Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, myeloische Zelluntergruppen der Maus des ischämischen Gehirns mit zwei verschiedenen Methoden zu charakterisieren. Zunächst wird ein permanentes Modell der zerebralen Ischämie eingeführt, indem sowohl die Arteria carotis communis (CCA) als auch der distale Stamm der Arteria cerebrale media (MCA) verschlossen werden, was zu einem Infarkt führt, der hauptsächlich die Hirnrinde betrifft. Für die stereologische Quantifizierung der myeloischen Zelluntergruppen werden dann serielle koronale Abschnitte des Gehirns für die interessierenden Zellen immungefärbt, und dann werden die infiltrierten Zellen durch den optischen Fraktionatoransatz quantifiziert.

Alternativ können die myeloischen Zellen durch mechanische Dissoziation aus frischem Hirngewebe isoliert und anschließend durch Durchflusszytometrie gefärbt und analysiert werden. Letztendlich kann eine genaue Quantifizierung und detaillierte qualitative Charakterisierung der spezifischen myeloischen Zelluntergruppen, die nach einer zerebralen Ischämie das Gehirn der Maus infiltrieren, durch Stereoquantifizierung bzw. multiparametrische Durchflusszytometrie erreicht werden. Der Hauptvorteil dieses Ischämie-Serienmodells gegenüber anderen bestehenden besteht darin, dass unsere Technik eine signifikant niedrigere Sterblichkeitsrate als andere Methoden aufweist und so die Anzahl der für die Studie erforderlichen Tiere minimiert.

In diesem Bereich gibt es eine Methode, die helfen kann, Schlüsselfragen im Schlaganfallbereich zu beantworten, wie z.B. welche Rolle die Mikroreaktivierung, die Extravasation von hämatogenen Makrophagen oder Neutrophilen bei Hirnverletzungen spielen. Die genaue theologische Quantifizierung der in dieser Arbeit gezeigten multiparametrischen Zytometrie-Ansätze kann einen Einblick in die Anzahl, den Phänotyp und die Funktion der myeloischen Zellpopulation sowohl bei der angeborenen Immunantwort auf CE-Ischämie geben. Um das CCA zuerst zu ligieren, machen Sie unter einem Operationsmikroskop einen ein Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie um die ventrale Oberfläche des Halses des Tieres.

Verwenden Sie nach der Präparierung eine Nylonnaht mit sechs Nullen, um den linken CCA mit einem dauerhaften Knoten zu verschließen, um den distalen MCA zu ligieren. Als nächstes machen Sie einen horizontalen Schnitt am Schläfenmuskel von rechts nach links. Machen Sie dann einen zweiten vertikalen Schnitt auf der rechten Seite des Schläfenmuskels.

Achten Sie darauf, dass die Schläfenvene nicht durchtrennt wird. Ziehen Sie den Schläfenmuskel vom Schädel weg und halten Sie ihn mit einer Naht fest, um eine saubere Schädeloberfläche zu erhalten. Reinigen Sie dann den Schädel mit kalter, steriler Kochsalzlösung, um die genaue Position des linken MCA über die Schädeltransparenz zu erkennen.

Sobald das MCA identifiziert wurde, führen Sie mit einem Edelstahlfräser eine ein Millimeter große runde Kraniotomie im Frontallappen zwischen dem Jochbogen und dem Schuppenbein durch. Entfernen Sie vorsichtig den Schädel, der die MCA freilegt. Verwenden Sie dann eine Nylonnaht mit neun Nullen, um den linken MCA im distalen Rumpf kurz vor der Bifurkation zwischen dem vorderen und dem hinteren MCA-Ast mit einem dauerhaften Knoten zu verschließen.

