Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Hallo, ich bin Tim Duso von Agriculture and AgriFood Canada. In diesem Video demonstrieren wir ein Protokoll zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Häufigkeit bestimmter Mikroorganismen in einer komplexen klinischen oder Umweltprobe mit einem Bioplex-Instrument. Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Polystyrolkügelchen, die chemisch an eine speziesspezifische Oligonukleotidsonde gekoppelt sind.

Aus der Probe wird unter Verwendung von universellen PCR-Primern ein Amplikon erzeugt und das Amplikon wird mit den sondengekoppelten Kügelchen hybridisiert. Mit dem bio plex Instrument werden zwei Signale erzeugt. Einer identifiziert die Perle und einer quantifiziert das Hybridisierungssignal.

Das übergeordnete Ziel des Verfahrens ist es, schnell und semi-quantitativ ein Profil der interessierenden Mikrobiota zu bestimmen. Wir haben diese Technik angewendet, um Bakterienprofile in Vaginalabstrichen zu bestimmen und die generierten Daten zur Diagnose der bakteriellen Vaginose zu verwenden, einer klinischen Erkrankung, die durch eine Veränderung der Mikrobiota gekennzeichnet ist, bei der Laktobazillen-Organismen weniger häufig vorkommen und andere Organismen wie Gardnerella, Vais und Apoian Vae in Vaginalabstrichen nachweisbar werden. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass diese Technik auf jede andere Mikrobiota angewendet werden kann, für die ein schneller Multiplex-Assay wünschenswert ist.

Beginnen wir damit, zu beschreiben, wie das Verfahren funktioniert. Ein mikrobielles Profil wird durch Amplifikation eines Proteins und eines Beschichtungsgens Chaperon in 60 von allen Organismen erzeugt, die im A-DNA-Extrakt des Tupfers vorhanden sind. Einer der universellen Amplifikationsprimer wird durch die Zugabe von Biotin sowie durch die Zugabe von phosphoatmodifizierten Basen modifiziert.

Am Ende der fünf Primzahlen wird das Amplikon mit Hilfe der Exon-Nuklease T sieben, die nur den Antisense-Strang abbaut, einzelsträngig gemacht. Da der Sensorstrang durch einen Phosphoat-modifizierten PCR-Primer geschützt ist, sind Oligonukleotidsonden, die zum verbleibenden Strang komplementär sind, kovalent an fluoreszierende Polystyrolkügelchen gekoppelt. Da jede einzigartige Kügelchenfarbe eine Sonde enthält, die einen anderen Organismus nachweist, können bis zu hundert verschiedene Kügelchen für eine einzige Probe verwendet werden.

Das einzelsträngige PCR-Produkt aus dem Vaginalabstrich wird mit einer sondengekoppelten Bead-Mischung hybridisiert, die Sonden für alle interessierenden Organismen enthält. Ein fluoreszierender Reporter FICO-Ethin wird hinzugefügt, der über ein Streptokokken-Din-Konjugat an die biotinylierten Sonden bindet. Schließlich wird das Hybridisierungsgemisch auf einem Luminex- oder Bioplex-Instrument analysiert, das jede Perle einzeln auf Identität und Hybridisierungssignal untersucht.

Die Ergebnisse dieser Analyse deuten auf das Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen hin, und die Intensität des Hybridisierungssignals korreliert mit der Häufigkeit dieses Organismus. In der Probe kann das Vorhandensein von BV-verwandten Organismen zur Diagnose von BV herangezogen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Grand Stain, besteht darin, dass Informationen über das Vorhandensein bestimmter Mikroorganismen und deren Häufigkeit generiert werden.

Das Verfahren wird von Jennifer Town, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin, demonstriert. In unserem Labor werden die Mikrosphären durch Vortexen für etwa 20 Sekunden suspendiert. 400 Mikroliter Mikrokügelchen werden eine Minute lang bei 14.000 G in eine Einor-Röhrchenzentrifuge überführt, die Snat Resus herausgenommen und entsorgt. Suspendieren Sie die Mikrosphären in 50 Mikrolitern 0,1 molar MES pH 4,5.

Geben Sie ein Animo Capture Oligo zu den Mikrokügelchen und mischen Sie es durch Vortexen. Geben Sie 2,5 Mikroliter frische EDC-Lösung zu den Mikrosphären. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Entsorgen Sie die zuvor hergestellte EDC-Lösung und bereiten Sie eine frische Probe von 10 Milligramm pro Milliliter EDC in Wasser vor. Geben Sie wie oben weitere 2,5 Mikroliter frische EDC-Lösung in die Mikrosphären und wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang auf. Erneut bei Raumtemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.

Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie einen Milliliter 0,02 %Tween 20 Wirbel hinzufügen, um die Kügelchen wieder zu resuspendieren, zentrifugieren Sie bei 14.000 mal G. Entfernen Sie eine Minute lang den Überstand und entsorgen Sie ihn. Waschen Sie die Kügelchen erneut, indem Sie einen Milliliter 0,1 % SDS Resus hinzufügen. Suspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern te Puffer.

