Name: Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung myeloider Zellsubpopulationen im ischämischen Gehirn mittels Stereologie und Durchflusszytometrie. Diese Methoden ermöglichen präzise quantitative und qualitative Analysen in Schlaganfallmodellen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) und RENEVAS RD06/0026/0005 (IL) sowie von der Lokalregierung von Madrid unterstützt S2010/BMD-2336 (MAM) und S2010/BMD-2349 (IL). IB und MIC sind Stipendiaten des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit.

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<li>Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+state+and+lysophospholipid+acid+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression.</a> International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die zerebrale Ischämie-Modell hier vorgestellten gibt hoch reproduzierbare Infarktvolumen bestimmt 24 bis 48 h und 7 Tage nach der MCA Ligation durch verschiedene Ansätze 8,15,17. Diese MCAO-Modell hat eine geringe Sterblichkeit (weniger als 1%) im Vergleich zu anderen, die Minimierung der Anzahl der Tiere in Studien verwendet. Ein entscheidender Schritt, um diese niedrige Rate der Sterblichkeit zu erhalten, ist die richtige aseptischen Bedingungen zu halten, um Infektionen, die das Überleben nach Schlaganfallinduktion beeinträchtigen könnten, zu vermeiden. Diese MCAO-Modell kann nicht nur als Dauer MCAO-Modell, das als ein klinisch relevanten Modell für translationale Forschung 18 verwendet werden, sondern auch als Übergangsmodell durch vorübergehende Unterbindung der CCA und MCA mit einem slipknot und hinteren Reperfusion zum gewünschten Zeitpunkt 19. Dieses Verfahren wurde erfolgreich bei Mäusen und Ratten 17,20 verwendet. All dies deutet darauf hin, dass MCAO durch Ligation ist ein hochvielseitiges Modell der zerebralen Ischämie mit mehreren Anwendungen. Ein kritical Schritt dieses Verfahrens besteht darin, dass sie invasive Chirurgie unter einem Stereomikroskop erfordert; die Kraniotomie sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden, um nicht die Jochbein sowie die MCA beschädigen. Allerdings ist die Verwendung von Scheintiere (wird die zu der Operation, aber CCA und MCA Ligation unterzogen, nicht durchgeführt werden) stellt ein nützliches Instrument zur chirurgischen Eingriff abhängige Effekte zu unterscheiden. Das Ausmaß der Hirnschädigung nach dieser Technik kann durch verschiedene Verfahren quantitativ bestimmt werden. Unser Protokoll von Gehirn Sektionierens Nissl-Färbung und anschließende Bestimmung des Volumens von Cavalieri ermöglicht eine genaue Quantifizierung des beschädigten Bereich und die Anzahl der Mäuse in dieser Art von Untersuchungen verwendet, da die Seriengehirnschnitte können auch für verschiedene immunohistochemische Analyse verwendet werden minimiert. Für eine bessere Leistung dieser Methodik, wichtig, die in der Software verwendet stereology Parameterwahl ist (Tabelle 1), die zum Schätzen th erforderlich sein werden,e Volumen der verschiedenen Regionen durch die Formel: V = 1 / SSF * a * f t * &amp; Sgr; P i (SSF ist die Scheibe Auswahlsatz, t ist die mittlere Dicke der Abschnitte, ist eine f die Fläche der Gitterabstand und &amp; Sgr; P die Anzahl der Punkte Schlagen der Struktur). Das distale MCAO durch Ligation kann nützlich sein, die infiltrierten Leukozyten und Immunzellpopulationen, die 8,13 im Entzündungsprozess nach Hirnverletzung 1-4 teilnehmen charakterisieren. Hier schlagen wir zwei verschiedene Methoden für die Hirnimmunzellcharakterisierung, eine präzise stereo Ansatz und eine durchflusszytometrische Analyse für eine bessere Charakterisierung mehrere Leukozyten-Subpopulationen. Unter Ausnutzung der seriellen Gehirn Schnitte kann die Quantifizierung der Anzahl von Neutrophilen durch den optischen Fraktionator Verfahren 16, das die Gesamtzahl der Zellen, die von der Anzahl der Zellen abgetastet wit schätzt erreicht werdenha Systematische Zufallsstichprobe (SRS) Satz unvoreingenommene virtuellen Räumen Zählung, die die gesamte Region von Interesse, in unserem Fall den Infarktbereich, mit gleichmäßigen Abstand zwischen unvoreingenommene virtuellen Räumen Zählung in Richtungen X, Y und Z. Diese Methode liefert eine genaue Werkzeug abzuschätzen Gesamt neutrophilen Zahl im ischämischen Gehirn an verschiedenen Zeitpunkten nach der Ligation. Obwohl nicht in dieser Studie gezeigt wurde, dieses Protokoll auch für die Abschätzung der verschiedenen Neutrophilen Subpopulationen nach Ischämie 21 und für eine genaue Quantifizierung von jeder anderen Zellpopulation im ischämischen Gehirn wie andere infiltrierten Leukocyten gefunden werden (Monozyten / Makrophagen) und auch für die Schätzung überlebenden Nervenzellen oder auch für die Neurogenese Quantifizierung nach Schlaganfall. Der wichtigste Schritt für eine genaue Schätzung in dem gewünschten Bereich