Um das Gehirn zu entfernen, enthaupten Sie die eingeschläferte Maus direkt über dem Rückenmark und machen Sie einen hinteren vorderen Schnitt in der Haut, um den Schädel freizulegen. Machen Sie dann zwei seitliche Schnitte an der Verbindungsstelle der Seitenwände und der Schädelbasis und entfernen Sie das kleine Knochenstück. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt durch den Schädel entlang der sagittalen Naht und entfernen Sie mit einer Pinzette den Schädel, der über jeder Hemisphäre liegt, um das Gehirn freizulegen.

Trennen Sie das Gehirn mit einem Spatel vom Schädel und überführen Sie es in eine 4%ige PFA-Lösung. Entfernen Sie nach drei Stunden das PFA und inkubieren Sie das Gehirn in einer 30%igen Saccharoselösung, um das Gehirn kryosicher zu schützen. Entfernen Sie nach 48 Stunden die Saccharoselösung und frieren Sie das Gehirn schnell in minus 40 Grad Celsius heißem Isop Pentan ein, dann verwenden Sie ein Gefriermikrotom, um 30 Mikrometer große koronale Gehirnschnitte herzustellen.

Sammeln von 10 Seriensets in einer Kryo-Konservierungslösung. Jeder Seriensatz besteht aus etwa 14 bis 16 koronalen Schichten mit einem Abstand zwischen den Schichten von 300 Mikrometern. Um eine adäquate Probenahme des Mausgehirns zwischen 1,94 und minus 2,46 posterior zum bgma zu gewährleisten, um die Gesamtzahl der infiltrierten Neutrophilen zu schätzen.

Nach MCA-Okklusion durch einen optischen Fraktionator werden die Neutrophilen zunächst mit dem Ratten-Anti-LY-Sechs-G-Antikörper und dem entsprechenden Sekundärantikörper auf Schwimmerschnitten mittels konventioneller Immunfluoreszenztechnik immungefärbt. Montieren Sie dann die Hirnschnitte auf Super Frosts-Objektträger, wobei der Infarktbereich auf der rechten Seite platziert ist, und öffnen Sie die Stereo Investigator Software. Klicken Sie anschließend auf das Menü des seriellen Abschnittsmanagers des Tools und fügen Sie mit der Schaltfläche Neuer Abschnitt einen neuen Abschnitt hinzu.

Legen Sie das Auswertungsintervall auf 10 für eine Stichprobenfraktion von einer 10. Schicht fest. Wählen Sie dann im Menü "Kontur nach unten" das Konturwerkzeug für den infarktierten Bereich aus. Zeichnen Sie eine Kontur, um den Inzessionsbereich unter dem 10-fach-Ziel zu umreißen.

Wechseln Sie dann zum 100 x Objektiv am Mikroskop und unter dem Objektivmenü. Um die Neutrophilen unter dem Sondenmenü zu quantifizieren, wählen Sie nun den optischen Fraktionator aus und stellen Sie die XY-Platzierung der Zählrahmen sowohl für die X- als auch für die Y-Gittergröße auf 230 ein. Wählen Sie nun den Neutrophilen-Button aus der Markierungsleiste aus und markieren Sie die gefärbten Neutrophilen im Infarktbereich.

Exportieren Sie die Ergebnisse der Quantifizierung in eine Tabellenkalkulationsdatei, um das Gehirn in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Nachdem das Gehirn, wie gerade gezeigt, entfernt wurde, präparieren Sie den Kern- und den Pro-Infarkt-Bereich des ipsilateralen Kortex aus dem Gehirn einer ischämischen Maus des Gehirns. Wiegen Sie das Hirngewebe und legen Sie es in fünf Milliliter eiskaltes RPMI pro Anruf, um eine Normalisierung zwischen den Versuchsgruppen zu erreichen, und verwenden Sie dann einen Gewebeschleifer mit Teflonstößeln, um das Gewebe in eine einzellige Suspension zu dissoziieren.

Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein 50-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen und geben Sie fünf weitere Milliliter RPMI-Lösung pro Aufruf zu den Proben. Nach dem Zentrifugieren der Zellsuspensionen für 30 Minuten bei 7.800 GS und 25 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass eine weiße, dem Myelin entsprechende Schicht oben auf der Lösung erscheint.

Entfernen Sie vorsichtig die Myelinschicht und filtrieren Sie die gesamte Zellsuspension, einschließlich der pelletierten Zellen, durch ein 40-Mikrometer-Nylonnetzsieb. Waschen Sie das Sieb mit 10 Millilitern RPMI, um sicherzustellen, dass alle Zellen durch das Netz gefiltert werden, und geben Sie die Lösung dann in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 20 Milliliter RPMI in die Zellen und resuspendieren Sie dann nach dem Schleudern der Zellen das Leukozytenpellet.

In einem Milliliter PBS inkubieren Sie die Zellen für zwei bis drei Minuten in vier Millilitern Lysepuffer bei Raumtemperatur, um die Erythrozyten zu lyzieren und dann die Zellen herunterzuschleudern. Markieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern PBS mit 1%BSA und den entsprechenden Antikörpern auf Eis. Waschen Sie die Proben nach 45 Minuten mit einem Milliliter kaltem PBS und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern Fax-Flow-Puffer für die durchflusszytometrische Analyse.

Dieses Modell zeichnet sich durch hochgradig reproduzierbare Infarktvolumina 24 Stunden nach einem Verschluss der mittleren Hirnarterie aus, die mit der Cavalieri-Methode geschätzt werden. In nial gefärbten Schnitten ist die Neutrophileninfiltration in Übereinstimmung mit früheren Studien direkt mit der Infarktgröße korreliert. Darüber hinaus ermöglichen die Leukozytenisolierung und die durchflusszytometrische Charakterisierung die Isolierung myeloischer Zellen aus dem Kortex der IPS-Läsionshemisphäre von ischämischen Mäusen, die 10 bis 30 % der gesamten in der Zellsuspension gefundenen Ereignisse ausmachen und einen niedrigen Vorwärtsstreuparameter aufweisen, der mit zellulären Trümmern assoziiert ist.

Die CD 11 B-positiven Zellen haben einen höheren Vorwärtsstreuwert, was darauf hindeutet, dass Zelltrümmer nicht mit diesem Marker markiert sind, und dass sie, wie bereits erwähnt, von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können, indem die FSC-Schwelle auf 200 gesetzt wird. Sechs G-positive Zellen, die als LY charakterisiert werden, sind die zahlreichste infiltrierte Zellpopulation, die 24 Stunden nach dem MCA-Verschluss im ischämischen Mausgehirn unter Verwendung dieses Modells der zerebralen Ischämie gefunden wurde. umfassen 70 bis 80 % der CD 11 B positiven CD 45 hohen Zellen. Der Rest der Zellen besteht hauptsächlich aus einer Subpopulation von CD 11 B, positiver CD 45, hoher LY sechs G und negativ sechs C hoher proinflammatorischer Monozyten, die 24 bis 48 Stunden nach dem Verschluss der mittleren Hirnarterie in erhöhter Zahl in den ischämischen Hirnbereichen zu finden sind. Dieses P-M-C-A-O-Modell kann in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß nach dem Durchflusszytometrieverfahren durchgeführt wird.

Andere Methoden, wie z.B. die Sortierung einer bestimmten Zelluntergruppe, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Expressionsmuster, metabolischen Veränderungen oder essigsäurehaltigen Aktivitäten myeloischer Zellen in diesem Modellsystem. Nachdem ich dieses Video gesehen habe, um ein gutes Verständnis dafür zu bekommen, wie man ein Ischämiemodell erstellt und vor allem, wie man die Anzahl und den Phänotyp der infiltrierenden myeloischen Zellen durch zwei verschiedene Ansätze bei einem Maus-Hirn-Trauma oder tpe nach zeres Ischämie-Modell charakterisiert.