Name: Die Infiltration-Zentrifugation Technik zur Gewinnung von apoplastischen Flüssigkeit aus Pflanzenblättern verwenden Phaseolus vulgaris Als Beispiel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Lernen Sie die Infiltrations-Zentrifugation zur Gewinnung apoplastischer Flüssigkeit aus Blättern von Phaseolus vulgaris. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen in der Pflanzenphysiologie.

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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse BB/J016012/1 und BB/E007872/1 vom UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) an Gail Preston unterstützt.

HINWEIS: Die Wahl der Ausgangsblattmaterial und Standardisierung von Pflanzenwachstumsbedingungen ist kritisch, da diese Faktoren die Qualität außerordentlich, Variabilität und Ausbeute AWF (Figur 1) zu beeinflussen. Parameter zu berücksichtigen, sind in Tabelle 1 gezeigt und werden im Detail in der Diskussion erläutert. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parameter </td><td colspan="3"> Beispiel Standardisierungen </td></tr><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris </td><td> Solanum lycopersicum </td><td> Arabidopsis thaliana </td></tr><tr><td> Blatttyp </td><td> Ersten Laubblätter, voll ausgebaut, gesunde </td><td> 2. und 3. Blättern ab Boden, 4 größten Flugblätter genommen apikal Broschüre nicht Apoplast Extraktion verwendet </td><td> Voll ausgebaut Rosettenblätter </td></tr><tr><td> Anlagenalter </td><td> 21 Tage </td><td> 7 - 9 Wochen </td&gt; <td> 7 Wochen </td></tr><tr><td> Uhrzeit </td><td> Mitte der Lichtperiode (12:00) </td><td> Mitte der Lichtperiode (12:00) </td><td> Mitte der Lichtperiode (12:00) </td></tr><tr><td> Hydration </td><td> Alle Pflanzen gut bewässert 1 h vor der Ernte </td><td> Alle Pflanzen gut bewässert 1 h vor der Ernte </td><td> Alle Pflanzen gut bewässert 1 h vor der Ernte </td></tr><tr><td> Licht </td><td> 16 Stunden Licht, 400 &amp; mgr; mol m -2 s -1 </td><td> 16 Stunden Licht, 400 &amp; mgr; mol m -2 s -1 </td><td> 10 Stunden Licht (Kurz Tag) von Woche 2, 400 &amp; mgr; mol m -2 s -1 </td></tr><tr><td> Luftfeuchtigkeit </td><td> 70% </td><td> 70% </td><td> 70% </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> 22 ° C Licht, 18 ° C dunkel </td><td> 22 ° C Licht, 18 ° C dunkel </td><td> 21 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Beispiele für genormte Parameter für Blätter in AWF Extraktionen verwendet. 1. Generieren Apoplast Waschflüssigkeit HINWEIS: Während dieses Protokolls gefährlichen materila inculding mikrobiellen Krankheitserregern aus infizierten Blätter sollten nicht in die Kanalisation gespült werden; nicht ordnungsgemäße Entsorgung Verfahren verwendet werden soll. <ol><li> Wählen Vorrichtung basierend auf Blattgröße: <ol><li> Infiltrieren kleinere Blätter (zB Arabidopsis, Soja) Verwendung einer nadellosen Spritze. Verwenden Sie eine Thermoskanne, um Blätter, die zu groß ist, um eine Spritze zu passen sind zu infiltrieren. Verwenden Sie die Thermoskanne Methode, um mehrere Blätter gleichzeitig zu infiltrieren. </li><li> Teilen Blätter, die zu groß für die verfügbare Infiltrationsverfahren in kleinere Abschnitte mit einer Rasierklinge sind. Gründlich geschnitten Blattstücke in destilliertem Wasser vor der Infiltration zu zytoplasmatischen Verunreinigungen, die aus beschädigten Zellen strahlen zu entfernen. </li></ol></li><li> Blatt Infiltration mit einem 