Die Infiltration-Zentrifugation Technik zur Gewinnung von apoplastischen Flüssigkeit aus Pflanzenblättern verwenden Phaseolus vulgaris Als Beispiel

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Extraktion von aplastischer Flüssigkeit aus Pflanzenblättern mit Hilfe der Infiltrationszentrifugationstechnik zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem ein Blatt zuerst in Infiltrationsflüssigkeit getaucht und Druckunterschiede, die mit einer Spritze oder Vakuumpumpe erzeugt werden, genutzt werden, um es vollständig zu infiltrieren. Der zweite Schritt besteht darin, das zu zentrifugierende Blatt mit Hilfe einer Stützvorrichtung vorzubereiten.

Anschließend wird das Blatt schonend zentrifugiert, um die Waschflüssigkeit APO plast zu erhalten. Der letzte Schritt besteht darin, den APO-Plast-Verdünnungsfaktor zu bestimmen und die Qualität der letzten Waschflüssigkeit zu bestimmen. Letztendlich wird der Infiltrationszentrifugationsassay verwendet, um repräsentative APO-Plast-Proben zu gewinnen, die für eine Vielzahl von Downstream-Analysen verwendet werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden besteht darin, dass es einfach ist, sie für eine Vielzahl von Blatttypen zu optimieren, um obere Plus-Proben zu erhalten, die eine minimale Kontamination mit zytoplasmatischen Verbindungen aufweisen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in Bereichen wie der Pflanzenphysiologie und den Interaktionen mit Pflanzenmikroben zu beantworten, wo es wichtig ist zu verstehen, wie die Zusammensetzung der APLs zwischen Pflanzen variiert und sich unter verschiedenen physiologischen Bedingungen oder Belastungen verändert. Treffen Sie als ersten Schritt Sicherheitsvorkehrungen, indem Sie einen Laborkittel, einen Handschuh und eine Schutzbrille tragen.

Bereiten Sie als Nächstes ein Volumen destilliertes Wasser vor, in das Sie die Blattprobe eintauchen können. Halten Sie eine Rasierklinge bereit, um in diesem Fall eine Probe zu entnehmen, ein Blatt der Bohnensorte zartes Grün. Lege die Rasierklinge gegen das Haustier eines Blattes und befestige das Blatt von der Pflanze.

Tauchen Sie das frisch herausgeschnittene Blatt nach dem Sammeln in destilliertes Wasser, um Verunreinigungen auf der Blattoberfläche zu entfernen. Verwenden Sie dann ein saugfähiges Taschentuch oder Papier, um das Blatt vorsichtig trocken zu halten. Messen Sie das Blattgewicht, bevor Sie mit der Infiltration fortfahren.

Dies wird später bei der Annäherung an das Infiltrationsvolumen helfen. Starten Sie den Infiltrationsprozess mit einer 60-Milliliter-Spritze. Wenn der Kolben entfernt ist, rollen und/oder falten Sie das Blatt vorsichtig in die Spritze.

Füllen Sie anschließend die Spritze mit Infiltrationsflüssigkeit. Hier kommt destilliertes Wasser zum Einsatz. Setzen Sie den Kolben ein und drehen Sie die Spritze um, um die darin enthaltene Luft auszustoßen.

Notieren Sie sich die Blattfarbe für einen späteren Vergleich. Bewegen Sie den Kolben mit einem kleinen Stück Para Param bis zur 40-Milliliter-Markierung. Decken Sie die Spritzenspitze ab.

Ziehen Sie dann den Kolben bis zur 60-Milliliter-Markierung, um einen Unterdruck zu erzeugen. Drehen Sie die Spritze um, um Luftblasen von der Blattoberfläche freizusetzen. Bringen Sie den Kolben über etwa zwei Sekunden langsam wieder in die Ausgangsposition.

