Name: Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Lernen Sie die Präparation eines Bakterienpellets aus positiven Blutkulturen für MALDI-TOF, Gram-Färbung und Antibiotika-Sensitivitätstests. Diese Methode verkürzt die Zeit bis zur Diagnose und verbessert die Patientenversorgung bei Blutstrominfektionen erheblich.

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Wir danken den Technikern der Bakteriologie-Labor der Universitätsklinik von Lausanne für ihre Hilfe, die Techniken im Labor umzusetzen.

Dieses Protokoll wurde entwickelt und validiert nach den Forschung und Entwicklungsprozesse und ethische Regeln unserer Einrichtung, bevor er als Routinewerkzeug implementiert. 1. Herstellung einer Blutkulturbakterienpellet durch Ammoniumchlorid Erythrozyten-Lyseverfahren <ol><li> Vorbereitung einer positiven Blutkultur für nachfolgende Zentrifugation. <ol><li> Sterilisieren Blutkultur Kappe. Fügen Sie 70% Ethanol auf die Kappe der Flasche und zu brennen. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unter einer Steril ausführen nicht. </li><li> Bewegen Sie die Flasche an einer Steril. Sammeln von 5 ml der Blutkultur mit einer 20 G Spritze. </li><li> Fügen Sie die 5 ml Blutkultur in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit 45 ml sterilem Wasser (H 2 O) und die Probe zu mischen. </li></ol></li><li> Herstellung einer Blutkultur Bakterienpellet durch Zentrifugation Lyse. <ol><li> Zentrifugieren der Probe bei 1.000 xg für 10 min bei RT. </li><li> Remove Überstand mit einer Labor-Vakuumpumpe (die hauptsächlich H 2 O und Blutzellen enthält). </li><li> Das Pellet in 1 ml hausgemachte Ammoniumchlorid Lyse-Lösung (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3). Brechen die Pellets durch Kratzen und durch Vortexen das Rohr und Zentrifugieren der Probe bei 140 g für 10 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen, die hauptsächlich rote Blutkörperchen Schutt. <ol><li> Wenn die Pellets blieben hämorrhagischen, das Pellet in 2 ml sterilem destilliertem H 2 0 weiter lysieren restliche rote Blutzellen und das Pellet zu waschen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 140 g für 10 min bei RT und den Überstand verwerfen. </li></ol></li><li> Resuspendieren des Pellets in 200 ul H 2 O </li></ol></li><li> Subkultur der Blutkultur auf verschiedenen selektiven und nicht-selektiven Agar-Medien. <ol><li> Sammeln von 1 ml der Blutkultur mit einer 20 G Spritze. </li><li> Impfen 1 Tropfen Blutkultur into vier Quadranten auf Blut-Agar, Schokolade-Agar, McConkey Agar-Agar und Schaedler. </li><li> Bei 37 ° C wird die Blut-Agar-und Schokoladen-Agar-Platten in einer 5% CO 2 Atmosphäre, McConkey Agar in einer Normalatmosphäre und die Scha Agarplatte in anaeroben Bedingungen. </li><li> Folgen bakterielle Wachstum auf verschiedenen Medien. </li><li> Überprüfen Sie für bakterielle Reinheit. </li></ol></li></ol> 2. Identifizierung durch MALDI-TOF-MS <ol><li> Direkte Identifizierung aus dem Blut Pellets. <ol><li> Transfer 1 ul Blut Pellet auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. </li><li> Überlagern die Probe mit 1 ul 70% iger Ameisensäure und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. </li><li> Überlagern die Probe mit 1 ul MALDI-Matrix (gesättigte Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Säure in 50% Acetonitril-2.5% Trifluoressigsäure) und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. </li><li> Fahren Sie mit MALDI-TOF-MS-Analyse mit einem MALDI-TOF-MS-System, wie durch den Hersteller beschrieben. </li><li> Wenn die Identifikations Punktzahl ist ungültig auf Artenebene (zum Beispiel mit einem Score &lt;2), führen Sie eine Proteinextraktion des Blutes Pelletprobe. </li></ol></li><li> Identifikation nach Proteinextraktion aus der Blutkultur Pellets. <ol><li> Mix 20 ul Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifugation bei 13.000 × g für 2 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 25 ul von 70% Ameisensäure und 25 ul 100% Acetonitril zum Pellet. Vortex kräftig, um die Pellets zu suspendieren. Resuspendieren harten Pellets, indem Sie sie mit Pipettenspitzen vor Verwirbelung. </li><li> Zentrifugieren bei 13.000 × g für 2 min bei RT. Übertragung 1 ul der Überstand (die