60-ml-Spritze: <ol><li> Nehmen Sie das Blatt aus derAnlage am Blattstiel mit einer Rasierklinge. Bei der Compound-Blätter wie Tomate, lösen Flugblätter an der petiolule. </li><li> Den frisch ausgeschnitten Blatt durch Eintauchen Spülen in destilliertem Wasser auf Blattoberfläche Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie das Blatt durch leichtes Abtupfen mit saugfähigem Papier oder Papier. </li><li> Messen Sie die Flügelgewicht vor der Infiltration. </li><li> Vorsichtig rollen und / oder falten Sie das Blatt in einen 60-ml-Spritze und füllen Sie die Spritze mit destilliertem Wasser (Infiltration andere Flüssigkeiten verwendet werden können, siehe Diskussion). Werfen Sie keine Luft in der Spritze, während eine Senkung der Kolben bis etwa zur 40 ml-Marke. </li><li> Decken Sie die Spritzenspitze entweder mit einem behandschuhten Finger oder ein Stück Parafilm, dann erstellen Sie Unterdruck in der Spritze, indem Sie den Kolben nach außen zur 60 ml-Marke. Sie langsam den Kolben. HINWEIS: Schnelles Lösen des Drucks in Zell-Lyse und zytoplasmatische Verunreinigung bei. </li><li> Ziehen Sie den Spritzenspitze und werfen keine Luft, umstecken dann die Spitze, und drücken Sieweiter nach unten auf den Kolben, um einen bescheidenen Betrag von Überdruck zu erstellen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5 - 1.2.6, bis das Blatt vollständig infiltriert, wie durch den dunklen Farbe der infiltrierten Bereiche gesehen. </li><li> Entfernen Sie das Blatt aus der Spritze. Vorsichtig, aber gründlich trocknen Sie die Blätter mit saugfähigem Papier Oberfläche Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Messen des Gewichts des infiltrierten Blatt. Berechnen des Gewichtsunterschieds vor und nach der Infiltration die eng approximiert die Infiltration Volumen. </li></ol></li><li> Blatt Infiltration durch Vakuumflasche: <ol><li> Nehmen Sie das Blatt aus der Anlage an der Blattstiel mit einer Rasierklinge. </li><li> Den frisch ausgeschnitten Blatt durch Eintauchen Spülen in destilliertem Wasser auf Blattoberfläche Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie das Blatt durch leichtes Abtupfen mit saugfähigem Papier. </li><li> Messen Sie die Flügelgewicht vor der Infiltration. </li><li> Legen Sie das Blatt (oder verlässt, wenn mehrere Blätter infiltriert) in einem 250 ml oder größer Seitenarm Kolben containing destilliertem Wasser (Infiltration andere Flüssigkeiten verwendet werden können, siehe Diskussion). Decken Sie die Blätter mit der Flüssigkeit. </li><li> Anwenden eines Unterdrucks auf den Kolben. Vorsichtig geschwenkt, um die Luftblasen aus den Blättern zu lösen. Vorsichtig und langsam das Vakuum. HINWEIS: schnell das Vakuum in Zell-Lyse und zytoplasmatische Verunreinigung bei. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 bis der Flügel vollständig infiltriert, wie durch den dunklen Farbe der infiltrierten Bereiche gesehen. </li><li> Entfernen Sie das Blatt aus dem Kolben. Vorsichtig, aber gründlich trocknen Sie die Blätter mit saugfähigem Papier Oberfläche Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Messen des Gewichts des infiltrierten Blatt. Berechnen des Gewichtsunterschieds vor und nach der Infiltration die eng approximiert die Infiltration Volumen. </li></ol></li><li> Rückgewinnung von AWF durch Zentrifugation: <ol><li> Legen Sie das Blatt auf ein Stück von 4 Zoll (10 cm) breite Parafilm. Mit einem 5 ml Pipettenspitze (oder eine