Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente ist es, DNA und Proteine spezifisch mit Hilfe von Methyltransferasen zu markieren, die auf natürliche Weise die aktivierte Methylgruppe und den Cofaktor Sile l Methionin, genannt aome, auf D-N-A-R-N-A übertragen. Proteine oder kleine Biomoleküle. Die Markierung in einem Schritt wird erreicht, indem der natürliche Cofaktor omit durch synthetische Ain-Cofaktoren ersetzt wird, die den Verlauf der Reaktion verändern, was zu einer enzymatischen Kopplung des gesamten Cofaktors und damit zu einer kovalenten Markierung der Substratsequenz führt. Die spezifische Methyltransferase-induzierte Markierung der DNA wird mit der adinspezifischen DNA-Methyltransferase, M-B-S-E-C, demonstriert. die den biotinylierten Ain-Cofaktor sechs BAZ an die A-G-C-G-A-T-Erkennungssequenz koppelt, die zu einer Sequenz führt, spezifisch biotinylierte, DNA-Methyltransferase-gerichtete Übertragung aktivierter Gruppen ist die Verwendung von Markierungsprotein und wird unter Verwendung von MTAs Satz sieben neun demonstriert, der eine Pro-Pargo-Gruppe von C acht oin auf Lysin vier von Histon H drei überträgt.

Der alkylierte Lysinrest wird durch ein azi-modifiziertes Fluor unter Verwendung einer kupferkatalysierten Click-Chemie chemisch markiert, was zu einem spezifisch markierten Protein führt. Ein Vorteil der Verwendung von Meth-Transferasen für die Markierung besteht darin, dass sie das Potenzial haben, direkt auf native Substrate abzuzielen. Ich werde dies durch sequenzspezifische bioTE-Elation von Plasmid, DNA-Meth-Transferase und katalysierter Proteinmodifikation mit dem Cofaktor-Analogon zin demonstrieren und die Einführung einer Vielzahl von Reportergruppen in zwei Schritten ermöglichen.

Ich werde dies durch Fluoreszenzmarkierung des Proteins Hhison H drei demonstrieren und Ergebnisse durch Markierung von H drei mit Biotin zeigen. Darüber hinaus können doppelt aktivierte Cofaktor-Laufanaloga leicht synthetisiert werden, indem S ail, el Homocystein, das Cofaktorprodukt nach dem Methylgruppentransfer mit verschiedenen aktivierten Alkoholen geladen wird. Die synthetischen Cofaktor-Analoga werden durch Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt, und in einigen Fällen ist es sogar möglich, den epi Mars bei Schwefel zu trennen.

Smiling DNA ist eine sequenzspezifische Methyltransferase-induzierte Markierung von DNA. Hier wird das Konzept durch die Markierung von PB 3 22-Plasmid-DNA mit sechs BAZ-Ain-Cofaktoren und der Adine-spezifischen DNA-Methyltransferase demonstriert. M-B-S-E-C beginnt man damit, die sechs BAZ bei 20 Grad Celsius zu schlagen.

Einmal gedacht, repariere das Reaktionsgemisch auf Eis. Es enthält ein Mikrogramm Plasmid, 60 Mikromolare von sechs BAZ und 10 Äquivalente von M-B-S-E-C eins. HER-Erkennungssequenz auf der DNA im Modifikationspuffer.

Achte darauf, dass du die sechs BAZ und M-B-S-E-C zuletzt hinzufügst. Stellen Sie sicher, dass kein AME an die Meth-Transferase gebunden ist, die Sie verwenden, da der natürliche Cofaktor die Markierung blockiert. React For-Steuerelemente.

Ersetzen Sie die MTAs durch Wasser, um unspezifische Cofaktor-Modifikationen sichtbar zu machen, und fügen Sie Wasser anstelle des Cofaktors hinzu, um den natürlichen Cofaktor im Enzymkonzentrat zu testen. Mischen Sie nun die Reaktionen vorsichtig mit einer Pipette und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius. Gegen Ende der Inkubation reparieren Sie ein Endonuklease-Gemisch auf Eis, indem Sie 10 Mikroliter 10 x rekombinanten Tach, einen Puffer auf 80 Mikroliter Wasser und dann 3,3 Mikroliter rekombinante Tak-One-Restriktionsendonuklease hinzufügen.