extrahierten Proteine ​​enthalten) auf einem MALDI-Target Platte und lassen Sie es trocken auf einem 42 ° C Heizungs Plattform. Gehen Sie wie in 2.1.2 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Bakterielle Identification und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung mit einem automatisierten System-Mikrobielle <ol><li> Herstellung einer Bakteriensuspension zur Identifizierung von Bakterien und AST mit einem automatisierten mikrobiellen Systems. <ol><li> Vorbereiten einer Kunststoffröhrchen, das 3 ml steriler 0,45% iger NaCl-Lösung mit dem automatisierten mikrobielle System kompatibel. </li><li> Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Blutkulturpellet in 0,45% NaCl-Lösung, um eine Bakteriensuspension, entsprechend einer McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erhalten. Messen Sie die Trübung mit einem Densitometer Maschine. HINWEIS: Das Volumen des Blutkulturbakterienpellet variiert von 50 bis 200 ul, um ein McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erreichen. </li></ol></li><li> Impfen die automatisierten Gram-positive (GP) oder Gram-negative (GN) Karten für die Identifikation und die automatisierten AST-Karten für antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Gram-positive Kokken und Gram-negative Bakterien, wie vom Hersteller beschrieben. HINWEIS: identifizierun mit GP oder GN-Karten wird nicht angewendet, wenn MALDI-TOF-MS-Identifizierung Score-Wert&gt; 2. Überprüfen Sie die Reinheit der Bakteriensuspension durch Subkultivierung der Bakteriensuspension auf Blutagar (GP und GN) und MacConkey-Agar (GN) Platten. </li></ol> 4. Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung von Festplattendiffusionstest Die Scheibe Diffusionstest wird von der Europäischen Ausschusses für antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung (EUCAST, Version 3.0, im April 2013 www.eucast.org) beschrieben. <ol><li> Herstellung einer Bakteriensuspension antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von Plattendiffusionstest durchzuführen. <ol><li> Vorbereiten einer Glasröhrchen mit 3 ml steriler 0,9% NaCl-Lösung. </li><li> Hinzufügen einer ausreichenden Menge des Blutkulturpellet in 0,9% NaCl-Lösung, um eine Bakteriensuspension, entsprechend einer McFarland Trübungs von 0,5 zu erhalten. Messen Sie die Trübung mit einem Densitometer Maschine. HINWEIS: Das Volumen der BlutkulturBakterienpellet variiert von 50 bis 200 ul, um ein McFarland Trübungs von 0,6 bis 0,8 zu erreichen. </li><li> Mischen Sie den Bakteriensuspension. </li></ol></li><li> Inokulation von Bakteriensuspension auf Mueller-Hinton-Agar (MH) oder Mueller-Hinton-Agar-Agar anspruchsvolle Organismen (MHF) (MH, ergänzt mit 5% defibriniertes Pferdeblut und 20 mg / l β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid). <ol><li> Tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen in der Bakteriensuspension und entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit durch Drehen Sie den Tupfer an der Innenwand der Glasröhre. </li><li> Verbreiten Sie die Bakteriensuspension gleichmäßig auf die gesamte Oberfläche des MH / MHF-Agar-Platte durch Tupfen in drei Richtungen oder durch Verwendung eines automatischen Plattendreher. </li></ol></li><li> Anwendung von antimikrobiellen Festplatten auf Agar-Platten angeimpft. <ol><li> Gelten genau die Scheiben auf der Oberfläche der getrockneten geimpft Agar-Platten manuell oder mit Hilfe eines Platten Anfälligkeit Spender. </li><li> Die Platte auf der entsprechenden Tempetur und die Atmosphäre wie in der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung EUCAST Plattendiffusionsmethode beschrieben (Version 3.0, im April 2013 www.eucast.org). </li></ol></li></ol> 5. Automatische PCR-basierten diagnostischen Test zum Nachweis von MRSA <ol><li> Mit einer Mikropipette, Transfer 50 ul der Blutkultur Pellet in die Probenflasche mit dem Reagenz MRSA automatisierte PCR-basierten diagnostischen Test-Kit und Wirbel während 20 Sekunden zur Verfügung gestellt. </li><li> Verwendung einer 1 ml-Mikropipette zu verzichten, die Probe in die Probenöffnung der Patrone. Setzen Sie die Patrone in den automatisierten PCR-System und starten Sie den Test, wie vom Hersteller beschrieben. </li></ol>

