Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Umbau des endlysosomalen Systems durch intrazelluläre Bakterien unter Verwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln als Tracer zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Fernazellen zunächst in einem Objektträger mit acht Vertiefungen ausgesät und über Nacht inkubiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit Salmonellen und Tarica zu infizieren.

Als nächstes wird eine Pulsverfolgungsmarkierung von infizierten Wirtszellen durch Inkubation mit Gold-BSA-Rumin-Nanopartikeln durchgeführt. Der letzte Schritt besteht darin, Veränderungen des endosomalen Systems der Wirtszelle durch konfokale Mikroskopie zu beobachten. Letztendlich erfolgt die Quantifizierung der intrazellulären Verteilung von Nanopartikeln mit Hilfe des MRS-Softwarepakets.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunmikroskopie besteht darin, dass n infizierte Zellen mit der Methode analysiert werden, die einen Einblick in die intrazelluläre Lebensweise von Terica geben kann. Es kann aber auch auf andere intrazelluläre Krankheitserreger wie Gaia-Spezies, Ella Prolia oder Mycobacterium tuberculosis angewendet werden. Es kann auch auf andere Wirtszelltypen wie Mikrofeh, Zelllinien oder Primärzellen angewendet werden.

Die Synthese von 10-Nanometer-Gold-Nanopartikeln oder NPS erfordert zwei Lösungen: Lösung A und Lösung B.To Herstellung von Lösung A, fügen Sie zwei Milliliter 1%iges wässriges Goldchlorid in 160 Milliliter Milli Q-Wasser hinzu. Bereiten Sie Lösung B vor, indem Sie acht Milliliter 1%Trinatriumcitrat-Dihydrat und 160 Mikroliter 1%Gerbsäure in 32 Milliliter Milli Q-Wasser geben. Die Lösungen A und B auf 60 Grad Celsius erwärmen und anschließend unter Rühren verrühren.

Eine dunkelblaue Färbung sollte unmittelbar nach ca. 15 Minuten beobachtet werden. Die Lösung sollte sich zu diesem Zeitpunkt rot färben. Erhitzen Sie die Lösung auf 95 Grad Celsius.

Halten Sie es fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius und kühlen Sie die Lösung dann auf Raumtemperatur ab. Bereiten Sie das goldene Stück für die Beschichtung und Etikettierung vor, indem Sie 900 Mikroliter Gold MPS in ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen geben und 30 Minuten lang bei 15.000 g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 900 Mikrolitern sterilisiertem MQ-Wasser.

Fügen Sie 100 Mikroliter A BSA-Lösung hinzu und mischen Sie sie 30 Minuten lang bei 800 U/min auf einem Wirbel. Entfernen Sie überschüssiges BSA, indem Sie das Präparat 60 Minuten lang bei 15.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Der Überstand wird verworfen und das Gold, BSA, NPS und 125 Mikroliter PBS werden wieder suspendiert.

Fügen Sie 12,5 Mikroliter eines molaren Bikarbonats hinzu. Die R-dominant-n-Hydroxy-CIN-Ester oder NHS-Lösung wird unmittelbar zuvor in DMSO hergestellt. Bei 15 Mikrolitern R DOMINE N-H-S-D-M-S-O Lösung auf 0,5 Milliliter der Gold BSA NP Suspension anwenden.

Inkubieren Sie die Reaktion zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, während Sie bei 800 U/min mischen und Lichteinwirkung vermeiden. Als nächstes reinigen Sie den Gold-BSA-Romin-NPS durch Dialyse gegen PBS bei vier Grad Celsius mit fünf Pufferwechseln über einen Zeitraum von 36 bis 48 Stunden nach der Reinigung, stabilisieren Sie den NPS, indem Sie 10 Mikroliter B-S-A-P-B-S in jeweils einen Milliliter Gold-BSA-RUMINE NPS geben, um die freie oder freigesetzte BSA-Rumin-Zentrifuge bei 15 zu entfernen. 000 GS für 16 Minuten bei vier Grad Celsius. Resus: Suspendieren Sie das Pellet in zwei Milligramm pro Milliliter B-S-A-P-B-S, nachdem Sie die optische Dichte bei 520 Nanometern oder OD fünf 20 gemessen haben.

