Name: Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Lernen Sie die selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA mittels β-Glucosyltransferase und Click-Chemie. Diese dichteunabhängige Methode ermöglicht die effiziente Anreicherung für epigenomische Hochdurchsatzanalysen.

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Diese Studie wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (GM071440 nach CH und NS051630/MH076090/MH078972 PJ) unterstützt.

Ein. Genomic DNA-Fragmentierung Fragment genomischer DNA unter Verwendung von Ultraschallbehandlung auf einen gewünschten Größenbereich für das Genom-weite Sequenzierplattform geeignet. (Wir gehen normalerweise in ~ 300 bp beschallen.) Überprüfen Sie die Größenverteilung der fragmentierten genomischen DNA auf einem 1% Agarosegel (Abbildung 1). 2. DNA-Präparation Bestimmen Sie die Ausgangs-DNA Mengen auf die Fülle der 5-HMC in genomischer DNA. Da 5-HMC Ebenen sind in den einzelnen Gewebearten hängen Ausgangs-DNA Mengen auf den 5-HMC Pegeln der Abtastwerte. Siehe Tabelle 1 für Beispiele. 3. β-GT katalysierte Reaktion (Glucose-Transfer-Reaktions) <ol><li> Mischung durch Pipettieren der Mischung, wie in Tabelle 2 und inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad für 1 Stunde. </li><li> Nach der Inkubation bereinigen die Reaktion mit QIAquick Nucleotide Removal Kit mit 10 ug DNA proSpalte. Eluieren mit 30 ul Wasser pro Spalte und kombinieren. </li></ol> 4. Biotinylierungsreaktion (Klick-Chemie) <ol><li> Hinzufügen DBCO-SS-PEG3-Biotin-Konjugat-Arbeitslösung (1 mM) in der eluierten DNA-Lösung (aus Stufe 3) bis zu einer Endkonzentration von 150 pM (dh 5 ul Arbeitslösung pro 30 ul DNA-Lösung). </li><li> Mix durch Pipettieren und inkubieren in einem 37 ° C warmen Wasserbad für 2 Stunden. </li><li> Reinigen Sie die Reaktion mit QIAquick Nucleotide Removal Kit. Die ideale insgesamt Elutionsvolumen beträgt 100 ul. </li><li> Quantifizierung der gewonnenen DNA Menge mit Mikrolitermaßstab Spektralphotometer (zB., NanoDrop). </li></ol> 5. Erfassen von 5-HMC-haltige DNA <ol><li> Waschen 50 ul Dynabeads MyOne Streptavidin C1 3-mal mit 1 ml 1X B &amp; W-Puffer nach den Anweisungen des Herstellers. Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetfuß. </li><li> Hinzufügen identischen Volumen von 2X B &amp; W-Puffer zu dem wiedergewonnenen biotinylierten DNA (100 ul) zu den gewaschenen Perlen. </li><li> Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur unter leichtem Drehung auf einem Rotator. </li><li> Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetfuß und waschen die Kügelchen 3-mal mit 1 ml 1X B &amp; W-Puffer. </li><li> Eluieren der DNA durch Inkubation der Kügelchen in 100 ul frisch hergestellten 50 mM DTT für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Drehung auf einem Rotator. </li><li> Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetfuß. Absaugen Elutionsmittel und Last auf eine Bio-Micro Spin 6 Kolonne nach der Herstellung aus, damit die DTT entfernen. Die Ziel-DNA in der Lösung bekommen. </li><li> Reinige das eluierte DNA aus dem vorherigen Schritt von Qiagen MinElute PCR Purification Kit und eluieren DNA in 10 ul Puffer EB. Quantifizierung DNA mit Qubit Fluorometer oder NanoDrop, wenn die Konzentration höher als 20 ng / ul. Die DNA ist bereit für nachgeschaltete genomweite Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wenn die Qualität of genomische DNA ist hoch, sind typische Ausbeuten der Gewinnung nach dem β-GT und Biotinylierung Reaktionen ~ 60-70%. Allerdings variieren die Gefangennahme Effizienz deutlich mit verschiedenen Gewebearten abhängig