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<li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+emergency+medicine%22%5BJournal%5D)">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li>
<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Im Vergleich zu herkömmlichen positiven Blutkultur diagnostische Ansätze, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet mit Hilfe der Ammoniumchlorid-Lyse Zentrifugation Ansatz reduzieren die Zeit, um die Identifizierung von 16 bis 24 h und die Zeit bis AST von 24 bis 48 Stunden zu melden (Abbildungen 1 und berichten 3). Rasche Einführung von geeigneten Antibiotika-Therapie ist entscheidend, um das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu verb...

Bakteriämien und Sepsis bei hospitalisierten Patienten sind eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität. So ist die Sterblichkeit im Zusammenhang mit Infektionen Blutbahn in etwa 14% bis 37% der stationären Patienten beobachtet und kann auf 35% auf Intensivstationen Patienten 1-3 erhöhen. Die schnelle Identifizierung des Erregers ist entscheidend zu führen optimale antimikrobielle Behandlung und den erfolgreichen Abschluss der antimikrobiellen Therapie 4,5 zu erhöhen. Die schnelle Analyse von Gram Flecken aus positiver Blutkultur hat bereits einen erheblichen Einfluss auf die Anpassung der antimikrobiellen Therapie 6,7, aber eine genaue Identifizierung des Erregers erforderlich, um die am besten geeigneten Antibiotika-Behandlung für die Patienten zu schaffen. Zum Beispiel haben unterschiedliche Antibiotika-Behandlung nicht ausreichend, um folgende Bakteriämie mit Enterokokken und Streptokokken, die nur schwer durch Gram-Färbung unterscheiden, sind umgesetzt werden. Ebenso Identifikation an der Art Level ist erforderlich, um Gram-negative Enterobakterien erkennen eine chromosomale ampC Gen, das eine erhöhte Resistenz gegenüber 8-Lactamen β kodiert. Mit einer positiven Blutkultur ist die herkömmliche diagnostische Ansatz, um die Infektionserreger auf verschiedenen Agar-Platten, die mehrere Stunden zusätzliche Inkubation vor der Identifikation mit verschiedenen Ansätzen, einschließlich biochemische Tests, Wachstum auf verschiedenen Selektionsmedien und automatische Identifikationssysteme erfordert mikrobiellen Subkultur. Die Zeit, um Ergebnisse einer herkömmlichen diagnostischen Ansatz von etwa 1 bis 3 Tagen. Die Entstehung der Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF)-Technologie für die schnelle Identifizierung von Mikroorganismen wurde ein neues Werkzeug schnell Mikroorganismen von Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet, sondern auch direkt von der positiven Identifizierung Blut bereitgestellt Kulturen (Abbildung 1) 9-12. The Verwendung von MALDI-TOF, um einen infektiösen Erreger aus Blutkulturen zu identifizieren deutlich die Zeit, um Ergebnisse zu ein paar Minuten anstelle von den Stunden und Tagen nach traditionellen Verfahren erforderlich ist, reduziert. Wie von Croxatto et al. Diskutiert 13 stützt sich die Effizienz der MALDI-TOF-Identifizierung von verschiedenen Parametern wie Reinheit und Menge des Mikroorganismus. Diese beiden Kriterien sind leicht von diskreten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden, aber benötigt eine vorge analytischen Behandlung für bakterielle Anreicherung und Reinigung von komplexen Proben wie Blutkultur, die mehrere zelluläre und Protein-Komponenten, die mit MALDI-TOF-Identifikations stören kann enthalten. Verschiedene Mikroorganismen Isolierungsverfahren aus Blutkulturen wurden in einer Reihe von Studien einschließlich Saponin oder andere milde Detergentien Verfahren zur Extraktion bakterieller 9,14, Serumtrennverfahren 10 verwendet Lyse Zentrifugationsverfahren 12 </sauf&gt; und kommerziell Lösungen wie das sepsityper-Kit. Unsere Bakteriologie Diagnoselabor hat einen einfachen Blutkultur Bakterienpellet Zubereitung auf Basis von Ammoniumchlorid-Lyse Erythrozyten, die eine schnelle Identifizierung von Bakterien und Hefe durch MALDI-TOF-und automatisierte Identifikationssysteme (Abbildung 2) 15 erlauben entwickelt. Dieses Blutkultur Pelletzubereitung stellen auch eine Probe für andere direkte nachgeschalteten Anwendungen wie Gram-Färbung, automatisierte PCR-basierten diagnostischen Tests wie POCT-PCRs zum schnellen Nachweis von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und antibiotische Resistenzprüfung mit automatisierte AST-Systeme und / oder Plattendiffusionstests auf Agarplatten (Abbildung 3). In dieser Arbeit wurden die verschiedenen Schritte zur Herstellung des Blutkulturbakterienpellet beschreiben wir, wie durch Prod&#39;hom et al erläutert. 15 (Figur 4). Wir werden auch DESchreiber die Protokolle für drei der wichtigsten Anwendungen, die auf die Blutkultur Pellet durchgeführt werden können: Identifizierung mittels MALDI-TOF-15, Identifikation (ID) und Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (AST) mit den automatisierten Systemen 16 für Enterobacteriaceae und Staphylokokken und automatisierte PCR- basierten diagnostischen Test zum Nachweis von MRSA 17.

