Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium Staphylococcus epidermidis Und Mycobacterium marinum Infektion als Modell für Drug Discovery

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine große Anzahl infizierter Zebrafischembryonen für die Untersuchung von Wirkstoffen mit hohem Durchsatz zu erzeugen, um die Wirkstoffforschung zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein großes Zuchtgefäß verwendet wird, um eine große Anzahl synchroner Zebrafischeier in einem einzigen Ereignis zu erhalten. Anschließend werden die Eier in ein Aros-Gitter eingereiht und mit einem automatisierten Mikroinjektor mit Bakterien im Eigelb infiziert.

Wenn sich die Infektion über die Embryonen ausgebreitet hat, werden sie durch eine Durchflusszytometrie mit großen Partikeln vorsortiert, bevor sie mit Medikamenten behandelt werden. Schließlich wird die bakterielle Belastung in infizierten Embryonen nach der Verbundbehandlung analysiert. Letztendlich eine hochauflösende Analyse durch konfokale Mikroskopie-Wirbel.

Automatisiertes Screening und Probenahme großer Partikel werden verwendet, um die Auswirkungen von Verbindungen auf die Infektion detaillierter zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie manuellen Injektionen oder PIX-Scan-Analysen besteht darin, dass wir mit ihr eine große Menge an homogen betroffenen Embryonen erzeugen können, die wir mit hohem Durchsatz analysieren können. Zur Herstellung des S epiderm Inokulums isolieren Sie mehrere einzelne Kolonien aus einer Platte des S epiderm Stammes O 47, die einen von A PW VW 180 9 abgeleiteten M Kirsch-Expressionsvektor enthält, und inokulieren.

25 Milliliter LB ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter. Chloramphenicol inkubiert über Nacht bei 37 Grad Celsius bis zum Midlock-Stadium am nächsten Tag, zentrifugiert einen Milliliter der Kultur bei 12.000 GS für eine Minute und verwendet einen Milliliter steriles PBS mit 0,3 % Volumen pro Volumen zwischen 80, um das Pellet dreimal zu waschen. Messen Sie die optische Dichte bei OD 600 und verwenden Sie 2 % Gewicht pro Volumen, Polyvinylperon 40 oder PVP 40 in PBS, um die Bakteriensuspension auf einen OD 600 von 0,3 oder einmal 10 auf die acht KBE pro Milliliter zu verdünnen.

Zur Herstellung des Aminum-Inokulums isolieren Sie mehrere einzelne Kolonien aus M Meum Stamm M oder E 11 und exprimieren stabil den PS MT 3M-Kirschvektor aus einem Middlebrook Seven H 10, belüften und inokulieren 10 Milliliter Middlebrook Seven H neun Bouillon mit 10 % Volumen pro Volumen. Middlebrook A DC Anreicherung, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin, inkubieren Sie am nächsten Tag über Nacht bei 28 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie einen Milliliter der Kultur bei 12.000 GS für eine Minute und verwenden Sie einen Milliliter steriles PBS mit 0,3 % Volumen pro Volumen, zwischen 80, um das Pellet dreimal zu waschen.

Messen Sie den OD 600 der Bakteriensuspension und mit 2 % Gewicht pro Volumen. PVP 40 in PBS, verdünnt auf einen OD 600 von 0,3 oder 0,3 mal 10 auf die acht KBE pro Milliliter zur Gewinnung von Zebrafischeiern in der Nacht vor der Entnahme maximal 50 weibliche Zebrafische in die untere Kammer eines großen Zuchtgefäßes und 70 männliche Fische in den oberen Teil des Gefäßes. Nehmen Sie am nächsten Morgen den Separator aus dem Gefäß Nach etwa einer Stunde durch den Eiauffangbehälter am Boden des Aufzuchtgefäßes sammeln Sie die Eier in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit Eiwasser gefüllt ist.

Nach der Vorbereitung der Injektionsplatten gemäß dem Textprotokoll in der Betriebssoftware des automatisierten Mikroinjektors klicken Sie auf Kalibrierstufe und dann auf 10 24. Gitter für die Vertiefung und platzieren Sie die Aros-Platte in den Mikroinjektor, kalibrieren Sie die Platte, indem Sie auf den Bildschirm in der Mittelposition der Vertiefung klicken. Gehen Sie dann zum Nadelmenü und klicken Sie auf Nadelhalter kalibrieren.

Füllen Sie mit einer Mikroladerspitze eine Spitzeninjektionsnadel mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern entweder mit 10 Mikrolitern PVP 40 mit 100 KBE pro Nanoliter S-Epiderm, 30 KBE pro Nanoliter Erum oder PVP 40 allein für Scheininjektionen, platzieren Sie die Nadel in den automatisierten Mikroinjektor und kalibrieren Sie die XY-Position, indem Sie die Nadel absenken oder nach oben bewegen und auf dem Bildschirm an der Position der Nadel klicken. Kalibrieren Sie dann die Z-Position der Nadel, indem Sie auf den Bildschirm an der Position der Nadelspitze klicken. Verteilen Sie die Eier anschließend mit einer Plastikpipette auf dem Gitter und entfernen Sie überschüssiges Eiwasser.