Ziehen Sie nach der Inkubation die Reaktionen mit einer schnellen Drehung und überprüfen Sie dann die DNA-Modifikation an jeder einzelnen. Fügen Sie zwei Mikroliter 10 x tak, einen Puffer und 28 Mikroliter des Endonuklease-Gemischs hinzu. Mischen Sie die Reaktionen durch vorsichtiges Pipettieren.

Inkubieren Sie nun die Reaktionen bei 65 Grad Celsius für eine halbe Stunde. Wenn die Reaktionen abgeschlossen sind, ziehen Sie die Lösung mit einem schnellen Schleudern und sammeln Sie 25 Mikroliter der Reaktionen in neuen Röhrchen. Zu diesen Aliquoten fügen Sie 2,4 Mikroliter Streptokokken TTR hinzu, gepuffert mit einem Millimolar pro Monomer Streptokokkenadin.

Inkubieren Sie diese Reaktion nun eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nach der Inkubation fünf Mikroliter sechs x Ladepuffer zu den abgeschlossenen Reaktionen hinzu und lassen Sie 10 Mikroliter auf einem 1%igen Agros-Gel bei 80 Volt für etwa eine Stunde laufen. Dann visualisieren Sie die Banden mt A ist die Abkürzung für Methyltransferase directed transfer of activated groups.

In dieser Demonstration setzte der Methyltransferase-Satz sieben, neun und den doppelt aktivierten Cofaktor C acht. Oin werden verwendet, um Lysin vier seiner Histon H drei zu markieren. Nach dem Auftauen der Komponenten auf Eis reparieren 20 Mikroliter Reaktionsgemische, enthält die Assay-Lösung den Modifikationspuffer 10 Mikromolar des Histons H drei und die letzten 10 Mikromolar Methyltransferasen plus 600 Mikromolar Cofaktor.

Nehmen Sie eine Enzymkontrolle vor, indem Sie das C acht ON durch deionisiertes Wasser ersetzen. Erstellen Sie auch eine Cofaktor-Steuerung, um unspezifische Modifikationen zu visualisieren, indem Sie 60 Millimolar ADO-met einbeziehen, um mit den synthetischen Cofaktoren zu konkurrieren. Mischen Sie nun die Reaktionen mit Slow Pipe Pesting und überprüfen Sie ihren pH-Wert mit Teststreifen. Doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden unter C-Bedingungen gespeichert.

Daher kann sich der pH-Wert Ihrer Reaktionslösung ändern, indem Sie bei Bedarf Co-Faktor in kleinen Mengen von 50 Millimolar Natriumhydroxid hinzufügen, um den pH-Wert einzustellen. Inkubieren Sie nun die Reaktionen während der Inkubationsreparatur zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Ein 12%iges SDS-Polyacrylamid-Gel kurz vor dem Ende der Inkubation stellen Sie 20 Mikroliter Fünf-X-Klick-Mix her, der drei Millimolare Kupfersulfat, drei Millimolare T-H-P-T-A-Ligand 250 Millimolar, Natrium-ACO-Köder und sechs Millimolare Tamara-Azid enthält.

Am Ende der Inkubation fügen Sie jeder Reaktion fünf Mikroliter der Klickmischung hinzu und mischen Sie die Reaktionen langsam pro Petting. Schützen Sie die Reaktionen mit Folie vor Licht und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 20 Grad Celsius. Entfernen Sie nach einer Stunde das überschüssige Chloroform, indem Sie die Proteine ausfällen.

Zu jeder Reaktion 75 Mikroliter Methanol, 18,7 Mikroliter Chloroform und 50 Mikroliter Wasser geben und nach jeder Zugabe kurz wirbeln. Nachdem Sie jede Tube vorbereitet haben, schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 16.000 g herunter. Entfernen Sie die obere Phase der Trennung, ohne die Grenzschicht, die die Proteine enthält, zu stören.

Fügen Sie nun 56,3 Mikroliter Methanole, die untere Phase und den Wirbel hinzu. Als nächstes drehen Sie es herunter, um das Protein zu pelletieren und das Supinat zu verwerfen. Fügen Sie dann 56,3 Mikroliter Methanol hinzu.