ist die Auswahl der entsprechenden Parameter, wie die, die in der Tabelle 3 für die Neutrophilen-Quantifizierung in den ischämischen Bereich gezeigt.Diese Parameter werden für die stereo Software verwendet, um die gesamte positive Zellzahl (N) unter Verwendung der Gleichung N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / asf x 1 / tsf (ΣQ- ist die Gesamtzahl von Zellen mit gezählt berechnen die Fraktionator ist ssf der Abschnitt Auswahlsatz, ASF ist die Auswahlsatz Bereich und TSF ist der Auswahlsatz Dicke) 5. Obwohl diese Methodik ist langsamer als andere Quantifizierungstechniken (beispielsweise Analyse von neutrophilen Markern mg Gewebe, Densitometrie von repräsentativen Bildern oder die Anzahl von Neutrophilen pro Feld), den Vorteil, eine neutrale und eine feste Technik, die eine genaue stellt sein muss es Quantifizierung der Zellzahlen. Das Gehirn Leukozyten Isolierung Ansatz erlaubt eine gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von mehreren Immunzelltypen ohne die Notwendigkeit zur Vorspannung des Systems durch in vivo-Färbung oder genetische Manipulationen. Nachfolgende Zellsortierung vom gekennzeichnet myeloische populations oder deren immunmagnetische Trennung kann für mehrere Downstream-Anwendungen, wie beispielsweise weitere Studien zur Gen- oder Protein-Expression verwendet werden. Die genaue Charakterisierung von Neutrophilen, Monozyten und Mikroglia mit diesem Verfahren erzielt wird, führt eine hohe Spezifität gegenüber den bestehenden Verfahren, wie der immunhistochemische Untersuchungen, ein Vorteil, der die Bildung von Einzelfunktionen zu den verschiedenen myeloischen Zellen, Gehirn angeborenen Immunantwort auslösen können. Zusätzlich kann es ferner erweitert werden, um andere Gehirn Populationen mit dem entsprechenden Label kenn wie Blut geboren Makrophagen (CD11b + CD45 hallo CD68 +), und es kann für die Untersuchung von anderen ZNS Erkrankungen oder Verletzungen, die angewendet werden. Daher ist diese Technik stellt ein wichtiges Instrument, um die Heterogenität der Entzündungsreaktion im Gehirn zu erforschen. Eine wesentliche Einschränkung dieses Verfahrens beruht auf der Herstellung der Leukozyten-Suspensionen aus frischen Hirngewebe, was das ändern kann,Aktivierungszustand der Zellen oder deren Antigen-Veränderung. Obwohl diese Technik ermöglicht eine genauere qualitative Charakterisierung verglichen immunhistochemischen Studien liefert sie eine weniger genaue Quantifizierung basierend auf der Zellisolierung. Dennoch ist die Effizienz der Zellisolierungsprotokoll ähnlich zu anderen veröffentlichten Methoden 9 und kann effizient genutzt werden, um Unterschiede in der Anzahl von Gehirnimmunzellen zwischen Kontrolle und MCAO-Gruppen oder sogar zwischen MCAO Gruppen unterschiedlichen Behandlungen unterzogen 8 detektieren. Kritische Schritte dieses Protokolls sind die Gewebedissektion die Gewebezerstörung Verfahren und die Myelinentfernung. Bezüglich der Gewebesammel kann ein Normierungsschritt (durch Wiegen des gesammelten Gewebes), um die Variabilität zu vermeiden aufgrund unterschiedlicher Dissektion Leistungsberechnung einbezogen werden. Darüber hinaus kann eine Normalisierung zwischen verschiedenen MCAO Gruppen auch durch Infarktvolumen auf (zuvor von Magnetic R bestimmtesonance). Eine weitere Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, ist, den gesamten ipsilateralen Hemisphäre beider ischämischen und Kontrollgruppen zu verwenden, oder sogar die kontralateralen Hemisphäre des ischämischen Maus als Kontrolle, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren. Dieser Ansatz vermeidet Unterschiede zwischen jedem Dissektion, hat es einen Nachteil; ein Verdünnungsfaktor wird durch die Erhöhung der Gesamtzahl der Zellen, nicht aber die Anzahl der myeloiden Zellen, die ausschließlich in den Kern und peri-Infarktbereiche des ipsilateralen Kortex zugegeben. In Bezug auf Gewebe-Zerstörung, veranschaulicht dieses Protokoll die Schritte für die mechanische Zerstörung von Gehirnzellen, die Vermeidung enzymatische Behandlungen und Vorbeugung von Oberflächenantigen Veränderung 9,22, ein wesentlicher Faktor für die weitere qualitative und quantitative Analyse der inflammatorischen Zell-Subpopulationen. Neben der Herstellung der Zellsuspension von Interesse ist Myelin Entfernung aus Gehirnproben ein empfehlens Schritt, um Interferenzen mit downst vermeidenRies Anwendungen wie immunomagnetischen Zelltrennung oder Durchflusszytometrie 23,24. Dies kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie Saccharose oder Percoll-Gradienten, oder Anti-Myelin-Perlen erreicht werden. Hier und auf Basis von früheren Studien, die verschiedene Verfahren zur Hirnzellsuspension Isolierung, mechanische Störung in Kombination Vergleichen mit Percoll Nutzung Myelin Entfernen verwendet wird, um die Zellausbeute zu verbessern und die Lebensfähigkeit 25.

