Name: Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Lernen Sie die Isolierung myogener Zellen und Fibroblasten aus menschlichem Skelettmuskel mittels immunomagnetischer Sortierung. Diese Methode ermöglicht hochreine Zellpopulationen für die quantitative Analyse von Transkriptionsfaktoren.

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Die Autoren danken Carl Hobbs und Lindsey Majoram für ihre technische Unterstützung und Professor Pat Doherty für die Nutzung der Mikroskopieeinrichtungen. Dr. Agley wurde durch ein Stipendium des King's College London unterstützt. Die Finanzierung durch den Spurrell Trust wird ebenfalls anerkannt.

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibres.</a> J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+the+Muscle+Stem+Cell+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche.</a> Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).</li>
<li>Alsharidah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+muscle+precursor+cells+obtained+from+young+and+old+donors+produce+similar+proliferative%2C+differentiation+and+senescent+profiles+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture.</a> Aging Cell. 12, 333-344 (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fibroblasts%2C+but+not+myogenic+cells%2C+readily+undergo+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation.</a> J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138, 3625-3637 (2011).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J. Vis Exp. , e50074(2013).</li>
<li>Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Self-Renewal+and+Commitment+of+Satellite+Stem+Cells+in+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle.</a> Cell. 129, 999-1010 (2007).</li>
<li>Mackey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+satellite+cell+number+and+activity+status+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+a+d+Nerve%22%5BJournal%5D)">Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies.</a> Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+Differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2.</a> J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11, 231-238 (1990).</li>
<li>Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+C+%22Metastasis+Research+Protocols%22">Metastasis Research Protocols</a>. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Analysis+Method+for+the+Precise+Selection+and+Quantitation+of+Fluorescently+Labeled+Cellular+Constituents%3A+Application+to+the+Measurement+of+Human+Muscle+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).</li>
<li>Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+M+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).</li>
<li>Bergström, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man.+Determined+by+neutron+activation+analysis+on+needle+biopsy+specimens.+A+study+on+normal+subjects%2C+kidney+patients%2C+and+patients+with+chronic+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).</li>
<li>Chazaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+attract+monocytes+and+use+macrophages+as+a+support+to+escape+apoptosis+and+enhance+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth.</a> The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).</li>
<li>Abou-Khalil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+and+Paracrine+Angiopoietin+1%2FTie-2+Signaling+Promotes+Muscle+Satellite+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal.</a> Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).</li>
<li>Timpl, R., Kvonder Mark, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+fibronectin+in+selecting+myogenic+versus+fibrogenic+cells+from+skeletal+muscle+cells+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in.</a> 117, 628-635 (1986).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Meth. 2, 910-919 (2005).</li>
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<li>Johnson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+seeing+is+not+believing%3A+improving+the+visibility+of+your+fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).</li>
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<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+39+steps%3A+A+cautionary+tale+of+quantitative+3-D+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy.</a> Biotechniques. 28, 884-887 (2000).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Bareja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%3A+Convergent+and+Divergent+Mechanisms+of+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e90398(2014).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben eine immunomagentic Sortierverfahren für die selektive Anreicherung von menschlichen Muskel-abgeleitete Vorläufer aus kleinen Proben der Muskelbiopsie Material beschrieben. Diese Technik hat sich für die Überwindung der Verlust des menschlichen Muskel-abgeleitete Kulturen auf Fibroblasten von unschätzbarem Wert in unserem Labor, sondern auch für das Verständnis der einzigartigen Verhalten unterschiedliche Populationen von Muskel-Vorläuferzellen abgeleitet. Nachdem gereinigtes myogenen Zellen können Veränderung...

