Eine Bouillon-Mikrodilutionsmethode zur Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von grampositiven Bakterien

Isolieren Sie grampositive Bakterienkolonien aus einer Kulturplatte und suspendieren Sie sie in einem Medium.

Verdünnen Sie die Suspension, um die optimale Bakterienkonzentration für den Assay zu erreichen.

Beimpfen Sie die Testvertiefungen einer Mikrotiterplatte, die steigende Konzentrationen eines Lipoglykopeptid-Antibiotikums enthält, und einer Vertiefung zur Wachstumskontrolle, die nur das Medium enthält.

Verteilen Sie ein Aliquot aus der Kontrollvertiefung auf Kulturplatten, um die Reinheit der Kultur und die Keimzahl zu überprüfen.

Inkubieren, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen, wobei die Zellwand synthetisiert wird.

Das Antibiotikum bindet an Peptidoglykan, einen Bestandteil der Zellwand, und seine Vorläufer, hemmt die Polymerisation und schwächt die Wand.

Die Störung ermöglicht es, dass osmotischer Druck eine Zelllyse verursacht.

Bestätigen Sie nach der Inkubation die Reinheit der Kultur und die optimale Keimzahl.

Untersuchen Sie die Vertiefungen auf Bakterienwachstum.

Die Kontrollvertiefung zeigt ein sichtbares Wachstum, während die Testvertiefung mit der niedrigsten Antibiotikakonzentration, die das Wachstum vollständig hemmt, die minimale Hemmkonzentration (MIC) anzeigt.

Bei dieser Demonstration wird eine frisch zubereitete Platte geimpft. Zur Vorbereitung des Inokulums wählen Sie mehrere gut isolierte Kolonien aus einem 18- bis 24-Stunden-Blutagar oder einer anderen nicht-selektiven Agarplatte aus. Hier werden die Stämme S. aureus und E. faecalis zur Qualitätskontrolle eingesetzt.

Berühren Sie die Oberseite jeder Kolonie mit einem sterilen Tupfer und geben Sie einen Teil davon in ein Röhrchen, das ein bis fünf Milliliter CAMHB oder Kochsalzlösung enthält. Übertragen Sie weiter, bis die Trübung innerhalb von 15 bis 30 Minuten nach der Zubereitung einem McFarland-Standard von 0,5 entspricht, verdünnen Sie das Inokulum um eins zu 100 in CAMHB, um eine Endkonzentration von fünfmal 10 bis fünf KBE pro Milliliter zu erreichen. Der akzeptable Bereich liegt zwischen zwei und acht mal 10 bis fünf KBE pro Milliliter.

Übertragen Sie sofort mit einer Mehrkanalpipette mit sterilen Spitzen 50 Mikroliter des endgültigen Inokulums in jede geeignete Vertiefung der MIC-Plattenplatte. Dabei werden vier Reihen mit jedem der beiden Isolate beimpft, also insgesamt vier Replikate pro Isolat. Um anschließend eine Reinheitsprüfung durchzuführen, übertragen Sie mit einer Pipette ein bis 10 Mikroliter der Lösung in der positiven Wachstumskontrolle auf einen nicht-selektiven Agar, wie z. B. Trypticase-Soja-Agar mit 5 % Schafsblut.

Verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um die Lösung auf der Oberfläche der Platte zu verteilen. Drehen Sie die Platte um 90 Grad und streichen Sie erneut, um sicherzustellen, dass das Inokulum gleichmäßig verteilt ist. Decken Sie den Teller ab und stellen Sie ihn beiseite.

Zur Vorbereitung einer Koloniezählung verwenden Sie eine Einkanalpipette, um 10 Mikroliter der Lösung in der Wachstumskontrollvertiefung auf 10 Milliliter Kochsalzmischung zu übertragen, und übertragen Sie dann 100 Mikroliter in ein geeignetes nichtselektives Agarmedium, wie z. B. Trypticase-Soja-Agar mit 5 % Schafsblut unter Verwendung einer sterilen Schlaufe, und verteilen Sie die Lösung über die gesamte Agaroberfläche. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal in verschiedene Richtungen, um eine gleichmäßige Verteilung des Inokulums zu gewährleisten. Stapeln Sie anschließend bis zu vier MIC-Paneele in einem Kunststoffbehälter und stellen Sie sicher, dass die obere Platte mit einem Deckel dicht verschlossen ist.

Legen Sie dann ein feuchtes Papiertuch in den Plastikbehälter und verschließen Sie ihn innerhalb von 30 Minuten nach der Impfung sicher mit dem Deckel. Inkubieren Sie die MHK-Panels, die Koloniezählplatte und die Reinheitskontrollplatte in einem Umgebungsluftinkubator bei 35 plus oder minus zwei Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden. Am nächsten Tag wird die minimale Hemmkonzentration als die niedrigste Konzentration abgelesen, die das Bakterienwachstum in den Vertiefungen vollständig hemmt, wie sie mit bloßem Auge erkannt wird.

Bestimmen Sie die Anzahl der Völker auf dem Völkerzählplatten. Multiplizieren Sie die gezählte Zahl mit dem Verdünnungsfaktor. Zum Beispiel entspricht 50 Kolonien mal einem Verdünnungsfaktor von 10.000 fünf mal 10 bis zur fünften KBE pro Milliliter.

Ein akzeptabler Bereich liegt bei 20 bis 80 Kolonien, was zwei- bis achtmal 10 bis fünf koloniebildenden Einheiten pro ml entspricht. Die Konzentration des Inokulums ist eine wichtige Variable, um die Empfindlichkeitstests zu kontrollieren und genaue Ergebnisse zu erhalten. Überprüfen Sie abschließend die Reinheitsplatte.

Wenn alle Völker den als Inokulum verwendeten Völkern ähneln, kann es als rein angesehen werden. Wenn andere Kolonien vorhanden sind, besteht die Möglichkeit, dass sich eine Verunreinigung im MHK-Panel befindet, und der Test sollte wiederholt werden.