Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium

Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests können innerhalb von 2,5 Stunden in Urin und Blut durchgeführt werden, was im Vergleich zur herkömmlichen Brühe-Mikroverdünnungsmethode eine enorme Verkürzung der Analysezeit darstellt. Es kann die bakterielle Stoffwechselaktivität in einer komplexen Umgebung wie Vollblut überwachen. Überprüfen Sie zunächst die Bakterienkonzentration aus den Proben, indem Sie die optische Dichte mit einem Photometer bei 600 Nanometer Wellenlänge messen.

Um eine endgültige Zellkonzentration von acht mal 10 bis fünf Koloniebildungseinheiten (KBE) pro Milliliter zu erreichen, verdünnen Sie die Bakterienlösung mit dem normalen MHB-Medium ohne Deuterium. Nach dem Mischen der Bakterienzellen durch Wirbel 300 Mikroliter Aliquots der Bakterienlösung in sieben 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und 600 Mikroliter Aliquot der Bakterienlösung in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen entfernen. Dann fügen Sie 4,8 Mikroliter der antibiotischen Stammlösung in das Mikroröhrchen mit 600 Mikrolitern der Bakterienlösung hinzu, um die endgültige Antibiotikakonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Man fügt 300 Mikroliter der Bakterienlösung mit Antibiotikum zu einem 300 Mikroliter Aliquot der Bakterienlösung ohne Antibiotikum hinzu, um eine zweifach verdünnte Lösung mit der endgültigen Antibiotikakonzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Wiederholen Sie die zweifache serielle Verdünnung der Testantibiotika, bis die niedrigste Konzentration von 0,25 Mikrogramm pro Milliliter erreicht ist. Verwerfen Sie 300 Mikroliter der Lösung aus dem letzten Mikroröhrchen.

Weisen Sie ein Röhrchen ohne Antibiotika der Positivkontrolle mit Deuteriumbehandlung und der Negativkontrolle ohne Deuterium zu. Inkubieren Sie das bakterielle Aliquot mit dem antibiotischen MHB-Medium für eine Stunde. In der Zwischenzeit wird eine serielle Verdünnung von Antibiotika mit 100% Deuterium-haltigem MHB-Medium mit den gleichen Konzentrationsgradienten wie zuvor beschrieben hergestellt.

Nach einer Stunde Inkubation fügen Sie 700 Mikroliter Antibiotikum, das seriell mit 100% Deuterium enthaltendem MHB-Medium verdünnt ist, zu den 300 Mikrolitern vorbehandelter Antibiotika vorbehandelter Bakterien in der gleichen Antibiotikakonzentration hinzu. Homogenisieren Sie die Mischung, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Fügen Sie 700 Mikroliter antibiotikafreies 100% Deuterium enthaltendes MHB-Medium zu 300 Mikrolitern antibiotikafreien Bakterien als Positivkontrolle hinzu.

Fügen Sie 700 Mikroliter antibiotikafreies 0%Deuterium-haltiges MHB-Medium zu 300 Mikrolitern antibiotikafreien Bakterien als Negativkontrolle hinzu. Inkubieren Sie alle Mikroröhrchen bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie den einen Milliliter Antibiotikum und Deuterium behandelte Bakterienprobe bei 6.200 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Dann waschen Sie das Pellet zweimal mit gereinigtem Wasser. Fixieren Sie die Proben in 10% Volumen-für-Volumen-Formalinlösung und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Überprüfen Sie die Escherichia coli-Konzentration aus der frisch vorbereiteten Bakterienprobe, indem Sie die optische Dichte mit einem Photometer bei 600 Nanometer Wellenlänge messen.

Um die klinischen Harnwegsinfektionsproben nachzuahmen, spießen Sie die Escherichia coli-Probe in 10 Milliliter de-identifizierter Urinproben, um eine Endkonzentration von 10 bis sechs KBE pro Milliliter zu erreichen. Filtern Sie den Escherichia coli-Stachelurin mit einem Fünf-Mikron-Filter und teilen Sie die gefilterte Bakterienlösung in 300-Mikroliter-Aliquots in sieben 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und ein 600-Mikroliter-Aliquot in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Führen Sie eine Deuteriumeinbaubehandlung in Gegenwart von Antibiotika durch, wie zuvor beschrieben.

