt validiert und an die Ärzte übermittelt.Wenn ein Ergebnis ungültig ist, empfehlen wir, den Assay nach zehnfacher Verdünnung des Bakterienpellets zu wiederholen. Da dies häufig auf PCR-Inhibitoren zurückzuführen ist, ergab die Ammoniumchlorid-Hämolyse ein sehr hochwertiges Blutkulturpellet mit wenig Erythrozytentrümmern im Vergleich zur Negativkontrolle ohne Ammoniumchlorid. Die Gramfärbung einer positiven Blutkultur von Escher Coli Koagulase, negativen Staphylokokken capita und Streptokokken-Scheibe AE wurde vor und nach der Vorbereitung der Blutkultur durchgeführt.Die bakterielle Pelletvorbereitung des Pellets mit diesem Ansatz ermöglicht es, den Mikroorganismus um das 100- bis 1000-fache zu konzentrieren. Insgesamt gibt es mehrere Downstream-Anwendungen, die ausgehend vom Blutkulturpellet durchgeführt werden können, die alle von einer kürzeren Zeit bis zum Ergebnis ohne verringerte Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Assays an isolierten Kolonien profitieren. Sobald die Pastete gemeistert ist, kann die Zubereitung in etwa 30 Minuten erledigt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blutkulturen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten mit Handschuhen und einer Haube getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine schnelle Protokoll für die direkte Identifizierung von Enterococcus faecalis und Enterococcus anderen Arten aus eine positive Blutkultur mit einem Peptidnucleinsäuren Fluoreszenz in situ Hybridisierung Assay (PNA FISH).

Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

Die Konstruktion eines einfachen Ein-Tages-Workflow System für den bakteriellen Erreger-Diagnostik ermöglicht die schnelle Erkennung von Infektionen der Blutbahn. Die Aufnahme von acht klinisch relevanten bakteriellen Ziele und deren Antibiotikaresistenz Profile bietet dem Kliniker einen ersten Einblick am selben Tag, was zu mehr adäquate Therapie führen kann.

Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Quelle: Koeth, L. M., et. al., Eine Referenzbouillon-Mikrodilutionsmethode für Dalbavancin  In-vitro-Empfindlichkeitstests von Bakterien, die aerob wachsen. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) eines Lipoglykopeptid-Antibiotikums gegen grampositive Bakterien. Es umfasst die Isolierung von Bakterienkolonien, die Verdünnung, die Inokulation von Mikrotiterplatten-Wells mit unterschiedlichen...

Eine Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von grampositiven Bakterien

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Antimikrobielle Synergie Prüfung dient zur Bewertung der Wirkung von zwei oder mehr Antibiotika in Kombination eingesetzt und erfolgt in der Regel durch eine von zwei Methoden: die schachbrettartige Anordnung oder die Zeit-Kill-Assay. Hier präsentieren wir eine automatisierte, Inkjet-Drucker unterstützt Schachbrett Array Synergie-Technik und eine klassische Zeit-Kill-Synergie-Studie.

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

Fluoreszierend getaggte Antibiotika sind leistungsstarke Werkzeuge, die verwendet werden können, um mehrere Aspekte der antibiotika-resistenz zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von fluoreszierend markierten Antibiotika und ihre Anwendung auf die Untersuchung von Antibiotikaresistenzen bei Bakterien. Sonden können verwendet werden, um Mechanismen der bakteriellen Resistenz (z. B. Efflux) durch Spektrophotometrie, Durchflusszytometrie und Mikroskopie zu untersuchen.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Dieses Protokoll stellt einen schnellen Test auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) innerhalb von 2,5 h durch einzelzellstimulierte Raman-Streubildgebung desD2O-Metabolismusdar. Diese Methode gilt für Bakterien im Urin oder Vollblut, was für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik transformativ ist.

Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung von antibiotikaresistenten Bakterien aus Wasser und die molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene (ARGs) vor. Die Verwendung von kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (metagenomischen Analysen) Techniken liefert vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs, die in Süßgewässern aus Mumbai, Indien, vorhanden sind.

Isolierung und Identifizierung wässriger antibiotikaresistenter Bakterien und molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene

EUCAST hat ein Protokoll für direkte antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) für automatisierte Blutkulturen entwickelt. Die Abhängigkeit von der massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierung kann jedoch durch die Verwendung eines direkten Inokulumvorbereitungsprotokolls in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem vermieden werden. Mit diesem Ansatz können AST-Berichte innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme bereitgestellt werden.

Direkte mikrobielle Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem zur Erleichterung der EUCAST RAST-Methode ohne Massenspektrometrie

Lernen Sie die Präparation eines Bakterienpellets aus positiven Blutkulturen für MALDI-TOF, Gram-Färbung und Antibiotika-Sensitivitätstests. Diese Methode verkürzt die Zeit bis zur Diagnose und verbessert die Patientenversorgung bei Blutstrominfektionen erheblich.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

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