Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Vorhandensein spezifischer Bakterien wie E. coli mit Hilfe neuartiger Grippe-Gen-DNA, Zyme-Sonden Erstens, vollständiger genetischer DNA, schnell nachzuweisen. Zyme-Sonden werden durch Ligation erzeugt. Bakterien werden dann kultiviert, um die Anzahl der Zielmoleküle anzureichern, und aus dem Überstand wird ein angesammeltes extrazelluläres Gemisch hergestellt.

Das rohe extrazelluläre Gemisch wird dann mit der DNA-Zyme-Sonde kombiniert, die Wechselwirkung zwischen der DNA-Zyme-Sonde und den Zielmolekülen führt zu einer Spaltung der Sonde, die dann fluoresziert und verwendet wird. Eine Fluorimeter-Wechselwirkung zwischen Sonde und Target wird als Erhöhung der relativen Fluoreszenz angesehen. Die Ergebnisse werden dann mit Hilfe der denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse verifiziert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber PCR- oder Antikörper-basierten Methoden besteht darin, dass das Verfahren einfacher und leichter durchzuführen ist. Obwohl diese Methode mit dem Modellbakterium e coli entwickelt wurde, kann sie auf den Nachweis aller anderen lebensmittelbedingten oder nosokomialen bakteriellen Krankheitserreger angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie möglicherweise nicht an den Umgang mit synthetischen DNA-Sonden und Bakterien gewöhnt sind. Sergio Aguire, ein Forschungsassistent aus meinem Labor, und Monso Ali, ein Postdoktorand für dieses Protokoll, demonstrieren das Verfahren.

R-F-D-E-C one ist die vorgestellte DNA Zyme. Es besteht aus der katalytischen Sequenz EC, eins schwarz unterstrichen, und der Substratsequenz FS, eins grün unterstrichen, die innerhalb des Substrats enthalten ist, ist eine RNA-Bindung, die durch das blaue r angezeigt wird, flankiert von einem Fluor-markierten DT, das durch das F angezeigt wird, und einer QUENCHER markierten DT, die durch die Warteschlange RF angezeigt wird; SS eins ist eine verschlüsselte Version von RFD EEC eins, bei der die katalytische Sequenz EEC eins teilweise in SS eins gemischt wird, aber der FS ein Teil bleibt unverändert. RF DEC eins und RF SS eins werden durch matrizenvermittelte enzymatische Ligation des Oligonukleotids FS eins mit Oligonukleotid EC eins oder SS eins in Gegenwart von LT eins als Ligationsschablone hergestellt, um rohe extrazelluläre Mischungen oder Cems herzustellen, die als Ziel für R-F-D-E-C verwendet werden, beginnen Sie mit der Abgabe von zwei Millilitern LB in sterile 14-Milliliter-Kulturröhrchen unter Verwendung einer Pipettenpistole.

Als nächstes entnehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne Kolonie von E-coli aus einer Schneckenplatte und geben Sie sie in ein Kulturröhrchen mit lb. Legen Sie die Röhrchen in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator und schütteln Sie sie nach der Inkubation 14 Stunden lang bei 250 U/min. Um eine 1%re-Inokulationskultur zu erzeugen, geben Sie zwei Milliliter frisches LB in 14-Milliliter-Kulturröhrchen und fügen Sie 20 Mikroliter der Bakterienkultur aus dem vorherigen Schritt hinzu.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 250 U/min, bis jede Bakterienlösung einen OD 600 von etwa einem Transfer erreicht. Einen Milliliter jeder Kultur in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und die Zellen durch Zentrifugation bei 11.000 g für fünf Minuten pelletieren. Nach dem Schleudern den klaren Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen.

Lagern Sie den Überstand bei minus 20 Grad Celsius. Wenn es nicht sofort verwendet wird, um festzustellen, ob ein Fluoreszenzsignal durch Interaktion der DNA-Enzyme mit dem Rohzellextrakt erzeugt wird, werden die Proben mittels Spektrenphotometrie untersucht. Schalten Sie das Fluoreszenzspektrophotometer ein und stellen Sie die Datenerfassungsparameter mit Anregung bei 488 Nanometern und Emission bei 520 Nanometern ein.