Um die klinischen Blutbahninfektionsproben nachzuahmen, spießen Sie Pseudomonas aeruginosa in einen Milliliter de-identifizierten menschlichen Blutes, um eine Endkonzentration von 10 bis sechster KBE pro Milliliter zu erreichen. Um das Blut zu lysieren, fügen Sie neun Milliliter steriles gereinigtes Wasser hinzu. Filtern Sie das Stachelblut von Pseudomonas aeruginosa mit einem Fünf-Mikron-Filter.

Dann ernten Sie Bakterien aus der gefilterten Probe auf ein Millilitervolumen durch Zentrifugieren bei 6.200 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation teilen Sie die Pseudomonas aeruginosa-Stachelblutlösung in 300-Mikroliter-Aliquots in sieben 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und ein 600-Mikroliter-Aliquot der Bakterienlösung in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und führen Sie eine Deuterium-Einbaubehandlung in Gegenwart von Antibiotika durch, wie zuvor beschrieben. Für die Probenvorbereitung waschen Sie einen Milliliter fixierte Bakterienlösung mit gereinigtem Wasser und zentrifugieren Sie die gewaschene Bakterienlösung bei 6.200 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und reichern Sie die Bakterienlösung mit sterilisiertem Wasser auf etwa 20 Mikroliter an. Die Bakterienlösung wird auf ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas gegeben, mit einem anderen Deckglas belegt und die Probe versiegelt. Im SRS-Mikroskop liefert ein durchstimmbarer Femtosekundenlaser mit einer Wiederholrate von 80 Megahertz die Pump- und Stokes-Anregungslaser.

Der Stokes-Strahl wird durch einen akusto-optischen Modulator bei 2,4 Megahertz moduliert. Die beiden Strahlen sind colifast durch einen dichroitischen Spiegel verbunden. Dann werden die Pumpe und die Stokes-Strahlen in ein im Labor gebautes Laserscanning-Mikroskop mit einem 2D-Galvo-Spiegel für das Laserscannen geleitet.

Ein 60-faches Wasserobjektiv fokussiert die Laser auf die Probe und ein Ölkondensator sammelt das Signal von der Probe. Zwei Filter werden verwendet, um den Stokes-Strahl herauszufiltern, während der Pumpstrahl von einer Fotodiode detektiert wird, woraufhin das stimulierte Raman-Signal von einem Lock-in-Verstärker extrahiert wird. Geben Sie mithilfe der Steuerungssoftware die Pumpwellenlänge ein und stimmen Sie sie auf 852 Nanometer ab.

Stellen Sie die Schwingungsfrequenz C bis D auf 2, 168 Wellenzahl ein, um Bakterien mit einem SRS-Mikroskop abzubilden. Messen Sie die Laserleistung mit einem Leistungsmesser. Stellen Sie die Leistung des Pumplasers an der Probe auf acht Milliwatt und die Leistung des Stokes-Lasers an der Probe auf 50 Milliwatt ein, indem Sie die Halbwellenplatte vor dem Laserausgang einstellen.

Legen Sie die Standardprobe DMSO d6 auf den Probentisch und verwenden Sie ein 60-faches Wasserimmersionsobjektiv, um die Pumpe und die Stokes-Laser auf die Probe zu fokussieren. Durch Einstellen der Schrauben der Reflexionsspiegel können Sie die Pump- und Stokes-Strahlen räumlich ausrichten und die beiden Strahlen in ein aufrechtes Mikroskop lenken, das mit einem 2D-Galvo-Spiegelsystem für Laserscanning ausgestattet ist. Stellen Sie in der Software-Systemsteuerung jedes SRS-Bild so ein, dass es 200 x 200 Pixel und die Pixelverweilzeit auf 30 Mikrosekunden enthält.