Morphologischen, phänotypischen und Genexpression Veränderungen der Mikroglia sowie Extravasation und Aktivierung von hämatogenen Makrophagen und Neutrophile werden geglaubt, um eine zentrale Rolle bei der pathophysiologische Kaskade folgenden Hirnverletzung 1-4 zu spielen. Dieses Protokoll stellt zwei Ansätze, um die Anzahl der verschiedenen myeloiden Zellmengen des ischämischen Hirn schätzen und ihre phänotypische Charakterisierung auszuführen. Darüber hinaus bietet es auch eine Beschreibung von einem experimentellen Modell der zerebralen Ischämie in Mäusen, die der transienten oder permanenten Ligatur der beiden distalen Middle Cerebral Artery (MCA) und der Arteria carotis communis (CCA) besteht, wie es die Infarkt evaluieren durch die genaue Cavalieri Verfahren unter Verwendung eines stereo Software. Der erste Ansatz zu der ischämischen Hirn charakterisieren myeloischen Zellen-Untergruppen ist ein stereo Methode, die auf der optischen Fraktionator Ansatz 5. Dies ist diegängigen stereo Sonde in den Biowissenschaften und bietet ein hohes Maß an Präzision bei niedrigen Koeffizienten der Fehler 5-7. Dies ist die beste Wahl für die Zell Quantifizierung, wenn das Gewebe in einzelne Abschnitte geschnitten wird, wie es aufgrund der Fragmentierung des Gewebes in Abschnitte vermeidet die Vorspannung an Zellschätzung. Diese Methode ist ein sehr guter Weg, um Zahlen, Dynamik und phänotypischen Veränderungen der Neutrophilen infiltriert Subpopulationen der ischämischen Gewebe 8 zu charakterisieren. Die zweite Charakterisierung Ansatz basiert auf einem modifizierten Protokoll von Campanella und Mitarbeiter 9, die einen einfachen Weg, um Gehirnsuspensionen Leukozyten zu isolieren und mittels Durchflusszytometrie charakterisiert vorsieht. Im Gegensatz zu herkömmlichen immunhistochemischen Techniken, Durchflusszytometrie charakterisierenden Differenzierung Mikroglia (CD45 lo CD11b +) und infiltrierten myeloiden Zellen (CD45 hallo CD11b +) auf der Grundlage ihrer diffErent Expression von CD45 9-13. Zusätzlich proinflammatorischen Monozyten (CD45 hallo CD11b + Ly-6G - Ly-6C hallo), Neutrophile (CD45 hallo CD11b + Ly-6G +) und andere Leukozyten Teilmengen von dem ischämischen Gewebe unterschieden werden. Dieser Ansatz bietet eine zuverlässige und schnelle Assay Neuroinflammation in experimentellen Modellen der Hirnischämie bewerten. Allerdings kann der Gewebeverarbeitung den Aktivierungszustand und Nummern der verschiedenen Zellpopulationen im ischämischen Gewebe die eine semi-quantitative Charakterisierung gefunden zu beeinflussen.

<table><tbody><tr><td>Photonische LED F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td>Gerät</td></tr><tr><td>Temperaturregler &nbsp;</td><td>Panlab&nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Volvere GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Edelstahlfräser</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>Chirurgisches Material</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5/45&nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>Chirurgisches Material</td></tr><tr><td>Zange Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>Chirurgisches Material</td></tr><tr><td>Naht 6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>Chirurgisches Material</td></tr><tr><td>Naht 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>Chirurgisches Material</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Esteve</td><td>571329-8</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Natrium Pentobarbital</td><td>Vetoquinol</td><td>570681</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Gefriermikrotom</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>SM2000R</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Superfrost Objektträger</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2014-07</td><td>Labormaterial</td></tr><tr><td>Cresylviolettacetat</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE300</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>XYZ motorisierter Computertisch und Controller</td><td>Ludl electronics Produkte</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Stereo Investigator System</td><td>Microbrightfield</td><td>Version 7.003 Software</td><td>Software</td></tr><tr><td>5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv mit Teflonstößel</td><td>Thomas Scientific</td><td>0913X70</td><td>Labormaterial</td></tr><tr><td>Polypropylen 50 ml Oak Ridge Zentrifugenröhrchen</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&nbsp;</td><td>Material für das Labor</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Beckman Ultrazentrifugue</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Ultrazentrifuge Rotor 45 Ti</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>BD Steriles Zellsieb, 40 Mikron</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>Labormaterial</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagenz, Maus</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, Mensch und Maus</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>CD45-PE, Maus</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, Maus</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 Anti-Maus Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128012</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>BD FACS Flow</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; 4-farbige</td><td>BD</td><td>342975</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>BD Cell Quest Pro Software</td><td>BD</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

stereo und durchflusszytometrie charakterisierung von leukozyten-subpopulationen in models der vorübergehend oder bleibend zerebrale ischämie

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Mikroglia-Aktivierung sowie Austritt von hämatogenen Makrophagen und Neutrophile, wird angenommen, dass eine zentrale Rolle bei Hirnverletzung nach einem Schlaganfall zu spielen. Diese myeloiden Zellpopulationen können verschiedene Phänotypen und Funktionen angezeigt und unterschieden werden müssen und dadurch ihre Regelung und den Beitrag zu Gewebeschäden zu untersuchen. Dieses Protokoll bietet zwei verschiedene Methoden zur Gehirnimmunzellcharakterisierung: eine präzise stereo Ansatz und eine durchflusszytometrische Analyse. Die stereo Ansatz basiert auf der optischen Fraktionator Methode, die die Gesamtzahl der Zellen in einem Bereich von Interesse (infarzierten Gehirn) berechnet durch eine systematische Stichproben geschätzt basiert. Die zweite Charakterisierung Ansatz bietet eine einfache Möglichkeit, Gehirnsuspensionen Leukozyten zu isolieren und durch Strömungs charakterisieren Zytometrie, so dass für die Charakterisierung von Mikroglia infiltriert Monozyten und Neutrophilen des ischämischen Gewebes. Darüber hinaus ist es auch details eine zerebrale Ischämie-Modell bei Mäusen, die ausschließlich betrifft Hirnrinde, die Erzeugung in hohem Maße reproduzierbar Infarkten mit einer niedrigen Rate der Sterblichkeit, und das Verfahren zur histologischen Gehirnverarbeitung Infarktvolumen durch die Cavalieri Methode zu charakterisieren.