von den 5-HMC Ebenen der Proben. Typischerweise ist der Abscheidegrad für Gehirn genomische DNA ~ 4-9%, und in einigen extremen Fällen kann der Wirkungsgrad bis zu 12%. Für ES-Zellen, ist die durchschnittliche Einfangeffizienz ~ 2-4%, im Gegensatz zu ~ 0,5% für neurale Stammzellen. Die geringste Effizienz bisher gesehen war für genomische DNA von Krebszellen. Alle angereicherte DNA ist bereit für Standard der nächsten Generation Bibliothek Vorbereitung Protokolle. Darüber hinaus kann das eingefangene DNA auch als Matrize für die Echtzeit-PCR, um die Anreicherung von einigen Fragmenten im Vergleich zum Ausgangs-DNA, erkennen, ob die entsprechenden Primer vorhanden sind, verwendet werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> Abbildung 1. Beschallte humanen genomischen DNA-Fragmente in1% Agarosegel. 10 ug genomischer DNA aus humanen iPS Zellen in 120 ul TE Puffer 1X isoliert wurde beschallt Verwendung einer Ultraschallbehandlung Vorrichtung (Covaris). Nach der Beschallung wurden 2 ul der beschallten DNA auf 1% Agarosegel geladen mit 100 bp DNA-Marker, um die Größen der DNA-Fragmente beschallte vergleichen. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 2 ul </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Bis zu 10 ug genomische DNA </td><td> _ Ul </td><td> Bis zu 500 ng / ul </td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-Glc (3 mM) </td><td> 0,67 ul </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 1 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 20 ul </td&gt; <td></td></tr></tbody></table> i) Für das Tissue genomische DNA (high 5-HMC-Gehalt&gt; 0,1%) <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 10 ul </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Bis zu 20 ug genomische DNA </td><td> _ Ul </td><td> Bis zu 500 ng / ul </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 1,33 ul </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 2 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 40 ul </td><td></td></tr></tbody></table> ii) für die Stammzellenforschung genomische DNA (Median 5-HMC-Gehalt ~ 0,05%) <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volumen </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X β-GT Reaction Buffer </td><td> 10 ul </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Bis zu 50 ug genomische DNA </td><td> _ Ul </td><td> Bis zu 500 ng / ul </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 3,33 ul </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 5 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 100 ul </td><td></td></tr></tbody></table> iii) Für Krebszelle genomische DNA (low 5-HMC-Gehalt ~ 0,01%) Tabelle 1. Beispiele für Mengen von Input-DNA und Kennzeichnung Reaktionen unter Verwendung der Proben mit verschiedenen 5-HMC Ebenen durch die selektive chemische Markierung Methode. <table border="1"><tbody><tr><td> Probe </td><td> 5-HMC-Ebene </strong&gt; </td><td> Ausgangs-DNA (ug) </td><td> Erholung nach Kennzeichnung (Eingang an Kügelchen) (ug) </td><td> Rückgewinnungsausbeute </td><td> Pull-Down-DNA (ng) </td><td> Pull-Down-Ausbeute </td></tr><tr><td> Adulten Maus Kleinhirns </td><td> 0,4% </td><td> 10 </td><td> 7,5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3,1% </td></tr><tr><td> Postnatalen Tag 7 Maus Kleinhirns </td><td> 0,1% </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1,6% </td></tr><tr><td> Maus-ES-Zellen E14 </td><td> 0,05% </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0,8% </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Repräsentative Ergebnisse aus Maus Hirngewebe und ES-Zellen.