Die Reparatur und Regeneration von Skelettmuskel erfordert die Wirkung von Satellitenzellen 1, die myogene Stammzellen 2,3. In vivo diese Zellen existieren in einem Ruhezustand reversibel zwischen Sarkolemma und Basallamina jedes myofibre befindet sich aber aktiviert zu werden, um zu proliferieren, Sicherung und zu differenzieren, wie Muskelgewebe beschädigt, repariert und regeneriert 3. Satelliten-Zellen können aus jungen und älteren menschlichen Muskel-Biopsie-Proben mit enzymatische Verdauung 4 und deren myogene Eigenschaften isoliert werden anschließend in Primärkultur 5 untersucht werden. Die Effizienz dieses Isolierungsverfahren in Bezug auf sowohl Ausbeute und Reinheit der Zellpopulation abhängig von den verwendeten Verfahren und kann von Probe zu Probe variieren. Die aus enzymatische Verdauung erhalten zwei Haupt adhärenten Zelltypen sind die Satellitenzellen (jetzt genannt myogenen Zellen oder Muskel-Vorläuferzellen), zunächst als CD56 + / Desmin Zellen und mu identifiziertscle abgeleiteten Fibroblasten, wie CD56 identifiziert - und TE7 + Zellen 5. Fibroblasten haben eine schnelle Proliferationsrate und keine irreversiblen Wachstumsstillstand und terminale Differenzierung bei der Zell-Zell-Kontakt wie myogenen Zellen zu unterziehen; damit in Mischpopulationen kann Fibroblasten myogenen Zellen überlaufen, um die Kultur zu dominieren. Fibroblasten wurden oft als eine Irritation für Muskel Biologen angesehen, aber es ist jetzt ein wachsendes Interesse an Fibroblasten-Zellen eine Untersuchung wert in ihrem eigenen Recht, vor allem, da sie gezeigt haben, um eine kooperative Rolle mit myogenen Zellen im Muskel-Reparatur 6 haben . Die Isolierung und Reinigung von verschiedenen Zelltypen aus menschlichem Muskel ist damit ein wichtiger methodischen Betrachtung beim Versuch, den angeborenen Verhalten beider Zellarten in Kultur zu untersuchen. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein Verfahren, durch das Zellen für eine weitere Untersuchung nach und / oder gezählt undanalysiert. FACS wurde gezeigt, zuverlässig zu bereichern menschlichen myogenen Zellen, aber die Ausbeute an Zellen für die anschließende Kultur bisher nicht hoch 7. Angesichts der begrenzten Replikationspotenzial der Körperzellen wie Satelliten-Zellen abgeleiteten myogenen Zellen und die ganz Armen Proliferation und Differenzierung mit Seneszenz 4 verbunden sind, werden sanfter Ansätze erforderlich. Einzelne Muskelfaserkulturen bieten eine andere, weniger aggressiv, bedeutet der Erhalt murine Satellitenzellen noch in den sublaminalen Nische und nach ihrer Aktivierung in der Kultur 8,9 ansässig. Dies ist jedoch häufig nicht möglich, aus der menschlichen Muskelbiopsie Material (weil Fasern können selten von Sehne zu Sehne erhalten werden), was bedeutet, dass diese Technik möglicherweise nicht für viele Forschungslabors Interesse an einem Studium menschlichen Muskel-abgeleitete Zellen sein. Darüber hinaus liefert die Einzelfaser-Technik nur sehr begrenzt Zellzahlen. Hier beschreiben wir ein System zur Sortierung auf der Basis des Generatortle enzymatische Verdauung von Zellen unter Verwendung von Collagenase und Dispase durch zwei aufeinanderfolgende Runden der magnetischen Zellsortierung (MACS), das sowohl eine hohe Reinheit (&gt; 95% myogenen Zellen) und Ausbeute (~ gibt anschließend 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 Zellen / g Gewebe) für Experimente in der Kultur. CD56 wird als Goldstandard Oberflächenmarker zur Identifizierung von menschlichen Satellitenzellen in situ 10 und in vitro 11 und stellt die ideale Oberflächenmarker Kandidat Wulst Befestigung. Bei diesem Ansatz CD56 Antikörpern zu Eisenoxid und polysaccharidhaltigen superparamagnetische Perlen werden zu den Zellen durch eine Hochgradienten-Magnetzellseparationssäule in einem starken Magnetfeld 12,13 angeordnet gebunden geleitet konjugiert. Die Trennsäulen sind mit einer Matrix aus