Die hier gezeigte zerebrale Ischämie-Modell erzeugt Infarkte ausschließlich in der Hirnrinde zu sehen, ohne die striatalen Gewebe, da die lenticulostriatal Zweige der MCA, die das Striatum zu bewässern sind nicht verschlossen (Abbildung 1). Nissl-Färbung, kann der beschädigte Bereich als hypo kortikalen Bereich (Figur 2) identifiziert werden. Dieses Modell wird von in hohem Maße reproduzierbar Infarktvolumen bei 24 h nach MCAO (% IH 15,89 ± 0,28) von Cavalieri Verfahren in Nissl-gefärbten Schnitten geschätzt (Abbildung 2) aus. Schätzung der Infarktvolumen nach Cavalieri Verfahrens ist eine genaue Vorgehensweise mit geringem Fehler, der in dem Koeffizienten der Fehler (CE) von Gundersen in kontraläsionalen und ipsilesional Hemisphären sowie im Infarktareal (Tabelle 2) reflektiert wird. Geschädigte Gewebe Volumen in mm 3, sondern auch als% IH unter Verwendung der Formel in dem Abschnitt 3.2.13 ausgedrückt werden. Darüber hinaus ist die Abschätzungdes Gesamtvolumens der ipsilesional und kontraläsionelle Regionen ermöglicht die Berechnung der Ödemindex um das Infarktvolumen zu korrigieren und eine Überschätzung des geschädigten Gewebes (Tabelle 2) zu vermeiden. Angesichts der Serienschnitt Verarbeitung des Gehirngewebe, kann dies ausgenutzt werden, um eine genaue Schätzung der Gesamtzahl der Zellpopulationen durchzuführen, wie infiltrierten Neutrophilen in den ischämischen Bereich, unter Verwendung des optischen Fractionator Ansatz (Abbildung 3 und Tabelle 4) mit den in Tabelle 3 gezeigten Parameter. Dieses Protokoll schätzt eine Gesamtzahl der Neutrophilen (Ly6G-positive Zellen) in der Infarktfläche von 23.328 ± 3.623 bei 24 h und 82.856 ± 8.143 bei 48 h bei Mäusen nach pMCAO (Figur 3D). In Übereinstimmung mit früheren Studien wird Neutrophilinfiltration direkt mit der Infarktgröße (3E) korreliert. Die Einschätzung der ter Anzahl der Neutrophilen von der Optical Fractionator Verfahrens ist eine genaue Vorgehensweise mit geringem Fehler, der durch das CE von Gundersen (Tabelle 4) reflektiert wird. Die Leukozyten-Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung Protokoll erlaubt die Isolierung von 47.922 ± 23.174 myeloischen Zellen aus der Rinde der ipsilesional Hemisphäre ischämischer Mäusen. Diese 10-30% der gesamten Ereignisse in der Zellsuspension vorhanden. Der Großteil der erfassten Ereignisse mit diesem Protokoll gegenwärtig eine niedrige FSC-Parameter, um Zelltrümmer zu (Abbildung 4) assoziiert. CD11b-Färbung zeigt, dass CD11b + Zellen eine höhere FSC Wert (Figur 4), was darauf hindeutet, dass Zelltrümmern wird mit diesem Marker markiert und, wie zuvor angegeben, daß sie von einer weiteren Analyse durch Setzen des FSC Schwelle bei 200 9 ausgeschlossen. Der variable Anteil der Zelltrümmer mit diesem Verfahren erhalten lässt vermuten, dass Unterschiede auf Beispielprozessing (Timing, Gewebeschutz, Probentemperatur, effiziente Myelinentfernung, etc.) können zur Rechenschaft ziehen. Darüber hinaus wird die Verwendung von Zellsiebe auch notwendig, um das Vorhandensein von zellulären Klemmen in den Proben zu vermeiden; Dieser Schritt muss vor Zellfärbung durchgeführt werden. Mit der Gating-Strategie in der Abbildung 5, die an CD11b und CD45-Expression auf der Grundlage angezeigt wird, können wir zwischen gebietsansässigen und infiltriert myeloischen Zellen im ischämischen Gewebe zu unterscheiden. Diese CD11b + Bevölkerungszunahme im ischämischen Hemisphäre, wenn sie mit der naiven und mit der Scheingruppe, in der diese Zellen sind meist auf einer niedrigen Expression des CD45 assoziiert anzeigt, dass Mikroglia nach Ischämie proliferierenden (Figur 4, Figur 5 und Tabelle 5) verglichen wird . Dieser Unterschied ist wahrscheinlich auf die Zellinfiltration von dem Umfang, wie durch das Erscheinen einer CD11b + CD45 hallo Zellsubpopulation im ischämischen Gehirn nachgewiesen (Abbildung 4, Abbildung 5 und Tabelle 5), die geringe Anzahl in naiv und in Schein Gehirn ist. Der Beitrag der Infiltrate zum CD11b + Zellpopulation in Hirnischämie ist ein sehr dynamischer Prozess 4. Im MCAO-Modell durch die Ligatur, kann es von 30% bis 60% der Gesamt CD11b + Zellen in Abhängigkeit von der Größe der Läsion und der Zeit, wenn die