Lagern Sie das Gold BSA Rod Domine NPS bei vier Grad Celsius, vermeiden Sie die Einwirkung von Licht, die die Zellen für dieses Experiment dauerhaft exprimieren, ein grün fluoreszierendes Protein, das mit lysosomalem Glykoprotein-Lampe markiert ist, ein GFP und werden in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre kultiviert, die 5% Kohlendioxid enthält, säen die Zellen bei einer Dichte von 50, 000 pro Vertiefung in einer Kammer mit acht Vertiefungen und über Nacht inkubieren. Das Bakterium für die Infektion der Hela-Zellen ist der humane Magen-Darm-Erreger, Salmonellen und Tarica. Zum Vergleich werden zwei mutierte Stämme verwendet.

Alle drei Stämme beherbergen ein Plasmid für die konstitutive Expression von erhöhtem GFP und werden in LB-Bouillon mit den entsprechenden Antibiotika kultiviert, um die Plasmide für jeden Stamm zu erhalten. Beimpfen Sie eine einzelne Bakterienkolonie in drei Millilitern LB-Brühe mit dem passenden Antibiotikum und wachsen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Unter Schüttelbedingungen für die Belüftung am folgenden Tag jede Kultur um 1 bis 31 in frischer LB-Brühe verdünnen und dreieinhalb Stunden lang weiterwachsen.

Um dieses Verfahren zu starten, messen Sie den OD 600 der Subkulturbakterien und verdünnen Sie ihn auf einen OD 600 von 0,2. In einem Milliliter PBS fügen Sie den Hela-Zellen im 12-Kammer-Objektträger A eine angemessene Menge an Bakterien hinzu, um eine Infektionsmultiplizität von 100 zu erreichen. 30 Minuten im Zellinkubator inkubieren.

Waschen Sie die Helazellen dreimal mit PBS, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen. Dieser Zeitpunkt wird auf null Stunde nach der Infektion oder null Stunde pi festgelegt. Geben Sie 300 Mikroliter frisches Kulturmedium mit 100 Mikrogramm Gentamicin pro Milliliter zu den Zellen und halten Sie es eine Stunde lang aufrecht.

Nach einer Stunde. Ersetzen Sie das Medium durch ein bildgebendes Medium, das 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin enthält. Geben Sie Gold-BSA-Romin-NPS zu den Hela-Zellen, um eine Endkonzentration von OD fünf 20 von 0,1 zu erhalten.

Nach einer Stunde eine Stunde lang inkubieren. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es dreimal mit PBS. Zum Schluss fügen Sie 300 Mikroliter frisches Bildgebungsmedium hinzu, das 10 % FCS und 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin enthält.

Für den Rest der Inkubationszeit wird eine hochauflösende Bildgebung der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten mit einem konfokalen Bildgebungssystem wie einem konfokalen Laserscanning- oder Spinning-Disc-Mikroskop mit einer befeuchteten Umgebungskammer durchgeführt. Schalten Sie das Temperaturregelsystem ein und warten Sie, bis es stabil ist. Optimieren Sie die Bildgebungseinstellungen, z. B. die Scanvergrößerung, die Geschwindigkeitsauflösung und die Z-Schrittweite. Verwenden Sie geeignete Erregungsemissionseinstellungen für GFP und Gold-BSA-Panme NPS zu angegebenen Zeitpunkten nach der Infektion.

Montieren Sie den Objektträger mit 12 Kammern mit infizierten Zellen auf den Mikroskoptisch und nehmen Sie Bilder auf, um die Bilder zu analysieren und den Umbau des endosomalen Systems durch intrazelluläre Salmonellen zu untersuchen. Verwenden Sie Bildanalysesoftware. Öffnen Sie die Daten, indem Sie auf Öffnen klicken und die Datei in der Objektsymbolleiste der Surpass-Ansicht auswählen.

