Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die beiden Hauptzellpopulationen, die aus menschlichen Muskelbiopsieproben gewonnen wurden, mit hoher Effizienz und Ausbeute zu trennen, um die Bewertung spezifischer phänotypischer und Transkriptionsfaktor-Marker zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine menschliche Muskelbiopsieprobe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert wird. Nach einer siebentägigen Kultur werden die Zellen durch immunmagnetische Kügelchen getrennt, die in CD 56-positive, myogene Zellen, und CD 56-negative Fraktionen, die Fibroblasten, sortiert werden.

Die Zellen werden dann gefärbt und auf die gewünschten phänotypischen und Proteinmarker von Interesse abgebildet. Letztendlich können Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitative Bildanalyse verwendet werden, um die Intensität ausgewählter nukleärer lokalisierter Transkriptionsfaktoren innerhalb der sortierten Zellpopulationen zu messen. Die Hauptvorteile dieser Technik, die eine immunmagnetische Zellsortierung gegenüber bestehenden Methoden wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung verwendet, bestehen darin, dass sie schonend ist, eine hervorragende Sortierung menschlicher primärer Muskelzellen mit hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit ermöglicht und schnell durchgeführt werden kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein besseres Verständnis der zellulären Grundlagen der Degeneration der Faserfettmuskulatur, die im Alter sowie bei einer Reihe von Muskelpathologien beobachtet wird. Um die aus dem Muskel gewonnenen Vorläuferzellen so schnell wie möglich nach der Biopsie zu isolieren. Bestimmen Sie zunächst das Gewicht der Gewebeprobe und schwellen Sie dann den Muskel mehrmals im Basalmedium an, um die Probe von überschüssigem Blut zu reinigen. Lassen Sie den Muskel 30 bis 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur sedimentieren und saugen Sie dann bis auf die letzten zwei bis drei Milliliter des Mediums alles aus dem Schlauch ab.

Drehen Sie dann das Röhrchen auf eine sterile Petrischale, damit die restliche Flüssigkeit den Muskel auf die Schale transportieren kann. Reinigen Sie nun die Probe von sichtbaren Stücken von offensichtlichem Fett oder Bindegewebe. Drehen Sie dann die Schale, um das restliche Medium zu mobilisieren, und aspirieren Sie dann das gesamte Medium und fügen Sie drei Milliliter einer Kollagenase- und Disbe-Enzymlösung pro 100 bis 400 Milligramm Gewebe hinzu und schneiden Sie die Muskelprobe in sehr kleine ein bis zwei Millimeter große Würfelstücke.

Wenn die Probe ausreichend zerkleinert ist. Verwenden Sie eine breite 25-Milliliter-Pipette, um die Gewebefragmente und die Enzymlösung in ein steriles konisches Röhrchen von 10 bis 20 Millilitern zu überführen. Waschen Sie die Platte mit weiteren drei Millilitern Enzymlösung und übertragen Sie dann mit einer 10-Milliliter-Pipette alle verbleibenden Muskelfragmente in das Röhrchen.

Stellen Sie das Röhrchen 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Die Gewebesuspension alle 15 Minuten mit einer 10-Milliliter-Pipette aufschlagen. Beenden Sie dann die enzymatische Dissoziation mit mindestens einer gleichwertigen Menge frischem, erwärmtem Wachstumsmedium.

Lassen Sie anschließend die Zellsuspension durch einen 100-Mikrometer-Filter, um große Schmutzpartikel zu entfernen, und zentrifugieren Sie dann die Wiederbelebung der Zellen. Suspendieren Sie das Pellet in sieben bis acht Millilitern Wachstumsmedium und inkubieren Sie die Zellen anschließend in einem unbeschichteten T 25-Gewebekulturkolben. 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für sieben Tage.

Am Ende der Woche beäugt Trypsin die Zellmonoschicht für drei Minuten. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie fünf bis 10 Milliliter Skelettmuskelwachstum hinzu, mittel, um eine Überverdauung zu verhindern, und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Reservieren Sie dann nach der Zählung einige der Zellen für die Charakterisierung der Zelllinienmarker und waschen Sie die restlichen Zellen in 15 Millilitern PBS-Zentrifugengewinn.

Dieses Mal resuspendieren Sie das Pellet in 170 Mikrolitern maximalem Sortierpuffer bei Raumtemperatur und pipettieren Sie es vorsichtig zur Reanimation. Suspendieren Sie die Zellen bei 35 Mikrolitern gut gemischter anti CD 56 Antikörper konjugierten magnetischen Mikrokügelchen. Mischen Sie die Zelllösung einige Male mit der Pipette und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei sanfter Vegetation.

Auf halbem Weg nach der Inkubation die Zell- und Bead-Lösung mit 10 Millilitern Sortierpufferzentrifuge und Reus waschen. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem Sortierpuffer. Schmieren Sie anschließend den Vorabscheidefilter und die Säule mit 500 Mikrolitern Sourcing-Puffer

Mischen und übertragen Sie dann sofort den gesamten einen Milliliter Zellsuspension durch den Vortrennfilter in die Säule, spülen Sie die Säule dreimal mit einem Milliliter Sourcing Buffer Power Wash, sammeln Sie die nicht zurückhaltende Fibroblastenfraktion und passieren Sie die Säule in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das eine kleine Menge Wachstumsmedium enthält. Entfernen Sie dann die Säule vom Magneten und drücken Sie den Kolben in die Oberseite der Säule, um die positive Zellfraktion CD 56 zu sammeln. In einem separaten konischen 50-Milliliter-Rohr mit warmem Wachstum wird aus diesem Schritt mittleres Wachstumsmedium emittiert.