ferromagnetischen Stahlwolle oder Eisenkugeln, die magnetischen Feldlinien in Richtung ihrer Fläche, die starke Magnetfeldgradienten (~ 4tesla) konzentrieren dienen gefüllte 14. In diesen Spalten auch leicht magnetisch Zellen werden angezogen und auf ihrer Oberfläche 14 adsorbiert. Unbound (CD56 -) Zellen durch die Säule, während CD56 + Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen gekennzeichnet sind, bis zur Entfernung aus dem Magnetfeld 12,15 beibehalten. Zellsuspensionen aus jeder Stufe des Sortierprozesses kann bei der gewünschten Dichte für weitere Experimente plattiert werden. Nach einer bestimmten Intervention die zellulären Bestandteile mittels Immunzytochemie ermittelt werden, aufgenommen mit Weitfeld oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und unter Verwendung eines Bildanalyseansatz, die einen schnellen objektive Messung aller markierten Zellen in einem gegebenen Bild ermöglicht quantitativ analysiert. In unserem Labor haben wir diese doppelte immun Sortierung Ansatz gefolgt von Bildanalyse 16 verwendet haben, dass CD56 zeigen - menschlichen Fibroblasten leicht in Fettzellen transdifferen, während myogenen Zells von satelliten Ursprungs sind sehr widerstandsfähig gegen diese adipogenen Umwandlungs 5.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase&nbsp; D</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11088866001</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>Muss vor Gebrauch filtersterilisiert werden</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA(</td><td>Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; m cell Sieb</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenlösung ( 3 mg/ml in 0,1% Essigsäure)</td><td>Sigma, Dorset, UK</td><td>C8919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Minisart SRP15 Spritzenvorsatzfilter (0,2 &#956; m)</td><td>Sartorius</td><td>17573ACK</td><td>Polytetrafluorethylen (PTFE) Membran</td></tr><tr><td>CD56 menschliche Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-401</td><td>Beachten Sie die begrenzte Haltbarkeit von Mikrokügelchen</td></tr><tr><td>Anti-Fibroblasten-Mikrokügelchen, menschlich</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Vorabscheidefilter</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Großzellen-Säulen</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>Diese Säulen sind mit einem Strömungswiderstand ausgestattet. Die Verwendung des Strömungswiderstandes ist nicht notwendig, um die hier beschriebenen hohen myogenen Reinheiten zu erhalten.</td></tr><tr><td>LS-Spalten&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MiniMacs Seperator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>Dieser Separator passt in die Großzellen-Säule, aber nicht in die LS-Säule.&nbsp;</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td>Muss vor Gebrauch filtersterilisiert werden</td></tr><tr><td>Öl Rot O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td> Triethylphosphat Sigma 538728 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper</td><td>Sigma</td><td>Z241121-1PAK</td><td>Nr. 42, Aschelos. Um den Filter vorzubereiten, falten Sie das kreisförmige Filterpapier zu einem Halbkreis und falten Sie den Halbkreis dann wieder in der Mitte, um eine Kegelform zu bilden. Setzen Sie den Kegel zum Filtern in einen Trichter ein.</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagenz</td><td>Molekulare Sonden, Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Dies kann mit oder ohne DAPI erworben werden und löscht die anfängliche Fluoreszenz nicht.</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>Kontakt Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended</td><td>Adobe (gekauft bei Pugh Computers)</td><td>ADPH16982*&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von quantitative immunzytochemische primäre myogenen zellen und fibroblasten aus menschlichen skelettmuskel