Klicken Sie auf das Symbol, um ein neues Oberflächenelement hinzuzufügen. Um eine Interessenregion oder einen ROI zu analysieren, wählen Sie nur eine Interessenregion aus und klicken Sie dann als Quellkanal auf Weiter. Wählen Sie Kanal drei aus.

Aktivieren Sie die Option Glätten, um die Glätte des resultierenden Bereichs einzustellen. Definieren Sie manuell einen Wert oder übernehmen Sie den automatisch generierten Wert. Für Schwellenwert.

Wählen Sie die Option "Absolute Intensität" für die Schwellenwertanpassung aus. Wählen Sie die manuelle Option und legen Sie einen Wert im Anzeigebereich fest. Eine Vorschau des Oberflächenschwellenwerts wird grau angezeigt.

Klicken Sie auf Weiter auf dem Reiter Oberflächen klassifizieren. Die resultierende Oberfläche kann nach verschiedenen Kriterien gefiltert werden. Ein Standardfilter ist die Anzahl der V-Löcher größer als 10, andere Filter können auch durch Klicken auf Hinzufügen eingeschlossen werden.

In diesem Beispiel wird der Standardfilter verwendet, um die Oberflächenerstellung abzuschließen. Klicken Sie in der Objektliste auf Fertig. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Artikelvolumen.

Eine neu erstellte Fläche wird nun im Ansichtsbereich angezeigt. Exportieren Sie die Statistiken in rot, indem Sie auf Speichern klicken. Die mit diesem Protokoll synthetisierten Gold-NPS waren quasi kugelförmig und etwa 10 Nanometer groß.

Die BSA-Beschichtung und die Rho-Domine-Markierung hatten keinen Einfluss auf ihre Morphologie oder Größe. Untersuchung des Umbaus des zellulären endosomalen Systems des Wirts durch intrazelluläre Salmonellen. Hela-Zellen wurden scheininfiziert oder mit Wildtyp-Salmonellen oder zwei mutierten Stämmen infiziert und mit 10 Nanometer Gold gepulst.

BSA-Stäbchen dominieren in nicht infizierten Zellen, der NPS ist gleichmäßig in späten Endosomen oder Lysosomen verteilt. Im Gegensatz dazu waren die NPS in Wildtyp-Salmonellen-infizierten Zellen acht Stunden nach der Infektion weitgehend neu angeordnet. Es bildete sich ein stabilisiertes Netzwerk von Salmonellen-induzierten Filamenten oder Sieben, und die meisten mps wurden in den röhrenförmigen Strukturen akkumuliert

Die mutierten Stämme zeigten acht Stunden nach der Infektion unterschiedliche Verhaltensweisen. Der SSAV-mutierte Stamm war in den Salmonellen eingeschlossen, die VAE oder SCV enthielten. Obwohl keine Sichtungen gebildet wurden, befand sich die Mehrheit der mps immer noch in freien späten Endosomen oder Lysosomen für das Sif.

Es kam zu einem mutierten Stammaustritt von Salmonellen in das Zytoplasma und es wurde keine Assoziation zwischen NPS und Bakterien beobachtet. Bei der Untersuchung der Zugänglichkeit des endlysosomalen Systems in verschiedenen Phasen der Salmonelleninfektion zeigen die Ergebnisse, dass sich in allen Fällen der größte Teil des internalisierten NPS in den SCV oder SIFs nach diesem Verfahren akkumulierte. Andere Methoden, Halsübertragung mikroskopisch, können durchgeführt werden.

Dies könnte zusätzliche Fragen wie die Ultrastruktur oder Membrankompartimente in einigen nanoinfizierten Wirtszellen beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszierende Nanopartikel herstellt. Diese können verwendet werden, um Hoster-Kompartimente zu markieren, die durch intrazelluläre Salmonellen modifiziert sind.