Nochmal, Vortex. Wiederholen Sie das Schleudern und holen Sie die Pellets zurück. Lassen Sie die Pellets in ihren Röhren trocknen, ohne Deckel und mit fusselfreiem Papier abgedeckt.

Lösen Sie die Proteine später in 20 Mikrolitern SDS-Ladepuffer mit Ladefarbstoff auf. Spülen Sie die Rohrwände mit dem Puffer ab, um das Pellet aufzufangen. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten.

Sobald die Röhrchen Raumtemperatur erreicht haben, geben Sie sie kurz auf, um ihren Inhalt zu ziehen und die Proteine anhand der SDS-Seite zu visualisieren. Laufen Sie mit 120 Volt für ca. 90 Minuten. Die lächelnde Reaktion wurde mit der DNA-Methyltransferase M-B-S-E-C one durchgeführt, die den zweiten Adeninrest innerhalb der doppelsträngigen A-T-C-G-A-T-Sequenz modifiziert und eine Erkennungsstelle auf dem PBR 3 2 2-Plasmid aufweist, die rot markiert ist, um die Plasmidmarkierung zu testen.

PB 3 2 2 wurde mit der rekombinanten Restriktion ENDONUCLEASE T one herausgefordert, die sieben grün markierte Stellen auf PB 3 22 aufweist, von denen eine in der M-B-S-E-C one Site enthalten ist. Bei der Markierung sollte diese Stelle vor Spaltung im Gel geschützt werden. Dies hat sich bestätigt.

Ein neues Fragment mit 683 Basenpaaren tauchte auf, was zeigt, dass es eine Markierung an der ersten Stelle von M-B-S-E-C gab. Dies ist nur in der Prüfspur zu beobachten, bei der es sich um Spur drei handelt. Die Spezifität der Markierungsreaktion wurde durch die Verschiebung der Elektromobilität nachgewiesen.

Nach Zugabe von streptem Adin war die Elektromobilität des mit Biotin markierten 683-Basenpaarfragments verzögert. Während die Beweglichkeit der Fragmente ohne das M-B-S-E-C an einer Stelle unverändert blieb, oder eine zweistufige Markierung von Methyltransferase-Substraten mit doppelt aktivierten acht oh met-Analoga. Es wurden das Histon H drei Lysin vier Methyltransferase-Set sieben neun und der kleine C acht ON Cofaktor verwendet.

Die Gelelektrophorese wurde für die Fluoreszenzdetektion nur auf der Assay-Spur verwendet. Spur eins zeigte eine fluoreszierende Bande, die Histon H drei entsprach, was darauf hindeutet, dass die Seitenkette des Cofaktors spezifisch übertragen und das modifizierte Protein mit der Tamara Flora markiert wurde.Four. Der ESI-Fleck dient als Beladungskontrolle.

Alle Lanes wiesen die gleiche Menge an Protein auf. Methyltransferase-Substrate können auch mit Biotinreaktionen mit einem von AZI abgeleiteten Biotin markiert werden. Anstelle eines Fluors wurden sie durch Western Blotting mit Meerrettichperoxidase untersucht.

Konjugierte Aden erfolgreiche und spezifische Etikettierung wurde nach dem Ansehen dieses Videos gesehen. Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie DNA- und Proteinsequenzen markiert werden, insbesondere mit Affinitätstext, Fluor-Kraft oder anderen Markierungen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass andere met und ihre Analoga temperaturempfindlich sind.

Fassen Sie sie immer auf Eis an und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Ich habe doppelt aktiviert synthetisiert. Andere MET-Analoga mit der Reportergruppe waren bereits in die Seitenkette eingebaut und nutzten sie, um DNA in einem Schritt spezifisch zu markieren.

Besonders begeistert bin ich von der Aussicht, verschiedene Enzyme und Berichtsgruppen für die DNA-Kartierung mit Hilfe von Einzelmolekültechniken zu kombinieren. Smiling und NEC sind sehr flexibel, und fast alle chemischen Gruppen können nicht nur auf DNA und Proteine, sondern auch auf RNA und kleine mit geeigneten Meth-Transfers übertragen werden.