<table><tbody><tr><td>20 G Nadel</td><td>Terumo, Leuven, Belgien</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tube</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352070</td><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorur</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydrogencarbonat</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>F0507</td><td>Entzündlich, ätzend</td></tr><tr><td>&#945;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>70990</td><td>Akute Toxizität</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>271004</td><td>Entzündliche, akute Toxizität</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>T6508</td><td>Ätzend, akute Toxizität</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 Instrument</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>27202</td><td>Automatisiertes mikrobielles Systeminstrument</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-positive (GP) Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>21342</td><td>automatisierter GP&nbsp; Ausweis</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>22233</td><td>automatisiertes mikrobielles AST-System</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gramnegative (GN) Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>21341</td><td>automatisierter GN&nbsp; Ausweis</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 Karte</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>413391</td><td>automatisiertes mikrobielles AST-System</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, CA, USA&</td><td>nbsp; GXMRSA-100N-10</td><td>Nukleinsäure-Amplifikationstechnologie MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV Instrument</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA</td><td>GXIV-4-D</td><td>Nukleinsäure-Amplifikationstechnik Instrument</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS Gerät</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>BDAL Microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 Zielstahl BC</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>280799</td><td>MALDI Zielplatte</td></tr><tr><td>Densitometer Densicheck Instrument</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey Agar</td><td>Biolife, Mailand, Italien</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>Mueller-Hinton-Agar</td><td>Oxoid, Hampshire, England</td><td>CM0337</td><td>Mueller-Hinton-Agar (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>MHF-Agar</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich</td><td>43901</td><td>Mueller-Hinton-Agar-Agar (MHF)</td></tr><tr><td>BD Columbia III Agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254071</td><td>Blut-Agar</td></tr><tr><td>BD Schokoladen-Agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254089</td><td>Schokoladen-Agar</td></tr><tr><td>BD Schaedler Agar</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>254084</td><td>Schaedler Agar</td></tr></tbody></table>

vorbereitung einer blutkultur pellet rapid identifizierung von bakterien und antibiotika empfindlichkeitsprüfung