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li>
<li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li>
<li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241(2011).</li>
<li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li>
<li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li>
<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888(2010).</li>
<li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li>
<li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li>
<li>Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine%3A+a+new+kid+on+the+epigenetic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562(2011).</li>
<li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181(2010).</li>
<li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+recombinant+%CE%B2-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li>
<li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li>
<li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mbd3%2FNURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154(2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

5-Hydroxymethylcytosin (5-HMC) ist ein kürzlich identifizierten epigenetische Veränderung in erheblichen Mengen in bestimmten Säugetieren Zelltypen. Das hier vorgestellte Verfahren ist für die Bestimmung der genomweiten Verteilung der 5-HMC. Wir verwenden T4 Bakteriophagen β-glucosyltransferase zur Erzeugung eines manipulierten Glucose-Rest enthaltend eine Azidgruppe auf die Hydroxylgruppe von 5-HMC übertragen. Die Azidgruppe kann chemisch mit Biotin werden zur Feststellung, Affinitätsanreicherung und Sequenzierung von ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> 5M Natriumchlorid (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M pH 8,0 Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma Basis (Tris) pH7.5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH-Wert 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-Biotin-Konjugat </td><td> Klick-Chemie-Tools </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-Dithiothreitol, Reinstwasser (DTT) Superpure </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick Nucleotide Removal Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Spalte </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-Glucose </td><td> Aktive Motif </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzym </td></tr><tr><td> β-glucosyltransferase (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Beschallung Gerät </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Desktop-Zentrifuge </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel laufende Apparatur </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Rohr Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Rohr Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnetic Separation Ständer </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 Fluorometer </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenz Setup 10 X β-GT Reaktionspuffer (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM MgCl 2) 2 X Binding und Waschen (B &amp; W)-Puffer (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,02% Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

selektive aufnahme von 5-hydroxymethylcytosin aus genomischer dna

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-Methylcytosin (5-mC) bildet ~ 2-8% der gesamten Cytosine in humanen genomischen DNA und beeinflusst ein breites Spektrum an biologischen Funktionen, einschließlich Genexpression, die Aufrechterhaltung der Genom Integrität, elterliche Prägung, X-Chromosom-Inaktivierung, die Regulierung des Entwicklung, Alterung und Krebs 1. Kürzlich wurde die Anwesenheit eines oxidierten 5-mC, 5-Hydroxymethylcytosin (5-HMC), in Säugerzellen entdeckt, insbesondere in embryonalen Stamm (ES)-Zellen und neuronalen Zellen 2-4. 5-HMC wird durch Oxidation von 5-mC katalysiert durch TET Familie Eisen (II) / α-Ketoglutarat-abhängige Dioxygenase 2, 3 erzeugt. 5-HMC wird vorgeschlagen, bei der Aufrechterhaltung der embryonalen Stamm (mES) Zelle, normale Hämatopoiese und Tumore und Zygote Entwicklung 2, 5-10 beteiligt sein. Zum besseren Verständnis der Funktion von 5-HMC, ist eine zuverlässige und einfache Sequenzierung von wesentlicher Bedeutung. Traditionelle Bisulfit-Sequenzierung kann nicht unterscheiden, 5-HMC von 5-mC 11 </sup&gt;. Die Biologie des 5-HMC entwirren, haben wir eine hoch effiziente und selektive chemische Ansatz zu kennzeichnen und zu erfassen 5-HMC entwickelt, unter Ausnutzung eines Bakteriophagen Enzym, das einen Glucoserest fügt bis 5-HMC speziell 12. Hier beschreiben wir eine einfache Zwei-Schritt-Verfahren zur selektiven chemischen Kennzeichnung der 5-HMC. Im ersten Markierungsschritt wird 5-HMC in genomischer DNA mit einem 6-Azid-Glucose katalysiert durch β-GT, eine Glucosyltransferase aus Bakteriophagen T4 bezeichnet, in einer Weise, die das 6-Azid-Glucose überträgt 5-HMC vom modifiziertes Cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Im zweiten Schritt, Biotinylierung wird ein Disulfid Biotin Linker an die Azidgruppe durch Klickchemie befestigt. Beide Schritte sind hoch spezifisch und effizient, was zu vervollständigen Kennzeichnung unabhängig von der Fülle der 5-HMC in der genomischen Regionen und geben extrem geringe Hintergrund. Nach Biotinylierung von 5-HMC, die 5-HMC-enthaltende DNA-Fragmente werden dann selektiv eingefangenmit Streptavidin-Kügelchen in einer Dichte-unabhängige Weise. Die daraus resultierenden 5-HMC-angereicherte DNA-Fragmente konnten für nachgelagerte Analysen, einschließlich der nächsten Generation Sequenzierung verwendet werden. Unsere selektive Markierung und Capture-Protokoll überträgt hohe Empfindlichkeit auf jede Quelle der genomischen DNA mit variablem / diverse 5-HMC Häufigkeiten. Obwohl der Hauptzweck dieses Protokolls ist seine nachgeordneten Anwendung (dh. Der nächsten Generation Sequenzierung Karte aus dem 5-HMC Verteilung im Genom), ist es kompatibel mit Einzel-Molekül-, real-time SMRT (DNA)-Sequenzierung, das ist der Lage ist, single-base Auflösung Sequenzierung von 5-HMC.