Zählen Sie die Kügelchen in einem Hämozytometer auf, um die Stammkonzentration zu bestimmen. Bereiten Sie einen Mikrosphären-Mastermix vor, indem Sie jedes Kügelchen auf eine Endkonzentration von 100 Kügelchen pro Mikroliter in einem Pufferpool verdünnen. Die gekoppelten Kügelchen werden entsprechend dem gewünschten Plex des Assays gelagert. Lagern Sie den Mikrosphären-Mastermix bei vier Grad im Dunkeln. Diese Mischung kann monatelang gelagert werden, wenn sie unter diesen Bedingungen aufbewahrt wird, generieren Sie für jede Probe ein PCR-Produkt.

Fügen Sie das mit Phospholat und Biotin modifizierte Fünf-Prime-Primer-Set unmittelbar nach Abschluss der PCR hinzu. Geben Sie zwei Mikroliter T-7-Exonuklease in jedes PCR-Röhrchen und inkubieren Sie es 40 Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende dieser Inkubation fügen Sie 12,5 Mikroliter 0,5 molare E-D-T-A-P-H 8,0 in die Mischung ein.

Dies ergibt insgesamt etwa 64,5 Mikroliter einzelsträngiges PCR-Produkt. Resus Bend Microsphere Mastermix mit einer Pipette. Geben Sie eine angemessene Menge in ein Einor-Röhrchen.

Verschließen Sie das Röhrchen und beschallen Sie es zwei Minuten lang in einem Wasserbad. Geben Sie 17 Mikroliter des einzelsträngigen PCR-Produkts in die entsprechenden Vertiefungen mit einem niedrigen Profil 96. Auf der Well-Platte jeweils 33 Mikroliter resuspendierte beschallte Bead-Mischung hinzufügen.

Decken Sie die Platte gut mit einer Silikonabdeckung ab und klopfen Sie darauf. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Thermocycler mit einem Programm von 95 Grad für fünf Minuten, 60 Grad für 10 Minuten, 60 Grad Halten oder Pause von 60 Grad für fünf Minuten. Ende, starten Sie das Programm.

Stellen Sie frische Streptokokken Aden FICO Ethin Lösung her. Sie benötigen 25 Mikroliter pro Vertiefung. Stellen Sie Streptokokken und FICO-Ethin her, indem Sie den Stiel mit einem Milligramm pro Milliliter verdünnen.

Eins von 50 bis 20 Mikrogramm pro Milliliter mit dem Einmaligen tmac-Puffer. Wenn der Thermocycler den 60-Grad-Halteschritt erreicht, öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie die Silikonabdeckung und fügen Sie Streptokokken-Din-FICO-Ethin-Lösung direkt zu jedem hinzu. Setzen Sie die Silikonabdeckung wieder auf, schließen Sie den Deckel des Thermocyclers und setzen Sie das Programm fort.

Wenn das Programm abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte heraus und übertragen Sie sie schnell zum Lesen auf das Bioplex-Gerät. Die Platte sollte innerhalb von 10 Minuten abgelesen werden. Lesen Sie die Platte bei 60 Grad ab.

Stellen Sie sicher, dass der Bioplex auf diese Temperatur vorgewärmt wurde. Dies zeigt die Ergebnisse entsprechender Grammfärbungen und Luminex-Profile von Längsschnittproben eines einzelnen Individuums zum Zeitpunkt Null. Die Gram-Färbung stimmt mit einer klinischen Diagnose von bv überein und wird durch einen Fiveplex Luminex-Assay bestätigt, der positive Hybridisierungssignale für BV-assoziierte Organismen, einschließlich Gardner-Relikt, Vais und Apoian Vae, zeigt.

Lactobacillus Iners wird im Laufe der Zeit auch in geringen Mengen nachgewiesen. Dieses Individuum geht von einer BV-Mikrobiota zu einer normalen Mikrobiota über, wie Grammflecken zeigen. Die Luminex-Analyse derselben Proben zeigt, dass die Abundanz von Gardnerella Vaginalis ihren Höhepunkt erreicht und abnimmt, während der Lactobacillus iners zunimmt und bis zum letzten Zeitpunkt zum dominierenden Organismus wird.

Mit dieser Methode zur Profilierung der Mikrobiota werden Informationen über das Vorhandensein bestimmter Organismen sowie deren Häufigkeit generiert. Da die Methode sequenzbasiert ist, kann das Sondendesign durch Tiefensequenzierungsanalysen beeinflusst werden, und Mikroorganismen, die mit Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation identifiziert werden, können in Proben schnell und relativ kostengünstig verfolgt werden. Das Anschauen dieses Videos sollte Ihnen ein gutes Verständnis dafür vermittelt haben, wie Sie mit dem Luminex- oder Bioplex-Gerät ein mikrobielles Profil aus einer Probe erstellen können.

Wir haben Ihnen gezeigt, wie Sie Oligonukleotidsonden an die Fluoreszenzkügelchen koppeln, einzelsträngiges Alizium aus einer klinischen oder Umweltprobe erzeugen, eine Hybridisierung durchführen und die Ergebnisse auf einem Luminex- oder Bioplex-Gerät bestimmen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.