Charakterisierung wurde getan variieren. Neutrophile, gekennzeichnet als Ly-6G + Zellen am stärksten vertreten sind infiltriert Zellpopulation bei 24 h nach MCAO gefunden in der ischämischen Gehirn der Maus mit diesem Modell von zerebraler Ischämie, da sie die 70-80% des CD11b + CD45 umfassen hallo. Der Rest der Zellen sind meist eine Subpopulation von CD11b + CD45 hallo Ly-6G - Ly-6C hallo pro-inflammatorischen Monozyten. In diesem Modell, diese Population wird in Reihe in den ischämischen Gehirnbereichen 24 bis 48 h nach MCAO erhöhen. Abb. 1: Die chirurgische Verfahren für die MCA-Ligation (A) nach dem Zurückziehen des Schläfenmuskels wird eine kleine Kraniotomie im Mausschädelgeführt. MCA wird durch einen Knoten oder eine slipknot mit einem 9/0 Naht ligiert. (B) Repräsentative Bilder der kortikalen Läsionen durch die MCAO-Modell generiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg"> Abbildung 2: Quantifizierung der Infarktvolumen von Cavalieri. (A) Repräsentative Bilder der Nissl-gefärbten Hirnschnitten 24 Stunden nach der Dauer MCA Ligation. Die hohe Vergrößerung zeigt die hipocromatic Bereich nach Nissl-Färbung dieidentifiziert den beschädigten Bereich (Kern) nach MCAO. Die (PI) Region Peri-Infarkt ist ebenfalls dargestellt. (B) Quantifizierung der Infarktvolumen mit der Cavalieri Verfahren in Serien Nissl-gefärbten Schnitten, 24 h nach MCAO (n = 50 Mäuse als% Infarkt Hemisphäre (% IH) vertreten ). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg"> Abbildung 3: stereo Quantifizierung von Neutrophilen im Infarktareal 24 und 48 Stunden nach der Ligation mit dem Optical Fractionator Verfahren. (A) Repräsentatives Bild infiltriert Neutrophilen (Ly6G-positiven Zellen) in den ischämischen Bereich bei 24 h nach MCAO. Abgrenzung zeigt die Infarktareal. (B, C) ​​Beispiele eines optischen Dissektor für neutrophile Quantifizierung mittels optischen Fraktionator. (D) Quantifizierung der gesamten Neutrophilen im Infarktbereich 24 und 48 h (n = 4 Mäuse). (E)Die Korrelation der Zahl der Neutrophilen mit der Infarktgröße 24 und 48 Stunden nach MCA Ligation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg"> Abb. 4: Repräsentative Dot-Plot Scatter Analyse der Gehirn Leukozyten aus naiven, Schein und ischämische (24 h nach MCAO) Halbkugeln auf der Basis von physikalischen Parametern (SSC und FSC) erreicht eine Population von Ereignissen, die CD11b (rot) zum Ausdruck identifiziert in allen Gruppen. Diese Population wurde nach der Expression von CD45 gated und charakterisiert. Zellen exprimieren geringe Mengen an CD45 (grün) wurden in den ischämischen und nicht-ischämischen Hirnkortex vorhanden und entsprach Mikrogliazellen. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die große Mengen von CD45 (gelb) nurin der ischämischen Hemisphäre und in geringerem Maße in der Sham-Gruppe gefunden. Die weitere Analyse der CD11b + CD45 hallo Population zeigt an, dass Neutrophile (Ly-6G + Zellen, blau) und pro-inflammatorische Monozyten (Ly-6C hallo Zellen, Orange) sind die Hauptzellpopulationen in Gehirn eindringt 24 Stunden nach dem Schlaganfall. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg"> Abb. 5: Gating Strategien Wohnsitz aus infiltriert myeloischen Zellen im ischämischen Gewebe zu unterscheiden CD11b + Zellen wurden zunächst nach Isotyp Fluoreszenzintensität (A) sucht. Eine repräsentative Punktdiagramm von Zellsuspensionen des ischämischen Hirn in der oben rechts auf der Tafel angezeigt. InZusätzlich typische Werte für die Gesamtzahl von Ereignissen und für die Anzahl von CD11b + Ereignisse unter Verwendung dieser Technik erworben gezeigt (keine der Zellen / ischämischer Hirnhemisphäre;. (A) CD45 Fluoreszenzintensitätsanalyse der CD11b + Zellen ist in Panel gezeigt B. Ein Vertreter Dot-Plot-Analyse von CD45 und CD11b Ausdruck der gated CD11b + Subpopulation in der oben rechts auf der Tafel angezeigt. Darüber hinaus ist die typische Anzahl von CD45 lo CD45 pro ischämischen Gehirnhälfte erworben hallo Zellen mit dieser Technik gezeigt ist (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2"></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Parameter für Cavalieri Methode </td></tr><tr><td> Schnittdicke (t) </td><td> 30 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Ziel </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Scheibe Auswahlsatz (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Die Entfernung zwischen Abschnitten </td><td> 600 um </td></tr><tr><td> Rasterabstand </td><td> 100 um </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Parameter für die stereo Quantifizierung der Infarktgewebe verwendet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ergebnisse </td><td> Kontraläsionalen </td><td> Ipsilesional </td><td> Infarkt </td></tr><tr><td> Area (um²) </td><td> 151.460.000 </td><td> 155.060.000 </td><td> 22.600.000 </td></tr><tr><td> Volume (um³) </td><td> 90,876 Mrd. </td><td> 93036000000 </td><td> 13,56 Mrd. </td></tr><tr><td> Volume für Korrigierte Über Projection (um³) </td><td> 89,9571 Mrd. </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13,4166 Mrd. </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen) m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen) m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen) alpha (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Infarkt Hemisphäre </td><td colspan="2"> 14,90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Gehirn-Ödem (Ips Vol / Cont Vol) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Typische Beispiele für kontraläsionalen, ipsilesional und der Infarktvolumen durch die Cavalieri Verfahren unter Verwendung des Stereo Investigator Software. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan='"2"&gt;'>Parameter für die optische Fraktionator verwendet </td></tr><tr><td> Schnittdicke (TSF) </td><td> 30 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Ziel </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Scheibe Auswahlsatz (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Zählen Rahmenhöhe </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> Zählen Rahmenbreite </td><td> 40 um </td></tr><tr><td> X Rastergröße </td><td> 230 um </td></tr><tr><td> X Rastergröße </td><td> 230 um </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 um </td></tr><tr><td> Optische disector Höhe </td><td> 14 &amp; mgr; m </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Parameter mit Hilfe der Stereo Investigator Software für die stereo Quantifizierung von Neutrophilen infiltriert nach Hirnischämie mit dem optischen Fraktionator Sonde verwendet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing='"0"&gt;'><tr><td colspan="2"> Die Einschätzung der Neutrophilen von der Optical Fractionator </td></tr><tr><td> Anzahl der Probenahmeflächen </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Formfaktor </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Insgesamt Marker gezählt </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Geschätzte Neutrophile von Optical Fractionator </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> Coefficient of Error (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,09 </td></tr></table> Tabelle 4: Repräsentatives Beispiel der geschätzten infiltriert Neutrophilen nach Hirnischämie mit dem Optical Fractionator Sonde mit Hilfe der Stereo Investigator Software. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Neutrophile </td><td> Monozyten </td><td> Mikroglia </td></tr><tr><td> Naiv </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75,8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1523 </td></tr><tr><td> Sham 24-Stunden- </td><td> 24.563 ± 5263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24-Stunden- </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4826 ± 1345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tabelle 5: Repräsentative Ergebnisse der geschätzten Knochenmarkzellen nach Hirnischämie mit der Durchflusszytometrie Ansatz.

Gehirn Myeloidzellen Charakterisierung nach Schlaganfall kann durch Stereologie unter Verwendung des optischen Fraktionator Verfahren durchgeführt werden, oder durch eine durchflusszytometrische Analyse von Gehirn Leukozyten Suspensionen. Beide sind nützliche Techniken, um eine genaue phänotypische Unterscheidung der Haupt myeloischen Zellen-Untergruppen in der ischämischen Gehirn führen.