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Die Reparatur und Regeneration von Skelettmuskel erfordert die Wirkung von Satellitenzellen, die die residenten Muskelstammzellen sind. Diese können von menschlichen Muskel-Biopsie-Proben mit enzymatische Verdauung und deren myogene Eigenschaften untersucht in der Kultur isoliert werden. Quantitativ sind die aus der enzymatischen Verdauung erhaltenen beiden Haupt adhärenten Zelltypen: (i) die Satellitenzellen (genannt myogenen Zellen oder Muskel-Vorläuferzellen), zunächst als CD56 + identifiziert und später als CD56 + / Desmin + Zellen und (ii) Muskel- Fibroblasten, wie CD56 identifiziert - und TE-7 +. Fibroblasten vermehren sehr effizient in der Kultur und in gemischten Zellpopulationen diese Zellen myogenen Zellen, die Kultur zu dominieren überrannt. Die Isolierung und Reinigung der verschiedenen Zelltypen von menschlichen Muskel ist somit ein wichtiger methodischer Berücksichtigung, wenn sie versuchen, um die angeborene Verhalten der beiden Zelltypen in Kultur zu untersuchen. Hier descr wirIBE ein System der Sortierung auf der Basis der sanften enzymatische Verdauung von Zellen unter Verwendung von Collagenase und Dispase durch magnetische Zellsortierung (MACS), unter dessen gibt sowohl eine hohe Reinheit (&gt; 95% myogenen Zellen) und guter Ausbeute (~ 2,8 × 10 6 ± 8,87 x 10 5 Zellen / g Gewebe nach 7 Tagen in vitro) für Experimente in der Kultur. Dieser Ansatz basiert auf Inkubieren der gemischten Muskel abstammenden Zellpopulation mit magnetischen Mikrokügelchen Kügelchen mit einem Antikörper gegen CD56, konjugiert und dann vorbei Zellen wenn ein Magnetfeld beruht. CD56 + Zellen an Mikrokügelchen gebunden sind durch das Feld während CD56 behielt - Zellen durch die Säule ungehindert. Zellsuspensionen aus jeder Stufe des Sortierprozesses kann plattiert und kultiviert werden. Nach einer bestimmten Intervention, die Zellmorphologie und die Expression und die Lokalisierung von Proteinen einschließlich Kerntranskriptionsfaktoren unter Verwendung von Immunfluoreszenz-Markierung mit spezifischen Antikörpern und einem Bild p quantifizierenrocessing und Analysepaket.