Beschrieben wird ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung Kennzeichnung β-Glucosyltransferase (β-GT), um ein Azid-Glukose zu 5-HMC übertragen, gefolgt von Klickchemie einen Linker Biotin für die einfache und dichteunabhängigen Anreicherung zu übertragen. Dieses effiziente und spezifische Kennzeichnung Methode ermöglicht die Anreicherung von 5-HMC mit extrem niedrigen Hintergrund und hohem Durchsatz epigenomischen Mapping über Next-Generation-Sequenzierung.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-Methylcytosin (5-mC) macht etwa 2–8 % der gesamten Cytosine in der menschlichen genomischen DNA aus und beeinflusst ein breites Spektrum biologischer Funktionen, einschließlich der Gen...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fünf-Hydroxyethyl-Cytokin, eine neu entdeckte DNA-Modifikation, zu markieren und anzureichern. Zunächst wird die genomische DNA durch Sonikation fragmentiert, anschließend eine Beta-Glucosyl-Glucosyltransferase-Reaktion durchgeführt, um Azid-Glucose-Gruppen mithilfe der Qlik-Chemie auf die 5-Hydroxyethyl-Cytidin-Reste der DNA zu übertragen. Danach wird ein Thiol-Biotin-Linker an die Azid-Gruppe angeheftet, um biotinylierte DNA zu erzeugen. Im nächsten Schritt werden die DNA-Fragmente, die 5-Hydroxyethyl-Cytidin enthalten, selektiv an Streptavidin-Kügelchen unabhängig von der Dichte erfasst.Die gereinigten fünf Hydroxyethylcytidin-anreichernden DNA-Fragmente können für nachgeschaltete Analysen, einschließlich der Next-Generation-Sequenzierung, verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Ansätzen wie dem antikörperbasierten Ansatz besteht darin, dass die Anreicherung von phy-Hydroxyethylcytosin unabhängig von der PHY-C-Dichte ist. Eugene Lee, ein leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor, wird dieses Protokoll demonstrieren.Sonizieren Sie zunächst die genomische DNA auf einen Größenbereich, de

selective-capture-of-5-hydroxymethylcytosine-from-genomic-dna

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Dieses Video beschreibt die Technik des Dot-Blots zur Bestimmung des Grades der DNA-Methylierung in menschlichen Chondrozyten in vitro durch das Blotten von DNA-Proben auf einer Nylonmembran und die anschließende Visualisierung mit monoklonalen Antikörpern. Dies hilft, den Phänotyp der Chondrozyten in verschiedenen Stadien der Kultur zu bestimmen.

5-Methylcytosin-Dot-Blot zur Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Methylierung

Hierin beschreiben wir eine empfindliche immunchemische Methode zur Kartierung der räumlichen Verteilung von 5mC-Oxidationsderivaten, die auf der Verwendung von Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern und Tyramid-Signalamplifikation basiert.

Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Neu entdeckte oxidierte Formen von 5-Methylcytosine (Oxi-mCs), 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-Formylcytosine (5-Fu) und 5-Carboxylcytosine (5caC) kann verschiedene DNA-Modifikationen mit einzigartigen funktionellen Rollen vertreten. Hier ist ein semi-quantitative Workflow zur Visualisierung der räumlichen Verteilung Oxi-mCs, Signal Intensität Profilierung und NS1 beschrieben.

Immunostaining für DNA-Modifikationen: computergestützte Analyse der konfokalen Bilder

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

Detaillierte Protokolle für die Einführung ein veränderter Split-TET2 Enzym (Apfelwein) in Säugerzellen für chemische induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau werden vorgestellt.

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und Hirngeweben vor, wobei Immunfluoreszenzfärbungundungen und DNA-Dot-Blot-Methoden verwendet werden.

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.

Schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen

Lernen Sie die selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA mittels β-Glucosyltransferase und Click-Chemie. Diese dichteunabhängige Methode ermöglicht die effiziente Anreicherung für epigenomische Hochdurchsatzanalysen.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

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