Richten Sie das Gerät außerdem so ein, dass es eine Stunde lang jede Minute Messwerte aufnimmt. Waschen Sie drei Quarzkristallküvetten zuerst mit destilliertem entionisiertem Wasser und dann mit 100%Ethanol. Trocknen Sie die Küvetten durch Aufblitzen von Stickstoffgas.

Bezeichnen Sie die Küvetten als C eins für die Kontrolle, eins, C zwei für die Kontrolle zwei und T für den Test. Übertragen Sie anschließend 24 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser auf C eins und 24 Mikroliter des vorbereiteten extrazellulären Rohgemischs e coli auf C zwei und T. Geben Sie 25 Mikroliter von zwei X RB zu jedem Q-Tierarzt und legen Sie sie in das Fluoreszenzspektrophotometer. Beginnen Sie nach fünf Minuten mit der Erfassung von Fluoreszenzdaten, fügen Sie einen Mikroliter mit fünf Mikromolaren, RFS S eins zu C zwei und einen Mikroliter mit fünf Mikromolaren, RFD eec eins zu T und C eins hinzu und stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenzmesswerte nicht unterbrochen werden. Mischen Sie jede Lösung durch Pipettieren und lassen Sie die Reaktion für den Rest der Erfassungszeit fortgesetzt.

Speichern Sie die Daten im Excel-Dateiformat. Übertragen Sie dann die Daten auf einen PC und verwenden Sie Excel, um ein grafisches Bild zu erstellen. Die gleichen Reaktionsgemische, die für die Analyse von Spectra verwendet wurden.

Die Photometrie kann zur Analyse mittels Gelelektrophorese verwendet werden. Nach einer Stunde der Akquisition. Nehmen Sie die Küvetten aus dem Spektralphotometer und geben Sie die Lösungen in neue Mikrozentrifugenröhrchen.

Die Reaktionen werden durch Zugabe von fünf Mikrolitern dreimolaren Natriumacetats und 125 Mikrolitern 100%igem Ethanol gestillt. Mischen Sie jede Lösung durch Vortexen und legen Sie die Röhrchen nach der Inkubationszentrifuge eine Stunde lang in den Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Die Reaktionsgemische bei 11.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius erhitzen und den Überstand vorsichtig durch Pipettieren entfernen.

Trocknen Sie die Pellets 10 Minuten lang mit einem DNA-Konzentrator A. 20 Mikroliter Gel-Ladepuffer zugeben und kurz vortexen. Schleudern Sie kurz mit einer Tischzentrifuge.

Laden Sie anschließend nach dem Lauf 10 Mikroliter der Reaktionsproben pro Vertiefung mit 10 %Dage Gel. Entfernen Sie die Glasplatten und waschen Sie sie gründlich mit Leitungswasser ab. Um eventuelle Gelstücke zu entfernen, wischen Sie die Platten mit einem Kim-Tuch ab.

Scannen Sie die Gelplatte mit einem Taifun-Scanner auf Fluoreszenz. Analysieren Sie die resultierenden Bilder mit einer Image-Quant-Software, um die Empfindlichkeit des Systems zu bewerten. Seriell verdünnte Kulturen werden über immer längere Zeiträume angebaut.

Um die minimale Inkubationszeit zu bestimmen, die zum Nachweis eines einzelnen Bakteriums erforderlich ist, bereiten Sie 10 Kulturröhrchen mit zwei Millilitern lb vor, impfen Sie jede Kultur mit 100 Mikrolitern zwei KBE pro Milliliter eines Glycerinvorrats von E. coli und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min nach 4, 8, 12, 16 und 24 Stunden. Ernten Sie 300 Mikroliter aus jedem der beimpften Kulturröhrchen, da bei den zu diesem Zeitpunkt entnommenen Proben möglicherweise keine nachweisbaren Bakterien vorhanden sind. Ziffern 4 8 12.