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Blutstrominfektionen und Sepsis sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Der Erfolg von Patienten mit Bakteriämie, hängt von einer schnellen Identifizierung des Erregers zu führen optimale Behandlung mit Antibiotika. Die Analyse der Gram Flecken aus positiver Blutkultur kann schnell durchgeführt werden und bereits erhebliche Auswirkungen auf die antibiotische Therapie. Jedoch ist die genaue Identifikation des Erregers erforderlich, um die optimale gezielte Behandlung etablieren. Wir stellen Ihnen hier eine einfache und schnelle Zubereitung von Bakterienpellet einer positiven Blutkultur, die als Probe für mehrere wesentliche Downstream-Anwendungen wie Identifikation durch MALDI-TOF-MS, antibiotische Empfindlichkeitsprüfung (AST) durch Scheibendiffusionstest oder automatisierte AST-Systemen verwendet werden können und durch automatisierte PCR-basierten Diagnosetests. Die Leistung dieser direkt auf die Blutkultur Bakterienpellets angewendet unterschiedliche Identifikationssysteme und AST ist sehr similar auf die Leistung in der Regel aus isolierten Kolonien auf Agar-Platten gezüchtet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen Ansätzen, die schnelle Beschaffung eines Bakterienpellet reduziert die Zeit, um sowohl Identifikation und AST zu melden. So kann nach einer Blutkultur Positivität Identifizierung durch MALDI-TOF in weniger als 1 Stunde in der Erwägung Ergebnisse AST durch automatisierte Systeme AST oder Scheibendiffusionstests innerhalb von 8 bis 18 h, jeweils angegeben werden. Ebenso können die Ergebnisse einer schnellen PCR-basierten Assays, um den Kliniker mitgeteilt weniger als 2 Stunden nach dem Bericht einer Bakteriämie. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die rasche Erstellung eines Blutkultur Bakterienpellet hat einen signifikanten Einfluss auf die Identifizierung und AST Bearbeitungszeit und damit auf das erfolgreiche Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn.

In der Studie von Prod'hom et al. 15 durchgeführt wurden Bakterienpellets durch Ammoniumchlorid-Lyse Zentrifugation von 122 positive Blutkultur von 78 Patienten erhalten durch MALDI-TOF MS analysiert. Von 122 positiven Blutkultur wurden 95 (77,9%) richtig auf Artenebene und eine (0,8%) an der Gattungsebene identifiziert. Die restlichen 26 (21,3%) Blutkultur-Pellets gab keine sichere Identifizierung mittels MALDI-TOF. Unter denen waren 21 gram-positive Bakterien, darunter 13 Streptokokken und 5 Koagul...

Eine schnelle Bakterienpellet Herstellung von einer positiven Blutkultur kann als eine Probe für Anwendungen wie die Identifizierung durch MALDI-TOF, Gram-Färbung, antibiotische Resistenzprüfung und PCR-basierte Tests verwendet werden. Die Ergebnisse können schnell auf Ärzte mitgeteilt, das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu verbessern.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Bakterienpellet aus einer positiven Blutkultur herzustellen, das als Probe für verschiedene Anwendungen verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem nach der Zentrifugation zunächst eine positive Blutkultur mit sterilem Wasser gemischt wird. Das Pellet wird in Ammoniumchlorid resuspendiert, um die roten Blutkörperchen nach einer zweiten Zentrifugationsrunde zu läusieren.Das Pellet wird wieder in Wasser suspendiert. Der letzte Schritt besteht darin, das erhaltene Pellet zur bakteriellen Identifizierung durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisation, Flugzeit, Grammfärbung, Antibiotika-Empfindlichkeitstests und/oder PCR-basierte Tests zu verwenden. Letztendlich können die erzielten Ergebnisse schnell an Ärzte weitergegeben werden, um das Ergebnis von Patienten mit Blutbahninfektionen zu verbessern.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der bakteriellen Subkultur positiver Blutkulturen, besteht darin, die bakterielle Identifizierung um etwa sechs bis 24 Stunden zu reduzieren und die Zeit bis zu den Ergebnissen der Antibiotikaresistenz um etwa 24 Stunden zu verkürzen. Diese Methode kann dazu b

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine schnelle Protokoll für die direkte Identifizierung von Enterococcus faecalis und Enterococcus anderen Arten aus eine positive Blutkultur mit einem Peptidnucleinsäuren Fluoreszenz in situ Hybridisierung Assay (PNA FISH).

Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

Die Konstruktion eines einfachen Ein-Tages-Workflow System für den bakteriellen Erreger-Diagnostik ermöglicht die schnelle Erkennung von Infektionen der Blutbahn. Die Aufnahme von acht klinisch relevanten bakteriellen Ziele und deren Antibiotikaresistenz Profile bietet dem Kliniker einen ersten Einblick am selben Tag, was zu mehr adäquate Therapie führen kann.

Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Quelle: Feltwell, T., et.al. Trennung von Bakterien nach Kapselmenge unter Verwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Präparation und Charakterisierung von Bakterienstämmen mit unterschiedlicher Kapselproduktion. Pathogene Stämme, die unterschiedliche Mutationen in kapselbezogenen Genen tragen, werden kultiviert, in flüssigen Medien gezüchtet und einer Zentrifugation unterzogen, um Kapselphänotypen anhand der Pelletdichte zu unterscheiden.

Kultivierung und Isolierung kapselbildender pathogener Bakterienstämme

Quelle: Koeth, L. M., et. al., Eine Referenzbouillon-Mikrodilutionsmethode für Dalbavancin  In-vitro-Empfindlichkeitstests von Bakterien, die aerob wachsen. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) eines Lipoglykopeptid-Antibiotikums gegen grampositive Bakterien. Es umfasst die Isolierung von Bakterienkolonien, die Verdünnung, die Inokulation von Mikrotiterplatten-Wells mit unterschiedlichen...

Eine Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von grampositiven Bakterien

Dieses Video zeigt einen Assay zum Screening antimikrobieller Verbindungen, die Biofilme effizient mit einer Stiftplatte eliminieren. Die Methodik überwacht den Stoffwechselzustand des Biofilms nach der Behandlung mit antimikrobiellen Verbindungen und erleichtert die Bestimmung der minimalen Konzentration der Biofilmeradikation.

Ein Peg-Platten-Biofilm-Assay für das Screening antibakterieller Wirkstoffe

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Antimikrobielle Synergie Prüfung dient zur Bewertung der Wirkung von zwei oder mehr Antibiotika in Kombination eingesetzt und erfolgt in der Regel durch eine von zwei Methoden: die schachbrettartige Anordnung oder die Zeit-Kill-Assay. Hier präsentieren wir eine automatisierte, Inkjet-Drucker unterstützt Schachbrett Array Synergie-Technik und eine klassische Zeit-Kill-Synergie-Studie.

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

Dieses Protokoll stellt einen schnellen Test auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) innerhalb von 2,5 h durch einzelzellstimulierte Raman-Streubildgebung desD2O-Metabolismusdar. Diese Methode gilt für Bakterien im Urin oder Vollblut, was für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik transformativ ist.

Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium

EUCAST hat ein Protokoll für direkte antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) für automatisierte Blutkulturen entwickelt. Die Abhängigkeit von der massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierung kann jedoch durch die Verwendung eines direkten Inokulumvorbereitungsprotokolls in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem vermieden werden. Mit diesem Ansatz können AST-Berichte innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme bereitgestellt werden.

Direkte mikrobielle Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem zur Erleichterung der EUCAST RAST-Methode ohne Massenspektrometrie

Lernen Sie die Präparation eines Bakterienpellets aus positiven Blutkulturen für MALDI-TOF, Gram-Färbung und Antibiotika-Sensitivitätstests. Diese Methode verkürzt die Zeit bis zur Diagnose und verbessert die Patientenversorgung bei Blutstrominfektionen erheblich.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

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