Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist der Nachweis von neuronalen Anti-D-, zwei R- oder N-M-D-A-R-Antikörpern in Patientenproben unter Verwendung eines zellbasierten Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie-basierten Assays. Dies wird durch Sub-Cling erreicht, die vollständige CDNA-Sequenz von menschlichem D zwei R oder N-M-D-A-R innerhalb eines Plasmids. In einem zweiten Schritt wird eine humane Zelllinie transfiziert, was zur Expression neuronaler Antigene auf der Zelloberfläche führt.

Anschließend werden die transfizierten Zellen mit Patientenserum und einem geeigneten Sekundärantikörper inkubiert, bevor sie mit einer Durchflusszytometrie aufgenommen werden. Um die Bindung von Antikörpern an Zelloberflächenantigene nachzuweisen, werden die Ergebnisse auf der Grundlage der Durchflusszytometrie erhalten. Unser zellbasierter Assay mit hohem Drei-Port-Durchflusszytometrie ist schnell, quantitativ und effizient für große Kohorten von Patientenproben.

Dies ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber der Verwendung eines zellbasierten Assays mit Immunchemie und konfokaler Analyse. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, im Laufe des Experiments mit dem Verlust von Zellen zu kämpfen, um die entsprechende Anzahl von Zellen am Durchflusszytometer zu erhalten. Achten Sie darauf, dass Sie zwischen den Wäschen keine Zellen absaugen.

Wählen Sie einen Expressionsvektor, der für die Expression von Transmembranproteinen geeignet ist und die zelluläre Co-Expression der Antigene und des grün fluoreszierenden Proteins getrennt ermöglicht. Zum Beispiel weist dieser Vektor einen verstärkten GFP-Reporter auf, der unter der Kontrolle einer internen Ribosomeneintrittsstelle die menschliche CD NA in voller Länge in den Vektor unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme subkloniert, nachdem die Klone durch Sequenzierung verifiziert wurden, Plasmidstämme herzustellen, die für die Verwendung in Transfektkulturen geeignet sind. Die HEK 2 93 Zellen in komplettem DMEM mit 10% fötalem Rinderserum.

Ernten Sie die Zellen mit Trypsin nach einer Wäsche, zentrifugieren Sie die Zellen und reanimieren Sie das Zellpellet in frischem, vollständigem DMM. Zählen Sie die Zellen, säen Sie dann zwei Milliliterkulturen in sechs Well-Platten mit etwa 70 % Co-Flüssigkeit und ordnen Sie die Wells von HEK 2 93 Zellen für die Transfektion mit den Expressionskonstrukten sowie dem Kontrollvektor zu. Bewahren Sie einen Teil auf transfizierten HEK 2 93-Zellen auf, um sie später zu kompensieren.

Bereiten Sie die Transfektionsmischungen vor, die aus 200 Mikrolitern 0,9 % Natriumchlorid, 2,5 Mikrogramm DNA und vier Mikrogramm Polyethylen pro Milliliter bestehen. Sofort 10 Sekunden lang vortexen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bevor die Transfektionsmischung in jede Vertiefung von zwei Millilitern frischem vollständigem dmm gegeben wird. Decken Sie die Platte ab, umwickeln Sie die Seiten mit Perfil und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 280 GS, um die Zelltransfektion zu unterstützen.

Entfernen Sie dann die Para-Folie und stellen Sie die Platte 18 Stunden lang unter Kulturbedingungen. Ersetzen Sie die Nährmedien durch frisches, vollständiges DM EM und bewahren Sie sie weitere 72 Stunden in der Kultur auf. Um die Zellen zu lösen, geben Sie 500 Mikroliter Schinken in jede Vertiefung und inkubieren Sie etwa fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Dann resuspendieren Sie die Zellen jeder Vertiefung in zwei Millilitern 2%FBS in PBS und übertragen Sie die Zellen nach drei Wäschen in ein konisches Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellpaletten bei 1 Million Zellen pro Milliliter in 2%iger FBS-Lösung. Entwerfen Sie nun das 96-Well-Template für die Durchflusszytometrie-Erfassung so, dass die verschiedenen Zelllinien mit jeder Patientenprobe oder jedem primären Antikörper behandelt werden.

Säen Sie dann 50.000 Zellen pro Vertiefung in einer V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen und pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 450 g zentrifugieren. Kippen Sie eine Platte in einem Winkel und entfernen Sie vorsichtig das Supra-Natin, wobei Sie darauf achten, dass das Zellpellet nicht abgesaugt wird. Als nächstes fügen Sie eine serielle Verdünnung des primären Antikörpers hinzu, um die Expression der Antigenoberfläche zu beurteilen.