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, myeloische Zelluntergruppen der Maus des ischämischen Gehirns mit zwei verschiedenen Methoden zu charakterisieren. Zunächst wird ein permanentes Modell der zerebralen Ischämie eingeführt, indem sowohl die Arteria carotis communis (CCA) als auch der distale Stamm der Arteria cerebrale media (MCA) verschlossen werden, was zu einem Infarkt führt, der hauptsächlich die Hirnrinde betrifft. Für die stereologische Quantifizierung der myeloischen Zelluntergruppen werden dann serielle koronale Abschnitte des Gehirns für die interessierenden Zellen immungefärbt, und dann werden die infiltrierten Zellen durch den optischen Fraktionatoransatz quantifiziert.Alternativ können die myeloischen Zellen durch mechanische Dissoziation aus frischem Hirngewebe isoliert und anschließend durch Durchflusszytometrie gefärbt und analysiert werden. Letztendlich kann eine genaue Quantifizierung und detaillierte qualitative Charakterisierung der spezifischen myeloischen Zelluntergruppen, die nach einer zerebralen Ischämie das Gehirn der Maus infiltrieren, durch Stereoquantifizierung bzw. multiparametrische Durchflusszytometrie erreicht werden. Der Hauptvorteil dieses Ischämie-Serienmodells gegenüber anderen bestehenden besteht darin, dass unsere Technik eine signifikant niedrigere Sterblichkeitsrate als andere Methoden aufweist und so die Anzahl der für die Studie erforderlichen Tiere minimiert.In diesem Bereich gibt es eine Methode, die helfen kann, Schlüsselfragen im Schlaganfallbereich zu beantworten, wie z.B. welche Rolle die Mikroreaktivierung, die Extravasation von hämatogenen Makrophagen oder Neutrophilen bei Hirnverletzungen spielen. Die genaue theologische Quantifizierung der in dieser Arbeit gezeigten multiparametrischen Zytometrie-Ansätze kann einen Einblick in die Anzahl, den Phänotyp und die Funktion der myeloischen Zellpopulation sowohl bei der angeborenen Immunantwort auf CE-Ischämie geben. Um das CCA zuerst zu ligieren, machen Sie unter einem Operationsmikroskop einen ein Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie um die ventrale Oberfläche des Halses des Tieres.Verwenden Sie nach der Präparierung eine Nylonnaht mit sechs Nullen, um den linken CCA mit einem dauerhaften Knoten zu verschließen, um den distalen MCA zu ligieren. Als nächstes machen Sie einen horizontalen Schnitt am Schläfenmuskel von rechts nach links. Machen Sie dann einen zweiten vertikalen Schnitt auf der rechten Seite des Schläfenmuskels.Achten Sie darauf, dass die Schläfenvene nicht durchtrennt wird. Ziehen Sie den Schläfenmuskel vom Schädel weg und halten Sie ihn mit einer Naht fest, um eine saubere Schädeloberfläche zu erhalten. Reinigen Sie dann den Schädel mit kalter, steriler Kochsalzlösung, um die genaue Position des linken MCA über die Schädeltransparenz zu erkennen.Sobald das MCA identifiziert wurde, führen Sie mit einem Edelstahlfräser eine ein Millimeter große runde Kraniotomie im Frontallappen zwischen dem Jochbogen und dem Schuppenbein durch. Entfernen Sie vorsichtig den Schädel, der die MCA freilegt. Verwenden Sie dann eine Nylonnaht mit neun Nullen, um den linken MCA im distalen Rumpf kurz vor der Bifurkation zwischen dem vorderen und dem hinteren MCA-Ast mit einem dauerhaften Knoten zu verschließen.Um das Gehirn zu entfernen, enthaupten Sie die eingeschläferte Maus direkt über dem Rückenmark und machen Sie einen hinteren vorderen Schnitt in der Haut, um den Schädel freizulegen. Machen Sie dann zwei seitliche Schnitte an der Verbindungsstelle der Seitenwände und der Schädelbasis und entfernen Sie das kleine Knochenstück. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt durch den Schädel entlang der sagittalen Naht und entfernen Sie mit einer Pinzette den Schädel, der über jeder Hemisphäre liegt, um das Gehirn freizulegen.Trennen Sie das Gehirn mit einem Spatel vom Schädel und überführen Sie es in eine 4%ige PFA-Lösung. Entfernen Sie nach drei Stunden das PFA und inkubieren Sie das Gehirn in einer 30%igen Saccharoselösung, um das Gehirn kryosicher zu schützen. Entfernen Sie nach 48 Stunden die Saccharoselösung und frieren Sie das Gehirn schnell in minus 40 Grad Celsius heißem Isop Pentan ein, dann verwenden Sie ein Gefriermikrotom, um 30 Mikrometer große koronale Gehirnschnitte herzustellen.Sammeln von 10 Seriensets in einer Kryo-Konservierungslösung. Jeder Seriensatz besteht aus etwa 14 bis 16 koronalen Schichten mit einem Abstand zwischen den Schichten von 300 Mikrometern. Um eine adäquate Probenahme des Mausgehirns zwischen 1,94 und minus 2,46 posterior zum bgma zu gewährleisten, um die Gesamtzahl der infiltrierten Neutrophilen zu schätzen.Nach MCA-Okklusion durch einen optischen Fraktionator werden die Neutrophilen zunächst mit dem Ratten-Anti-LY-Sechs-G-Antikörper und dem entsprechenden Sekundärantikörper auf Schwimmerschnitten mittels konventioneller Immunfluoreszenztechnik immungefärbt. Montieren Sie dann die Hirnschnitte auf Super Frosts-Objektträger, wobei der Infarktbereich auf der rechten Seite platziert ist, und öffnen Sie die Stereo Investigator Software. Klicken Sie anschließend auf das Menü des seriellen Abschnittsmanagers des Tools und fügen Sie mit der Schaltfläche Neuer Abschnitt einen neuen Abschnitt hinzu.Legen Sie das