Gereinigtes myogenen Zellen und Fibroblasten in adipogene Differenzierungsmedium für drei Tage, gefolgt von adipogene Nährmedium von überall zwischen 7-30 Tage, um ihr Potenzial für die Adipogenese beurteilen kultiviert werden. Verwendung der gereinigten Zellpopulationen, Oil Red-O-Färbung in Kombination mit Immunfärbung für adipogenen und myogenen Marker zeigte, daß nur die Fibroblasten-Anteil geeignet adipogene Differenzierung (Abbildung 2) war. Die massive Anhäufung von Fett durch die Fibroblasten is...

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die beiden Hauptzellpopulationen, die aus menschlichen Muskelbiopsieproben gewonnen wurden, mit hoher Effizienz und Ausbeute zu trennen, um die Bewertung spezifischer phänotypischer und Transkriptionsfaktor-Marker zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine menschliche Muskelbiopsieprobe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert wird. Nach einer siebentägigen Kultur werden die Zellen durch immunmagnetische Kügelchen getrennt, die in CD 56-positive, myogene Zellen, und CD 56-negative Fraktionen, die Fibroblasten, sortiert werden.Die Zellen werden dann gefärbt und auf die gewünschten phänotypischen und Proteinmarker von Interesse abgebildet. Letztendlich können Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitative Bildanalyse verwendet werden, um die Intensität ausgewählter nukleärer lokalisierter Transkriptionsfaktoren innerhalb der sortierten Zellpopulationen zu messen. Die Hauptvorteile dieser Technik, die eine immunmagnetische Zellsortierung gegenüber bestehenden Methoden wie der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung verwendet, bestehen darin, dass sie schonend ist, eine hervorragende Sortierung menschlicher primärer Muskelzellen mit hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit ermöglicht und schnell durchgeführt werden kann.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein besseres Verständnis der zellulären Grundlagen der Degeneration der Faserfettmuskulatur, die im Alter sowie bei einer Reihe von Muskelpathologien beobachtet wird. Um die aus dem Muskel gewonnenen Vorläuferzellen so schnell wie möglich nach der Biopsie zu isolieren. Bestimmen Sie zunächst das Gewicht der Gewebeprobe und schwellen Sie dann den Muskel mehrmals im Basalmedium an, um die Probe von überschüssigem Blut zu reinigen. Lassen Sie den Muskel 30 bis 60 Sekunden lang bei Raumtemperatur sedimentieren und saugen Sie dann bis auf die letzten zwei bis drei Milliliter des Mediums alles aus dem Schlauch ab.Drehen Sie dann das Röhrchen auf eine sterile Petrischale, damit die restliche Flüssigkeit den Muskel auf die Schale transportieren kann. Reinigen Sie nun die Probe von sichtbaren Stücken von offensichtlichem Fett oder Bindegewebe. Drehen Sie dann die Schale, um das restliche Medium zu mobilisieren, und aspirieren Sie dann das gesamte Medium und fügen Sie drei Milliliter einer Kollagenase- und Disbe-Enzymlösung pro 100 bis 400 Milligramm Gewebe hinzu und schneiden Sie die Muskelprobe in sehr kleine ein bis zwei Millimeter große Würfelstücke.Wenn die Probe ausreichend zerkleinert ist. Verwenden Sie eine breite 25-Milliliter-Pipette, um die Gewebefragmente und die Enzymlösung in ein steriles konisches Röhrchen von 10 bis 20 Millilitern zu überführen. Waschen Sie die Platte mit weiteren drei Millilitern Enzymlösung und übertragen Sie dann mit einer 10-Milliliter-Pipette alle verbleibenden Muskelfragmente in das Röhrchen.Stellen Sie das Röhrchen 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Die Gewebesuspension alle 15 Minuten mit einer 10-Milliliter-Pipette aufschlagen. Beenden Sie dann die enzymatische Dissoziation mit mindestens einer gleichwertigen Menge frischem, erwärmtem Wachstumsmedium.Lassen Sie anschließend die Zellsuspension durch einen 100-Mikrometer-Filter, um große Schmutzpartikel zu entfernen, und zentrifugieren Sie dann die Wiederbelebung der Zellen. Suspendieren Sie das Pellet in sieben bis acht Millilitern Wachstumsmedium und inkubieren Sie die Zellen anschließend in einem unbeschichteten T 25-Gewebekulturkolben. 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für sieben Tage.Am Ende der Woche beäugt Trypsin die Zellmonoschicht für drei Minuten. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie fünf bis 10 Milliliter Skelettmuskelwachstum hinzu, mittel, um eine Überverdauung zu verhindern, und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Reservieren Sie dann nach der Zählung einige der Zellen für die Charakterisierung der Zelllinienmarker und waschen Sie die restlichen Zellen in 15 Millilitern PBS-Zentrifugengewinn.Dieses Mal resuspendieren Sie das Pellet in 170 Mikrolitern maximalem Sortierpuffer bei Raumtemperatur und pipettieren Sie es vorsichtig zur Reanimation. Suspendieren Sie die Zellen bei 35 Mikrolitern gut gemischter anti CD 56 Antikörper konjugierten magnetischen Mikrokügelchen. Mischen Sie die Zelllösung einige Male mit der Pipette und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei sanfter Vegetation.Auf halbem Weg nach der Inkubation die Zell- und Bead-Lösung mit 10 Millilitern Sortierpufferzentrifuge und Reus waschen. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem Sortierpuffer. Schmieren Sie anschließend den Vorabscheidefilter und die Säule mit 500 Mikrolitern Sourcing-Puffer.Mischen und übertragen Sie dann sofort den gesamten einen Milliliter Zellsuspension durch den Vortrennfilter in die Säule, spülen Sie die Säule dreimal mit einem Milliliter Sourcing Buffer Power Wash, sammeln Sie die nicht zurückhaltende Fibroblastenfraktion und passieren Sie die Säule in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das eine kleine Menge Wachstumsmedium enthält. Entfernen Sie dann die Säule vom Magneten und drücken Sie den Kolben in die Oberseite der Säule, um die positive Zellfraktion CD 56 zu sammeln. In einem separaten konischen 50-Milliliter-Rohr mit warmem Wachstum wird aus diesem Schritt mittleres Wachstumsmedium emittiert.Wenn eine doppelte Sortierung durchgeführt werden soll, dann betrachten Sie die positiv und negativ gesammelten Zellfraktionen. Wenn für zusätzliche Reinheit eine doppelte Entnahme erforderlich ist, geben Sie das Medium bei der ersten Sortierung nicht in das Positivsammelröhrchen CD 56, sondern wiederholen Sie die Schritte beginnend mit der Filter- und Säulenschmierung am entsprechenden experimentellen Endpunkt. Fixieren Sie die CD 56-positiven Zellkulturen in ihrem Nährmedium mit einem äquivalenten Volumen eiskaltem Formaldehyd von 8 %.Die 10 Minuten mit sanfter Vegetation. Aspirieren Sie dann das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um die Antigene der Zelloberfläche immunzu färben. Blockieren Sie die Zellen für mindestens eine Stunde in 1%BSA bei PBS und markieren Sie die Zellen dann mit den relevanten primären und dann sekundären Antikörpern.Optimieren Sie die Detektorverstärkung, die Laserleistung und die Belichtungseinstellungen, die für Ihr Mikroskop und Ihren Farbstoff relevant sind. Vor der Bildgebung nehmen die Zellen die Bilder der Zellen in der gewünschten Anzahl von Detektionskanälen und in mehr als sechs verschiedenen Sichtfeldern auf. Öffnen Sie zur Analyse die entsprechenden TIFF-Bilddateien und ziehen Sie die Bilder ineinander, um die entsprechenden Kanäle zu überlagern.Jeder Kanal wird als separate Ebene im Ebenenbedienfeld angezeigt. Wählen Sie als Nächstes im Analysefenster Datenpunkte auswählen und dann Benutzerdefiniert aus, und wählen Sie die gewünschten Messungen aus. Um die nukleare Fluoreszenzintensität zu analysieren, öffnen Sie das Dialogfeld für den Farbbereich und wählen Sie die aufgenommenen Farben aus dem Dropdown-Menü aus.Halten Sie dann die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie die Töne aus, die für die beschrifteten Kerne spezifisch sind. Klicken Sie auf Speichern, um diese Farbbereichsauswahlmaske für die Verwendung mit anderen Bildern zu speichern, die in derselben Sitzung ausgewählt wurden. Nachdem die Kerne ausgewählt wurden, schreiben Sie einen Klick und wählen Sie Füllung.Wählen Sie dann Schwarz aus dem Dropdown-Menü und bestätigen Sie, dass die Deckkraft auf 100 % eingestellt ist. Klicken Sie anschließend auf Auswählen und umkehren. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie erneut Füllen und wählen Sie eine weiße Füllung aus dem Dropdown-Menü. Führen Sie einen Watershed-Algorithmus durch, um alle teilweise überlappenden Kerne auf der nun binären Kernschicht zu trennen.Gehen Sie zu Auswählen, dann zum Farbbereich und dann zu Schatten, um die einzelnen getrennten Kerne auszuwählen. Übertragen Sie dann die Auswahl auf die Ebene, die ein 16-Bit-Graustufenbild des gewünschten Markers enthält, und klicken Sie auf Messungen aufzeichnen. Exportieren Sie abschließend die ausgewählten Messungen als Textdateien in die entsprechende Analysesoftware für die Weiterverarbeitung des Öls.Die rote Färbung der gereinigten Zellpopulationen in Kombination mit der Immunfärbung auf adipogene und myogene Linienmarker zeigt, dass nur die Fibroblastenfraktion zu einer epigenen Differenzierung fähig ist, wobei die massive Ansammlung von Fett durch die Fibroblasten mit bloßem Auge sichtbar ist und mit einem weiteren Nachweis ihrer vollständigen Umwandlung durch die starke Expression von nukleärem PPAR-Gamma durch diese Zellen bis zum 15. Tag der Behandlung, Diese Zellen haben das verbleibende TE seven A-Bindegewebsantigen an ihr Substrat abgegeben. Im Gegensatz dazu behalten myogene Zellen ihren normalen Phänotyp bei, einschließlich ihrer Expression von Desmin und Myosin-Schwerketten, ohne die nukleäre PPAR-Gamma-Expression hochzuregulieren. In dieser Abbildung ist ein Beispiel für die quantitative Analyse eines Feldes von Desmond-positiven myogenen Zellen und das Feld, aus dem diese Daten gewonnen wurden, dargestellt, das die Variation der myogenen Expression in einzelnen Zellkernen zu diesem spezifischen Aussaatdichte und Zeitpunkt veranschaulicht.In diesem Diagramm wird die Nützlichkeit der Methode zum direkten Vergleich der Transkriptionsfaktorspiegel in verschiedenen Zelltypen auf Zellebene demonstriert. Zum Beispiel exprimieren diese CD 56-negativen Muskelfibroblasten einen hohen Spiegel des nukleären adipogenen Transkriptionsfaktors PPAR gamma, während verschiedene CD 56-positive myogene Zellen nach Exposition gegenüber Adipozyten-induzierendem Medium nur sehr niedrige Spiegel des nukleären Rezeptor-Transkriptionsfaktors aufrechterhalten. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Muskelbiologie, die Mechanismen von Zellschicksalsentscheidungen in gesunden oder pathologischen menschlichen Muskelproben zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie erstens ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie hohe Ausbeuten an gereinigten und gut charakterisierten menschlichen Muskelzellen erzielen können, und zweitens, wie Sie eine objektive quantitative Analyse von zellulären Bestandteilen durchführen, die durch Immunfluoreszenzfärbung identifiziert wurden.

