Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane mesenchymale Stammzellen auf poröser Knochenmatrix zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mesenchymale Stammzellen aus der humanen Amnionmembran oder AM-HCS isoliert werden. Als nächstes werden die porösen Knochenmatrixscheiben vorbereitet, um die richtige Verteilung der Nährstoffe für das Zellwachstum zu begünstigen.

Dann werden die AM hcs auf den porösen Knochenmatrixscheiben kultiviert. Schließlich werden die koloniebildenden Einheiten gezählt und die Morphologie. Dabei werden die Zellproliferation und die Zelladhäsion analysiert.

Letztendlich werden die zelluläre Morphologie, die Anzahl der koloniebildenden Einheiten, die Zellproliferation und die Zelladhäsion durch optische Mikroskopie, Färbung mit Vitalfarbstoffen bzw. Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf unsere Therapie von Knochenverletzungen, da es möglich ist, die mesenchymalen Stammzellen in makroporöse Biomaterialien einzubringen, die den natürlichen Knochen nachahmen. Um mesenchymale Stammzellen aus der menschlichen Amnionmembran zu isolieren, halten Sie mit einer Hand die Nabelschnur fest und lösen Sie mit der anderen Hand die Amnionmembran, die wie ein durchscheinendes Blatt aussieht.

Wenn das Choon in der Probe vorhanden ist, zerlegen Sie es manuell, um es vom Amnionengewebe zu trennen. Waschen Sie die Probe dreimal mit fünf Millilitern PBS, um Blutreste zu entfernen, und entfernen Sie mit einer einfachen Pinzette Blutgerinnsel mit einem Skalpell. Machen Sie kleine Schnitte in die Amnionmembran, um Fragmente von etwa 0,5 Quadratzentimetern zu erzeugen.

Um die Membran zu verdauen, geben Sie die Fragmente in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie fünf Milliliter 0,125%iges Trypsin 0,5 Millimolare EDTA-Lösung hinzu. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie sich fünf Minuten lang bei 200 g und 25 Grad Celsius drehen. Entsorgen Sie dann den Überstand.

Als nächstes fügen Sie 15 Milliliter Kollagenase-Typ-2-Lösung hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln gemäß dem Protokoll von Lava at al. Unmittelbar nach der Verdauung fügen Sie 15 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 200 G und 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie PBS, um das Zellpellet zu waschen, bevor Sie es erneut 15 Minuten lang drehen.

Nach dem Entsorgen des Überstands 10 Milliliter H-G-D-M-E-M zum Pellet geben und durch leichtes Schütteln wieder suspendieren. Zur Erweiterung der mesenchymalen Stammzellen. Zwei Milliliter Zellsuspension werden in einen Kulturkolben gegeben und zwei Milliliter H HG DMEM Inkubat hinzugefügt.

Und nach fünf bis sieben Tagen entfernen Sie nicht adhärente Zellen, indem Sie das Kulturmedium wechseln. Wechseln Sie dann alle drei Tage für weitere sieben bis 10 Tage das Kulturmedium, bis die Zellen zu 90 % zusammenfließen. Fügen Sie 0,125 %Trips in EDTA hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang, bevor Sie die Zellsuspension aspirieren und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen.

Nachdem Sie die Zellen gedreht und den Überstand verworfen haben, verwenden Sie HG DMEM, um die Zellpelletkultur zu resuspendieren. Die Zellen werden in 2 75-Quadratzentimeter-Kolben gefüllt und die Kultur bei 90 % Konfluenz gehalten. Wiederholen Sie die Isierung und Wiederholung bis zur neunten Passage oder Subkultur.

Dann werden die Zellen für die Durchflusszytometrie oder andere Studien gewonnen. Zur Aufbereitung von porösen Knochenmatrixscheiben. Beginnen Sie mit der Zugabe von drei Millilitern HG DMEM ohne FBS zu jeder NKB-Scheibe und inkubieren Sie am nächsten Tag über Nacht in einer befeuchteten Atmosphäre gemäß FAA etal.

Legen Sie jede Scheibe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei 200 GS, um das überschüssige Kulturmedium zu entfernen, und geben Sie sie dann auf eine 24-Well-Kulturplatte. Fügen Sie 500 Mikroliter H-G-D-M-E-M hinzu und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen auf den Scheiben vorhanden sind, um die richtige Verteilung von Nährstoffen und Zellen zu begünstigen. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius aus drei Subkulturen langsam und kontinuierlich.

Eine zelluläre Suspension auf die Oberfläche der vorverheirateten Biomaterial-Scheibe säen und 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation vorsichtig 1,5 Milliliter H-G-D-M-E-M aus der Vorkriegszeit hinzufügen und die Kultur drei Tage lang aufbewahren, um einen Zellproliferationstest durchzuführen, 150 Mikroliter des lebenswichtigen Farbstoffs AB gemäß den Richtlinien des Herstellers zu den Zellscheibenproben hinzufügen. Messen Sie sofort die Extinktion bei 570 Nanometern mit einer Referenzwellenlänge von 600 Nanometern. Inkubieren Sie die Zellen sieben Tage lang und messen Sie die Absorption alle 24 Stunden.

Messen Sie koloniebildende Einheiten, indem Sie 100 Zellen pro 100-Millimeter-Gewebekulturscheibe in H-G-D-M-E-M kultivieren und 14 Tage lang inkubieren. Verwenden Sie PBS, um die Kultur zu waschen, und verwenden Sie 0,5 % Kristallviolett in Methanol, um die Zellen fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zu färben. Verwenden Sie PBS, um die Platten zweimal zu waschen, bevor Sie ein Mikroskop verwenden, um die Zellen zu zählen, wie in diesen Durchflusszytometrie-Histogrammen zu sehen ist.

Die aus der Amnionmembran isolierte Zellpopulation reagierte stark auf die oberflächenmesenchymalen Marker CD 90, CD 73 und CD 1 0 5 und reagierte negativ auf die hämatopoetischen Marker CD 34 und CD 45, was darauf hindeutet, dass die AM-HSCs tatsächlich mesenchymal waren. Wie diese Rastermikroskopaufnahmen zeigen, war die Oberfläche des Biomaterials am ersten Tag mit kugelförmigen Zellen bedeckt und die AMCs anscheinend am siebten Tag an der Oberfläche der Rindermatrix befestigt. Über Fill-Podal-Fortsätze bei höherer Vergrößerung nehmen die Zellen Kontakt zueinander auf.

Diese Grafik zeigt eine geringe Abnahme der relativen Absorptionseinheiten der Rindermatrix. Nach einem Tag Inkubation induziert das Vorhandensein des Gerüsts eine Zunahme der Zellproliferation, statistisch signifikant im Vergleich zu der Kultur, die in Abwesenheit von Rindermatrix unter Verwendung des koloniebildenden Unit-Assays zur Analyse von Stammzellen durchgeführt wurde. Diese Grafik zeigt, dass die AM-HSCs, die isoliert wurden, wie in diesem Video gezeigt, und mit unterschiedlichen Dichten plattiert wurden, ihre Fähigkeit, diskrete Kolonien zu bilden, nach 14 Tagen in Kultur beibehielten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mesenchymalen Stammzellen und makroporöse Biomaterialien abgeben können.