Auswertungsintervall auf 10 für eine Stichprobenfraktion von einer 10. Schicht fest. Wählen Sie dann im Menü "Kontur nach unten" das Konturwerkzeug für den infarktierten Bereich aus. Zeichnen Sie eine Kontur, um den Inzessionsbereich unter dem 10-fach-Ziel zu umreißen.Wechseln Sie dann zum 100 x Objektiv am Mikroskop und unter dem Objektivmenü. Um die Neutrophilen unter dem Sondenmenü zu quantifizieren, wählen Sie nun den optischen Fraktionator aus und stellen Sie die XY-Platzierung der Zählrahmen sowohl für die X- als auch für die Y-Gittergröße auf 230 ein. Wählen Sie nun den Neutrophilen-Button aus der Markierungsleiste aus und markieren Sie die gefärbten Neutrophilen im Infarktbereich.Exportieren Sie die Ergebnisse der Quantifizierung in eine Tabellenkalkulationsdatei, um das Gehirn in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Nachdem das Gehirn, wie gerade gezeigt, entfernt wurde, präparieren Sie den Kern- und den Pro-Infarkt-Bereich des ipsilateralen Kortex aus dem Gehirn einer ischämischen Maus des Gehirns. Wiegen Sie das Hirngewebe und legen Sie es in fünf Milliliter eiskaltes RPMI pro Anruf, um eine Normalisierung zwischen den Versuchsgruppen zu erreichen, und verwenden Sie dann einen Gewebeschleifer mit Teflonstößeln, um das Gewebe in eine einzellige Suspension zu dissoziieren.Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein 50-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen und geben Sie fünf weitere Milliliter RPMI-Lösung pro Aufruf zu den Proben. Nach dem Zentrifugieren der Zellsuspensionen für 30 Minuten bei 7.800 GS und 25 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass eine weiße, dem Myelin entsprechende Schicht oben auf der Lösung erscheint.Entfernen Sie vorsichtig die Myelinschicht und filtrieren Sie die gesamte Zellsuspension, einschließlich der pelletierten Zellen, durch ein 40-Mikrometer-Nylonnetzsieb. Waschen Sie das Sieb mit 10 Millilitern RPMI, um sicherzustellen, dass alle Zellen durch das Netz gefiltert werden, und geben Sie die Lösung dann in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 20 Milliliter RPMI in die Zellen und resuspendieren Sie dann nach dem Schleudern der Zellen das Leukozytenpellet.In einem Milliliter PBS inkubieren Sie die Zellen für zwei bis drei Minuten in vier Millilitern Lysepuffer bei Raumtemperatur, um die Erythrozyten zu lyzieren und dann die Zellen herunterzuschleudern. Markieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern PBS mit 1%BSA und den entsprechenden Antikörpern auf Eis. Waschen Sie die Proben nach 45 Minuten mit einem Milliliter kaltem PBS und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern Fax-Flow-Puffer für die durchflusszytometrische Analyse.Dieses Modell zeichnet sich durch hochgradig reproduzierbare Infarktvolumina 24 Stunden nach einem Verschluss der mittleren Hirnarterie aus, die mit der Cavalieri-Methode geschätzt werden. In nial gefärbten Schnitten ist die Neutrophileninfiltration in Übereinstimmung mit früheren Studien direkt mit der Infarktgröße korreliert. Darüber hinaus ermöglichen die Leukozytenisolierung und die durchflusszytometrische Charakterisierung die Isolierung myeloischer Zellen aus dem Kortex der IPS-Läsionshemisphäre von ischämischen Mäusen, die 10 bis 30 % der gesamten in der Zellsuspension gefundenen Ereignisse ausmachen und einen niedrigen Vorwärtsstreuparameter aufweisen, der mit zellulären Trümmern assoziiert ist.Die CD 11 B-positiven Zellen haben einen höheren Vorwärtsstreuwert, was darauf hindeutet, dass Zelltrümmer nicht mit diesem Marker markiert sind, und dass sie, wie bereits erwähnt, von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können, indem die FSC-Schwelle auf 200 gesetzt wird. Sechs G-positive Zellen, die als LY charakterisiert werden, sind die zahlreichste infiltrierte Zellpopulation, die 24 Stunden nach dem MCA-Verschluss im ischämischen Mausgehirn unter Verwendung dieses Modells der zerebralen Ischämie gefunden wurde. umfassen 70 bis 80 % der CD 11 B positiven CD 45 hohen Zellen. Der Rest der Zellen besteht hauptsächlich aus einer Subpopulation von CD 11 B, positiver CD 45, hoher LY sechs G und negativ sechs C hoher proinflammatorischer Monozyten, die 24 bis 48 Stunden nach dem Verschluss der mittleren Hirnarterie in erhöhter Zahl in den ischämischen Hirnbereichen zu finden sind. Dieses P-M-C-A-O-Modell kann in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß nach dem Durchflusszytometrieverfahren durchgeführt wird.Andere Methoden, wie z.B. die Sortierung einer bestimmten Zelluntergruppe, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Expressionsmuster, metabolischen Veränderungen oder essigsäurehaltigen Aktivitäten myeloischer Zellen in diesem Modellsystem. Nachdem ich dieses Video gesehen habe, um ein gutes Verständnis dafür zu bekommen, wie man ein Ischämiemodell erstellt und vor allem, wie man die Anzahl und den Phänotyp der infiltrierenden myeloischen Zellen durch zwei verschiedene Ansätze bei einem Maus-Hirn-Trauma oder tpe nach zeres Ischämie-Modell charakterisiert.

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Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie (Video) | JoVE Journal

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

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