Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fünf Hydroxyethylzytokine zu markieren und einzufangen, eine neu entdeckte DNA-Modifikation, die zunächst die genomische DNA durch Ultraschall fragmentiert und dann eine Beta-Gluc-Glukosetransferase-Reaktion durchführt, um Azid-Glukoseeinheiten mit Hilfe der Qlik-Chemie auf fünf Hydroxyethylcytidinreste auf der DNA zu übertragen. Hängen Sie einen Salid-Biotin-Linker an die Azid-Gruppe an, um biotinylierte DNA herzustellen. Als nächstes fangen wir selektiv die fünf Hydroxyethylcytidin enthaltenden DNA-Fragmente auf Streptavidin-Kügelchen in einer dichteunabhängigen Weise ein.

Die aufgereinigten fünf mit Hydroxyethylcytidin angereicherten DNA-Fragmente können für nachgelagerte Analysen, einschließlich Next Generation Sequencing, verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber dem bestehenden Ansatz wie dem Antikörper-basierten Ansatz besteht darin, dass die Erfassung von phy-Hydroxyethylcytosin unabhängig von der PHY-C-Dichte ist. Eugene Lee, ein leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor, wird dieses Protokoll demonstrieren.

Zuerst wird die genomische DNA auf einen Größenbereich beschallt, der für die genomweite Sequenzierungsplattform geeignet ist. Überprüfen Sie die Größenverteilung der fragmentierten genomischen DNA auf einem 1%aose-Gel. Bestimmen Sie nun die Ausgangs-DNA-Mengen basierend auf der Häufigkeit von fünf Hydroxyethylcitabin in der genomischen DNA.

Da die fünf Hydroxyethylcitabin zwischen den verschiedenen Gewebeabgriffen signifikant variieren, hängt die anfängliche DN-Menge vom Gehalt von fünf C in den Proben ab. Beispiele finden Sie in der ersten Tabelle des Manuskripts. Der erste Schritt des Markierungsprozesses besteht darin, es handelt sich um eine grundlegende Transferreaktion, um AZA Glucose Es auf die fünf C-Reste auf der fragmentierten genomischen DNA zu übertragen.

Kombinieren Sie die Reaktionskomponenten und mischen Sie sie durch Pipettieren, dann inkubieren Sie die Enzymreaktion in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Eine Stunde lang. Führen Sie die Reaktion durch ein Kajak-Schnellnukleotidentfernungskit mit 10 Mikrogramm DNA pro Säule, eluieren Sie die DNA mit 30 Mikrolitern Wasser pro Säule und ziehen Sie die Proben im zweiten Schritt des Markierungsprozesses.

Ich salifiziere, dass der Bing-Linker durch Klickchemie an die Eza-Gruppe angehängt ist. Für die Biotin-Hochstimmungsreaktion fügen Sie fünf Mikroliter Biotin-Konjugat-Arbeitslösung pro 30 Mikroliter DNA-Lösung hinzu. In einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad zwei Stunden lang inkubieren.

Verarbeiten Sie die Reaktion durch ein Kajak, ein Kit zur schnellen Nukleotidentfernung und verdünnen Sie die DNA in 100 Mikrolitern. Quantifizieren Sie dann die wiedergewonnene DNA mit NanoDrop. Beginnen Sie mit 50 Mikrolitern Streptokokken-Adin-dyna-Kügelchen.

Führen Sie drei Wäschen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und sammeln Sie die Perlen auf einem Magnetständer. Verdünnen Sie nun die biotinylierte DNA mit 100 Mikrolitern zweifachem BNW-Puffer und geben Sie die Probe zu den gewaschenen Kügelchen. 15 Minuten bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation inkubieren.

Ernten Sie die Kügelchen mit einem Magnetständer und waschen Sie sie dreimal neben der Eluierung, der DNA. 100 Mikroliter frisch zubereitetes 50 Millimolar DVB-T zugeben und bei Raumtemperatur unter sanfter Rotation zwei Stunden lang inkubieren. Trennen Sie die Kügelchen mit einem Magnetständer.

Sammeln Sie dann das EENT mit der Ziel-DNA und laden Sie die Probe auf eine Mikrobio-Spin-Sechs-Säule. Um das DTT zu entfernen, reinigen Sie die Probe auf einer Kogensäule weiter und eluieren Sie die DNA in 10 Mikrolitern EB-Puffer, quantifizieren Sie die DNA mit einem Qubit, Fluorimeter oder NanoDrop. Wenn die Konzentration höher als 20 Nanogramm pro Mikroliter ist, zeigt dieses 1%arose-Gel beschallte DNA-Fragmente, die aus menschlichen IPS-Zellen isoliert wurden.

Für Downstream-Anwendungen wie Next Generation Sequencing liegt die typische Fragmentierungsgröße bei etwa 300 Basenpaaren. Beachten Sie, dass bei hoher Qualität der genomischen DNA die Wiederfindungsausbeute nach den Beta-GT- und Biotin-Reaktionen bei etwa 60 bis 70 % liegt. Die Pull-Down-Ausbeuten variieren jedoch je nach Gewebetyp erheblich, abhängig von den fünf Hydroxyethyl-Zytokin-Spiegeln der Proben. In der Regel liegt die Einfangeffizienz für genomische DNA des Gehirns bei etwa vier bis 9 %, und in einigen extremen Fällen kann die Effizienz bis zu 12 % erreichenBei ES-Zellen liegt die durchschnittliche Einfangeffizienz bei etwa zwei bis 4 %, im Gegensatz zu etwa 0,5 % Bei Neuronenstammzellen war der geringste Mangel, der bisher bei genomischer DNA aus Krebszellen beobachtet wurde.

Im Anschluss an diese Verfahren könnten andere Methoden wie die Next Generation Sequencing-Technik durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die genomweite Verteilung von fünf GC-Modifikationen zu beantworten.