Und dann Patientenproben, um Antikörper nachzuweisen, inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln nach drei Wäschen in 170 Mikrolitern 2%iger FBS-Lösung, fügen Sie den entsprechenden konjugierten Sekundärantikörper AF 6 47 Anti-Human-IgG für den Patienten und Anti-US-Antikörper hinzu. IgG für Primärantikörper. Nach drei Wäschen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln hybridisieren.

Resus suspendiert die Zellen in 35 Mikrolitern 2%iger FBS-Lösung für die Durchflusszytometrie-Zellentnahme am Durchflusszytometer. Richten Sie zunächst den Hochdurchsatz-Probenehmer ein. Erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Vertiefung gemäß der Durchflusszytometrie-Erfassungsvorlage.

Exportieren Sie die Daten und analysieren Sie sie dann mit einem Durchflusszytometrie-Softwarepaket, um die lebenden HEK 2 93-Zellen auf der Grundlage von Vorwärts-Innenstreuungen zu erfassen. Gate auch auf eine hohe GFP-Positivität, um nur die transfizierten Zellen zu analysieren. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität des AF 6 47-Kanals innerhalb der lebenden GFP-positiven Zellen.

Exportieren Sie dann die Daten zur Analyse in Excel oder Prisma. Die Konzentrationen des Primärantikörpers sind im Vergleich zum MFI, der aus den entsprechenden Proben für jeden Patienten und jede Kontrollprobe erhalten wurde, darzustellen. Bestimmen Sie den Delta-MFI: Berechnen Sie den Schwellenwert der Antikörperpositivität, indem Sie drei Standardabweichungen über dem mittleren Delta-MFI der Kontrollkohorte addieren.

Plotten Sie dann die einzelnen Stichproben gruppiert nach Patientengruppe auf einer Grafik auf. Stellen Sie den Schwellenwert hier als Linie dar. Zellen, die entweder den n-Methyl-de-Aspartat-Rezeptor oder den Dopamin-2-Rezeptor exprimieren, wurden am Durchflusszytometer unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probenehmers erfasst.

Während der Analyse wurden die Zellen auf der Grundlage der Vorwärtsstreuung für die Größe und der Seitenstreuung für die Granularität gegated. TRANSFIZIERTE HK 2 9 3 Zellen exprimierten das GFP-Reportermolekül im Zytoplasma und UNT-transfizierte Zellen wurden von der Analyse innerhalb des GFP-positiven Gangs ausgeschlossen. Der MFI, der mit der Bindung an konjugierte anti-humane IgG-Sekundärantikörper assoziiert ist, wurde gemessen, um die Hintergrundfluoreszenz bei der Analyse humaner Seren zu eliminieren.

Die Delta-MFI wurde berechnet, indem die Hintergrund-MFI der Kontrollzellen subtrahiert wurde. Dieser zellbasierte Assay für die Durchflusszytometrie basiert auf dem Antikörpernachweis des interessierenden Zelloberflächenantigens. Zum Beispiel zeigten die a GK 2 93-Zellen, die mit dem Expressionsplasmid für N-M-D-A-R transfiziert wurden, eine hohe Expression der Oberfläche und des Methyl-De-Rezeptors.

In ähnlicher Weise exprimierten die D-zwei R-transfizierten Zellen den Dopamin-Zwei-Rezeptor, während die kontrollierten Zellen keines dieser Antigene exprimierten. In dieser klinischen Studie wurde eine Patientenkohorte mit N-M-D-A-R-Enzephalitis, eine Patientenkohorte mit D-Zwei-R-Antikörper-assoziierter Enzephalitis und eine Kontrollkohorte mit anderen nicht-entzündlichen neurologischen Erkrankungen untersucht. Es ist zu beachten, dass keiner der positiven Patienten doppelt positiv auf Antikörper war.

Targeting N-M-D-A-R-M-D zwei R wie erwartet. Die Antikörper N-M-D-A-R und D zwei R wurden in keiner der analysierten Kontrollen nachgewiesen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden mit einer Stunde Flusserfassung für etwa 80 Proben nach ihrer Entwicklung ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neuroimmunologie den Weg, um neuartige Antikörperziele bei immunvermittelten Erkrankungen zu entdecken.