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Research

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Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Die Myofibroblasten ist ein einfluss Stromazellen des Magen-Darm-Trakt, die wichtige physiologische Prozesse in normalen und Krankheitszustände regelt. Wir beschreiben eine Technik, die für die Isolierung von primären Myofibroblasten aus Maus und menschlichen Dickdarmgewebe, das für die in vitro Experimente verwendet werden können, ermöglicht.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung von Primärkulturen von murinen und humanen ösophagealen Stromazellen mit einem Myofibroblasten-Phänotyp. Kultivierte Zellen haben eine spindelförmige Morphologie, exprimieren α-SMA und Vimentin und es fehlen epitheliale, hämatopoetische und endotheliale Zelloberflächenmarker. Charakterisierte Stromazellen können in funktionellen Studien zu epithelial-stromalen Wechselwirkungen verwendet werden.

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung lebender Zellen und zur Primärkultur von myogenen und Fibroblasten-Zelllinien aus Muskel- oder Hautgewebe.  Auch eine Technik zur Immortalisierung dieser Zelllinien wird beschrieben.  Insgesamt bieten diese Protokolle ein zuverlässiges Werkzeug zur Erzeugung und Konservierung von patienteneigenen Zellen für nachgelagerte Anwendungen.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden.  hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakter einzelner Muskelfasern aus dem oxidativen Soleus und die Einrichtung hochgereinigter Myoblastkulturen, die aus diesen Fasern gewonnen wurden. Das optimierte Verfahren liefert zuverlässig etwa 300–500 intakte Myofasern pro Maus, was nachgelagerte molekulare und zelluläre Analysen ermöglicht.

Einzelfaser-Isolationstest zur Beurteilung des oxidativen Myofaserverhaltens

Lernen Sie die Isolierung myogener Zellen und Fibroblasten aus menschlichem Skelettmuskel mittels immunomagnetischer Sortierung. Diese Methode ermöglicht hochreine Zellpopulationen für die quantitative Analyse von Transkriptionsfaktoren.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel (Video) | JoVE Journal

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

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