Decken Sie die Spritzenspitze ab und stoßen Sie jegliche Luft aus. Decken Sie dann die Spitze wieder ab und drücken Sie auf den Kolben, um einen moderaten Überdruck zu erzeugen. Üben Sie weiterhin Unterdruck aus, um Luft auszustoßen und Überdruck auszuüben, bis das Blatt vollständig infiltriert ist.

Ein Beweis für eine vollständige Infiltration ist die dunkle Farbe der infiltrierten Bereiche. Sobald dies zu sehen ist, entfernen Sie das Blatt aus der Spritze. Blockieren Sie das Blatt vorsichtig mit saugfähigem Papier, um Oberflächenflüssigkeit zu entfernen.

Messen Sie dann das Gewicht des infiltrierten Blattes, und eine alternative Infiltrationsmethode verwendet eine Isolierflasche. Sammeln Sie erneut ein Blatt und spülen Sie es in destilliertem Wasser ab. Nachdem Sie es trocken gestrahlt haben, messen Sie das Blattgewicht.

Besorgen Sie sich einen Seitenkolben mit einem Fassungsvermögen von mindestens 250 Millilitern. Lege das Blatt in den Kolben und bedecke ihn mit destilliertem Wasser. Setzen Sie dann einen Stopfen in den Kolben ein und befestigen Sie eine Vakuumpumpe am Seitenarm.

Den Kolben lange genug vakuumieren, um einen Druck zu erreichen. Ungefähr 650 Millimeter Quecksilber. Den Kolben vorsichtig umrühren, um Luftblasen aus dem Blatt zu lösen, während der Druck reduziert wird.

Lassen Sie dann das Vakuum vorsichtig und langsam über einen Zeitraum von ca. 10 Sekunden los. Wiederholen Sie den Vorgang des Anlegens eines Vakuums, des Rührens des Kolbens und des Loslassens des Vakuums, bis das Blatt vollständig infiltriert ist. Ein Beweis für eine vollständige Infiltration ist die dunkle Farbe der infiltrierten Bereiche.

Das vollständig infiltrierte Blatt aus dem Kolben nehmen und vorsichtig mit saugfähigem Papier abtupfen. Um Oberflächenflüssigkeit zu entfernen, messen Sie das Gewicht des infiltrierten Blattes, um das ungefähre Infiltrationsvolumen bestimmen zu können. Nachdem ein Blatt vollständig infiltriert wurde, bereiten Sie es für die Zentrifugation vor.

Legen Sie ein Stück vier Zoll breite Para-Folie aus. Legen Sie das Blatt auf die Parafolie. Rollen Sie dann das Blatt mit einer Fünf-Milliliter-Pipettenspitze in der Para-Folie auf.

Nehmen Sie einen 20-Milliliter-Spritzenkörper mit entferntem Kolben und führen Sie das aufgerollte Blatt mit der Pipettenspitze ein. Positionieren Sie alle abgeschnittenen Blattkanten mit Blick auf das Kolbenende. Besorgen Sie sich ein 50-Milliliter-Röhrchen aus Polyethylen oder Polycarbonat und führen Sie die Spritze hinein.

Verwenden Sie eine Zentrifuge mit einem schwingenden Schaufelrotor. Das Röhrchen mit dem infiltrierten Blatt und die Zentrifuge mit einer Temperatur von vier Grad Celsius und 1000 g wird 10 Minuten lang geladen. Untersuchen Sie nach der Zentrifugation das Blatt, um festzustellen, ob der größte Teil der Infiltrationsflüssigkeit ausgestoßen wurde.

Das Zentrifugenröhrchen enthält nun die zurückgewonnene APO-Plast-Waschflüssigkeit. Fahren Sie fort, indem Sie die zurückgewonnene und letzte Waschflüssigkeit in frische 1,5-Milliliter-Röhrchen pipettieren. Geben Sie die Proben der APO plast Waschflüssigkeit in die Zentrifuge und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 15.000 g, um alle Zellen oder Partikel zu entfernen. Nach der Zentrifugation pipettieren Sie das Supinat in frische Röhrchen.

Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, bis sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden können. Eine Methode zur Beurteilung der Qualität der APO-Plat-Waschflüssigkeit ist die Berechnung des APO-Plat-Verdünnungsfaktors. Bereiten Sie dazu zwei Volumina der Infiltrationsflüssigkeit destilliertes Wasser in diesem Fall jeweils ausreichend für mehrere Infiltrationen auf ein Volumen vor.

Indigokarminpulver bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikromolaren zugeben. Fügen Sie dem anderen nichts hinzu. Besorgen Sie sich eine 96-Well-Mikroplatte und füllen Sie drei Wells mit 200 Mikrolitern der Infiltrationslösung.

Füllen Sie drei weitere mit Indigokarmin mit 200 Mikrolitern der unverfälschten Infiltrationslösung, legen Sie die Mikroplatte in das Lesegerät, um die Absorption jeder Flüssigkeit zu messen. Bei 610 Nanometern ergibt die durchschnittliche Extinktion für Flüssigkeit mit Indigokarmin abzüglich des durchschnittlichen Absorptionsmittels für Flüssigkeit ohne die korrigierte Absorption des Infiltrats. Replizieren Sie als Nächstes das Blattinfiltrationsprotokoll dreimal für jede der Infiltrationslösungen.

Tauchen Sie eine Blattprobe in Wasser. Üben Sie bei der Verwendung der Indigokarmin-Infiltrationslösung Unter- und Überdruck aus, spülen Sie die Blätter nach der Infiltration in destilliertem Wasser ab, um alle verbleibenden Indigokarmin von der Blattoberfläche zu entfernen. Gewinnen Sie eine letzte Waschflüssigkeit durch Zentrifugation zurück.

Nachdem Sie die letzte Waschflüssigkeit zurückgewonnen haben, kehren Sie zum Plattenleser in den Vertiefungen der Mikroplatte zurück. Platziert wurden 200 Mikroliter jeder der Indigokarmin-freien Extraktionen und auch 200 Mikroliter jedes Indigokarmins bei der Extraktion der Waschflüssigkeit. Messen Sie die Extinktion der Proben bei 610 Nanometern, um die korrigierte Extinktion zu erhalten.

Mitteln Sie jeden Zahlensatz und nehmen Sie die Differenz. Verwenden Sie die korrigierte Extinktion des Infiltrats und die korrigierte Absorption der aplastischen Waschflüssigkeit, um den APL-Verdünnungsfaktor zu bestimmen und so Schätzungen der Konzentrationen oder Aktivitäten in der aplastischen Flüssigkeit zu erhalten. Multiplizieren Sie die Konzentrations- oder Aktivitätswerte aus der letzten Waschflüssigkeit mit dem Verdünnungsfaktor, der in der letzten Waschflüssigkeit aus der Sorte Fasi vulgaris extrahiert wird.

Tender Green wurde verwendet, um diese Gaschromatographie Massenspektrum organischer Säuren herzustellen. Einfachzucker und Aminosäuren stellen den Großteil der identifizierbaren Metaboliten dar. Hier ist ein Vergleich der SDS-Seite, Kumasi Fleckengele von fasi vulgarus alast Waschflüssigkeit Blattextrakte.

Die Extraktionen unterscheiden sich in der Menge der zytoplasmatischen Kontamination. Dies wird in unterschiedlichen Mengen des Gipsenzyms Rubis beobachtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, so sanft wie möglich zu sein, um Gewebeschäden oder zytoplasmatische Kontaminationen nach diesem Verfahren zu vermeiden.

Andere Methoden, wie z.B. Protein- oder Metaboliten-Massenspektrometrie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Zusammensetzung der aplastischen Flüssigkeit zu beantworten. Aplastische Waschflüssigkeit kann auch als Bruttomedium verwendet werden, um die Wirkung von aplastischen Chemikalien auf die Mikroorganismen zu untersuchen, die Pflanzengewebe besiedeln.