Die Gesamtaufnahmezeit für ein Bild beträgt ca. 1,2 Sekunden. Stellen Sie die Schrittweite auf 150 Nanometer ein, so dass die Bildgröße etwa 30 mal 30 Mikrometer im Quadrat beträgt. Nach der Optimierung des Systems nehmen Sie die Standardprobe heraus und legen die Bakterienprobe auf den Probentisch unter dem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv.

Starten Sie die SRS-Bildgebung von Bakterienproben. Stellen Sie mindestens drei Sichtfelder für jedes Beispiel vor. Der Effekt der Inkubationszeit auf den Deuteriumeinbau wird durch spontane Raman-Mikrospektroskopie in den CD- und CH-Regionen gemessen.

Das CD-zu-CH-Intensitätsverhältnisdiagramm über die Deuterium-Inkubationszeit für einzelne Bakterien zeigte eine zunehmende CD-über-CH-Intensität über die Inkubationszeit von null auf 180 Minuten. Die SRS-Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa wurde nach Inkubation mit Gentamicin und 70% Deuterium durchgeführt. Die weitere quantitative statistische Analyse zeigte, dass CD-Signale von Bakterien mit zwei Mikrogramm pro Milliliter oder einer höheren Gentamicin-Konzentration signifikant niedriger waren als ohne Gentamicin-Behandlung.

Die Grenzwertintensitätsschwelle von 0,60 kam zu dem Schluss, dass Pseudomonas aeruginosa bei zwei Mikrogramm pro Milliliter und höheren Gentamicinkonzentrationen metabolisch gehemmt wurde. Der SC-MIC für Pseudomonas aeruginosa gegen Gentamicin in einem normalen MHB-Medium wurde mit zwei Mikrogramm pro Milliliter bestimmt, was innerhalb des einfachen Differenzbereichs mit MIC von vier Mikrogramm pro Milliliter lag, der durch die Brühe-Mikrodilutionsmethode bestimmt wurde. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing, oder AST, von Escherichia coli Stachelurinproben wurde mittels SRS-Bildgebung durchgeführt.

Die SC-MIC für die Escherichia coli-Stachelurinprobe gegen Amoxicillin wurde mit vier Mikrogramm pro Milliliter bestimmt, was die gleiche Empfindlichkeitsanzeige wie der MIC von acht Mikrogramm pro Milliliter durch die konventionelle Brüheverdünnungsmethode für reines Escherichia coli in normalem MHB-Medium aufweist. Die Anwendbarkeit einer schnellen AST von Pseudomonas aeruginosa, die in menschlichem Blut versetzt wurde, wurde mittels SRS-Bildgebung untersucht. Die CD-Intensität des SRS-Bildes bei 2.168 Zentimetern wurde von bakteriellen Signalen dominiert, die aus dem metabolischen Deuteriumeinbau lebender Bakterien stammten.

Der SC-MIC für Pseudomonas aeruginosa im Blut wurde mit zwei Mikrogramm pro Milliliter bestimmt, was gut mit dem konventionellen Standard-MIC-Ergebnis für Pseudomonas aeruginosa im normalen Wachstumsmedium übereinstimmte. Die bakterielle Zellzahl, die für antimikrobielle Empfindlichkeitstests verwendet wird, wird bei etwa fünfmal 10 bis fünften koloniebildenden Einheiten pro Milliliter gehalten, wie vom Clinical and Laboratory Standards Institute empfohlen. Eine höhere Bakterienkonzentration kann zu einer Erhöhung der minimalen Hemmkonzentration führen.

Die Kombination von In-situ-Pathogenidentifizierung und schneller Diagnose antimikrobieller Empfindlichkeitstests könnte ein großes Potenzial für die Umsetzung in eine Klinik darstellen, die eine rechtzeitige Identifizierung geeigneter antimikrobieller Wirkstoffe für eine präzise Behandlung ermöglicht.