Legen Sie dann das mit Eiern gefüllte Agros-Gitter in den automatisierten Mikroinjektor im Injektionsmenü, stellen Sie den Injektionsdruck auf 200 Hektar Pascal, die Injektionszeit auf 0,2 Sekunden und den Kompensationsdruck auf 15 Hektor Pascal ein, was einem Nanoliter im Femto-Jet-Einstellungsmenü entspricht. Klicken Sie auf Alle injizieren und injizieren Sie die gesamte Platte der Embryonen nach der Injektion. Sammeln Sie die Eier, indem Sie sie in einer Petrischale waschen und bei 28 Grad Celsius ausbrüten.

Sobald das große Partikeldurchflusszytometer eingerichtet ist, rufen Sie das PMT-Menü auf und stellen Sie den roten Kanal auf 650 Volt und den grünen und gelben Kanal auf null Volt ein. Stellen Sie dann im Menü "Schwellenwerte" das Schwellensignal für die optische Dichte auf 50 ein, was 975 Millivolt entspricht, und das Minimum der Laufzeit auf 800, was 320 Mikrosekunden entspricht. Um den Einfluss von Schmutz zu reduzieren, legen Sie die Embryonen in den Probenbecher und in das Sortiermenü, um die maximal 70 zu sortierenden Embryonen pro Platte zu finden, indem Sie 70 eingeben.

Legen Sie eine leere Petrischale unter den Sortierer und klicken Sie auf Manuelles Sortieren. Wenn die Petrischale gefüllt ist, speichern Sie die Daten, indem Sie auf Speichern klicken. Wenn eine hochauflösende Analyse oder Bildgebung erforderlich ist, können die Embryonen einzeln in Vertiefungen einer 96-Well-Platte sortiert werden.

Legen Sie die Embryonen in den Probenbecher und definieren Sie die maximale Anzahl von einem Embryo pro zu sortierender Vertiefung. Positionieren Sie dann eine leere 96-Well-Platte in den linken Plattenhalter und klicken Sie auf Füllplatte. Wenn die Platte gefüllt ist, speichern Sie die Daten, indem Sie auf Speichern klicken, um medikamentös behandelte Embryonen drei Tage nach der Injektion mit Erum zu analysieren.

Behandeln Sie eine Gruppe von Embryonen mit einer Verbindung von Interesse in Lösungsmittel und eine zweite Gruppe mit Lösungsmittel allein. Legen Sie die behandelten Embryonen vier und fünf Tage nach der Befruchtung in den Probenbecher auf dem Durchflusszytometer und stellen Sie die Sortierung auf 70 Embryonen pro Platte ein, nachdem Sie die Embryonen in trica anästhesiert und das automatisierte Screening-System für Wirbeltiere und den großen Partikelsammler eingerichtet haben. Wählen Sie gemäß dem Textprotokoll aus dem Setup-Menü für die Erkennung von Bildgebungsobjekten die Referenzbilder aus, die dem Alter der Embryonen entsprechen, und wählen Sie im Menü Imaging Auto Store Images die Anzahl der zu erstellenden Bilder und die zu verwendende Ausrichtung aus.

Setzen Sie eine mit Embryonen gefüllte 96-Well-Platte in den linken Plattenhalter des großen Partikelsammlers ein und klicken Sie auf Run Plate. Wenn ein Embryo richtig positioniert ist, verwenden Sie ein 10-fach-Normal-Trockenobjektiv und bilden Sie Kopf und Schwanz separat ab. Verwenden Sie dann eine Bildverarbeitungssoftware, um die Bilder zusammenzufügen und zu beurteilen, welches Entwicklungsstadium für eine Dotterinfektion am besten geeignet ist.

Injektionen mit Dermitis und einem Marum wurden in allen Stadien zwischen dem Ein- und dem 512-Zellstadium durchgeführt. Wie hier zu sehen ist, boten Injektionen mit 100 KBE Dermitis, die zwischen dem 16. und 128. Zellstadium durchgeführt wurden, das beste Infektionsmuster. Die Bakterien vermehrten sich drei Tage lang im Eigelb und breiteten sich ab drei Tagen nach der Infektion im Körper aus.

Die Hochdurchsatz-Quantifizierung der bakteriellen Belastung erfolgte durch Fluoreszenzintensitätsanalyse mit dem großen Partikeldurchflusszytometer. Wie hier gezeigt, stimmt die Menge der im Embryo vorhandenen lebenden Bakterien sehr gut mit dem gemessenen Fluoreszenzsignal überein. Diese Abbildung zeigt, dass das optimale Entwicklungsstadium für die Injektion von 30 KBE Aminum zwischen dem 16- und 128-Zellstadium für den E-11-Stamm und zwischen dem 16- und 64-Zellstadium liegt.

Bei den virulenteren EM-Stämmen zeigten Embryonen, die in diesen Stadien injiziert wurden, ein bakterielles Wachstum in der Eiche und eine Ausbreitung der Bakterien im Embryo. Nach Vorsortierung der Emerin-infizierten Embryonen mit unterschiedlichen Rifampicin-Konzentrationen zeigte sich eine dosisabhängige Reduktion der mykobakteriellen Infektion. Die Verwendung des Arzneimittels in einer Dosis von 200 Mikromolaren zeigte, dass es das bakterielle Fortschreiten von M mein E 11 24 Stunden und danach nach der Behandlung nach seiner Entwicklung wirksam stoppte.

Diese Techniken ebneten den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Wirkstoffprüfung und der Arzneimittelentwicklung, die nach neuen Behandlungen für Infektionskrankheiten wie Tuberkulose oder Biomaterial-assoziierte Infektionen suchten.