Lassen Sie die verbleibende Kultur 24 Stunden lang wachsen, um Kulturen zu identifizieren, die Bakterien enthalten. Messen Sie den OD 600 und fällen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 11.000 G für fünf Minuten. Den Überstand, der das CEMS enthält, in frische 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und bis zur Verwendung am nächsten Tag bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Prüfen Sie die Kulturen auf Wachstum. Nur ein oder zwei der 10 Kulturen können nach der Inokulation E-coli enthalten, und die restlichen Röhrchen enthalten keine Zellen. Verwenden Sie das CEMS, das aus positiven Kulturen zu den angegebenen Zeitpunkten gewonnen wurde. Um Spaltreaktionen mit RFD EEC one vorzubereiten, analysieren Sie die Reaktionsgemische unter Verwendung der DAGE-Gelelektrophorese, wie zuvor beschrieben, wurden sowohl RFD EEC one als auch RF SS one Sonden durch enzymatische Ligation der DNA-Zym-Abschnitte an das Substrat hergestellt.

FS one Wechselwirkung von CEM EEC und RFD EEC one oder RF SS one wurde dann spektrometrisch bewertet. Wie hier zu sehen ist. R-F-D-E-C one erzeugte unter Zugabe von CEM ec ein hohes Maß an Fluoreszenzsignal.

Im Gegensatz dazu erzeugte R FS S one kein starkes Fluoreszenzsignal. Somit die Fluoreszenz erzeugende Funktion von RFD EEC one. Bei der Kontaktaufnahme wird CEM EC sequenziert.

Spezifisch, um zu überprüfen, ob die beobachteten Fluoreszenzanstiege auf die Spaltung der RNA-Bindung zurückzuführen sind. Die Reaktionsgemische wurden durch Dage-Spaltung von RFD eec analysiert, wobei eine mit 0,25 molar Natriumhydroxid voraussichtlich 2D-NA-Fragmente erzeugt, ein Fünf-Prime-Fragment, das das Fluor zurückhält, und ein Drei-Prime-Fragment, das den Quencher beibehält. Wie hier zu sehen ist.

Das Reaktionsgemisch RFD EEC CEM EEC erzeugte tatsächlich das erwartete Spaltprodukt. Darüber hinaus konnten nur UNC-gespaltenes R-F-D-E-C one und das Fünf-Prime-Fragment durch Fluoreszenzbildgebung nachgewiesen werden. Um die Spezifität von RFD EEC zu untersuchen, wurden One-Fluoreszenz-Assays mit CEMS durchgeführt, die nur von mehreren anderen gramnegativen und grampositiven Bakterien gesammelt wurden.

Die Probe, die CEM EC enthielt, erzeugte einen Anstieg der Fluoreszenz. Das Fehlen einer Kreuzreaktivität mit CEMS von den anderen Bakterien deutet darauf hin, dass R-F-D-E-C one für E-coli hochselektiv ist, um die Mindestkulturzeit zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine einzelne E-Coli-Zelle zu detektieren E-Coli, verdünnt auf eine KBE pro Milliliter in 100 Mikrolitern, die mit Wachstumsmedium für 4, 8, 12, 16 und 24 Stunden kultiviert wurden. Das resultierende CEMS gemischt mit R-F-D-E-C one und Spaltung wurde wie hier gezeigt durch Dage bewertet.

Ein Bild des Dage-Assays zeigt, dass R-F-D-E-C 1 nicht das erwartete Spaltprodukt produziert hat. Bei Reaktion mit CEM. ECS, das nach vier und acht Stunden Wachstum gesammelt wurde, was darauf hindeutet, dass eine Kultivierungszeit von 12 Stunden erforderlich ist, sobald es gemeistert ist.

Die Schlüsselkomponente dieser Technik, der DA-Enzym-basierte Assay, kann in 60 Minuten durchgeführt werden, wenn er nach dieser Entwicklung richtig durchgeführt wird. Das Verfahren ebnete den Forschern im Bereich der Bioanalytik den Weg, allogene DNA-Enzyme für den Nachweis einer Vielzahl bakterieller Krankheitserreger zu erforschen.