Wenn eine doppelte Sortierung durchgeführt werden soll, dann betrachten Sie die positiv und negativ gesammelten Zellfraktionen. Wenn für zusätzliche Reinheit eine doppelte Entnahme erforderlich ist, geben Sie das Medium bei der ersten Sortierung nicht in das Positivsammelröhrchen CD 56, sondern wiederholen Sie die Schritte beginnend mit der Filter- und Säulenschmierung am entsprechenden experimentellen Endpunkt. Fixieren Sie die CD 56-positiven Zellkulturen in ihrem Nährmedium mit einem äquivalenten Volumen eiskaltem Formaldehyd von 8 %.

Die 10 Minuten mit sanfter Vegetation. Aspirieren Sie dann das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um die Antigene der Zelloberfläche immunzu färben. Blockieren Sie die Zellen für mindestens eine Stunde in 1%BSA bei PBS und markieren Sie die Zellen dann mit den relevanten primären und dann sekundären Antikörpern.

Optimieren Sie die Detektorverstärkung, die Laserleistung und die Belichtungseinstellungen, die für Ihr Mikroskop und Ihren Farbstoff relevant sind. Vor der Bildgebung nehmen die Zellen die Bilder der Zellen in der gewünschten Anzahl von Detektionskanälen und in mehr als sechs verschiedenen Sichtfeldern auf. Öffnen Sie zur Analyse die entsprechenden TIFF-Bilddateien und ziehen Sie die Bilder ineinander, um die entsprechenden Kanäle zu überlagern.

Jeder Kanal wird als separate Ebene im Ebenenbedienfeld angezeigt. Wählen Sie als Nächstes im Analysefenster Datenpunkte auswählen und dann Benutzerdefiniert aus, und wählen Sie die gewünschten Messungen aus. Um die nukleare Fluoreszenzintensität zu analysieren, öffnen Sie das Dialogfeld für den Farbbereich und wählen Sie die aufgenommenen Farben aus dem Dropdown-Menü aus.

Halten Sie dann die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie die Töne aus, die für die beschrifteten Kerne spezifisch sind. Klicken Sie auf Speichern, um diese Farbbereichsauswahlmaske für die Verwendung mit anderen Bildern zu speichern, die in derselben Sitzung ausgewählt wurden. Nachdem die Kerne ausgewählt wurden, schreiben Sie einen Klick und wählen Sie Füllung.

Wählen Sie dann Schwarz aus dem Dropdown-Menü und bestätigen Sie, dass die Deckkraft auf 100 % eingestellt ist. Klicken Sie anschließend auf Auswählen und umkehren. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie erneut Füllen und wählen Sie eine weiße Füllung aus dem Dropdown-Menü. Führen Sie einen Watershed-Algorithmus durch, um alle teilweise überlappenden Kerne auf der nun binären Kernschicht zu trennen.

Gehen Sie zu Auswählen, dann zum Farbbereich und dann zu Schatten, um die einzelnen getrennten Kerne auszuwählen. Übertragen Sie dann die Auswahl auf die Ebene, die ein 16-Bit-Graustufenbild des gewünschten Markers enthält, und klicken Sie auf Messungen aufzeichnen. Exportieren Sie abschließend die ausgewählten Messungen als Textdateien in die entsprechende Analysesoftware für die Weiterverarbeitung des Öls.

Die rote Färbung der gereinigten Zellpopulationen in Kombination mit der Immunfärbung auf adipogene und myogene Linienmarker zeigt, dass nur die Fibroblastenfraktion zu einer epigenen Differenzierung fähig ist, wobei die massive Ansammlung von Fett durch die Fibroblasten mit bloßem Auge sichtbar ist und mit einem weiteren Nachweis ihrer vollständigen Umwandlung durch die starke Expression von nukleärem PPAR-Gamma durch diese Zellen bis zum 15. Tag der Behandlung, Diese Zellen haben das verbleibende TE seven A-Bindegewebsantigen an ihr Substrat abgegeben. Im Gegensatz dazu behalten myogene Zellen ihren normalen Phänotyp bei, einschließlich ihrer Expression von Desmin und Myosin-Schwerketten, ohne die nukleäre PPAR-Gamma-Expression hochzuregulieren. In dieser Abbildung ist ein Beispiel für die quantitative Analyse eines Feldes von Desmond-positiven myogenen Zellen und das Feld, aus dem diese Daten gewonnen wurden, dargestellt, das die Variation der myogenen Expression in einzelnen Zellkernen zu diesem spezifischen Aussaatdichte und Zeitpunkt veranschaulicht.

In diesem Diagramm wird die Nützlichkeit der Methode zum direkten Vergleich der Transkriptionsfaktorspiegel in verschiedenen Zelltypen auf Zellebene demonstriert. Zum Beispiel exprimieren diese CD 56-negativen Muskelfibroblasten einen hohen Spiegel des nukleären adipogenen Transkriptionsfaktors PPAR gamma, während verschiedene CD 56-positive myogene Zellen nach Exposition gegenüber Adipozyten-induzierendem Medium nur sehr niedrige Spiegel des nukleären Rezeptor-Transkriptionsfaktors aufrechterhalten. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Muskelbiologie, die Mechanismen von Zellschicksalsentscheidungen in gesunden oder pathologischen menschlichen Muskelproben zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie erstens ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie hohe Ausbeuten an gereinigten und gut charakterisierten menschlichen Muskelzellen erzielen können, und zweitens, wie Sie eine objektive quantitative Analyse von zellulären Bestandteilen durchführen, die durch Immunfluoreszenzfärbung identifiziert wurden.