ähnlich große Objekt),rollen Sie das Blatt in der Parafilm. </li><li> Legen Sie die zusammengerollten Blatt mit Pipettenspitze in einen 20-ml-Spritze. Positionieren Sie keine Schnittblatträndern nach oben zeigt. Legen Sie die Spritze in einen sauberen 50 ml Polyethylen oder Polycarbonat Rohr. </li><li> Zentrifugieren der Spritze in der Röhre für 10 Minuten bei 1.000 × g in einem Schwenkbecher-Rotor bei 4 ° C. HINWEIS: Die visuelle Untersuchung der Blätter nach der Zentrifugation sollte zeigen, dass die Mehrheit der Infiltrationsflüssigkeit ausgestoßen. Dunkleren grünen Flecken zeigen, dass zusätzliche Zentrifugation Zeit erforderlich ist. </li><li> Pipettieren Sie die wiederhergestellte AWF die frische 1,5-ml-Röhrchen. HINWEIS: Das Volumen der AWF sollte etwa entsprechen die Infiltration Volumen für das Blatt; wenn das Volumen geringer als zusätzliche Zentrifugationszeit oder Zentrifugation Geschwindigkeit erforderlich. </li><li> Zentrifugieren der AWF Proben bei 15.000 xg für 5 Minuten, um alle Zellen oder Partikel zu entfernen. Sie können auch das AWF durch ein 0,22 um-Filter, um remove Zellen und Partikeln. </li><li> Pipettieren Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Halten Sie Proben auf Eis, bis der Lagerung. </li><li> Bewahren Sie die AWF Proben bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Assays für Zytoplasmatische Verschmutzungs <ol><li> Halten Sie die AWF Proben auf Eis zu enzymatischen Reaktionen (zB Proteolyse) zu minimieren und führen Sie die Tests unmittelbar nach der Zentrifugation Schritte abgeschlossen sind. HINWEIS: Metabolit-Assays können Proben direkt nach der Extraktion eingefroren und bei -80ºC bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Bei einer Standard-Malat-Dehydrogenase (MDH) Testprotokoll siehe 15; andernfalls verwenden Sie ein handelsübliches MDH-Testkit. </li><li> Bei einer Standard-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) Testprotokoll siehe 16; andernfalls verwenden Sie ein handelsübliches G6PDH-Testkit. </li><li> Zur Quantifizierung der zytoplasmatischen Metaboliten wie Glukose-6-phosphat (G-6-P) verwenden GC-MS, wie in Schritt 5 beschrieben </strong&gt;. Andernfalls verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Kits zur direkten Bestimmung von G-6-P. </li></ol> 3. Berechnung des Apoplasten Verdünnungsfaktor <ol><li> Bereiten Sie zwei Bände der oben in Schritt 1.2.4 oder 1.3.4 (zB destilliertes Wasser) verwendet Tränkflüssigkeit. Hinzufügen Indigokarmin Pulver eine Lösung bis zu einer Endkonzentration von 50 uM, fügen nichts zu der anderen. </li><li> Die Absorption bei 610 nm (OD 610) von 200 ul des Indigokarmin Infiltrationslösung mit einem Plattenlesegerät. Korrigieren Sie diesen Wert durch Subtraktion der OD 610 von 200 ul der Infiltration Lösung ohne Indigokarmin. Ersetzen Sie diese korrigierte Wert als OD 610infiltrate in der Gleichung unten. </li><li> Führen mindestens drei Wiederholungsblatt Infiltrationen wie oben (Schritt 1.2 oder 1.3) mit beiden Infiltrations Lösungen (mit und ohne Indigokarmin). </li><li> Nach der Infiltration rinse den Blättern in destilliertem Wasser, um Rest vorliegenden Indigokarmin auf den Außenflächen zu entfernen. </li><li> Fahren Sie mit dem Zentrifugieren wie oben (Schritt 1.4). </li><li> Bestimmen Sie die mittlere OD 610 von 200 ul der Indigokarmin AWF Extraktionen. Korrigieren Sie diesen Wert durch Subtraktion des durchschnittlichen OD 610-Wert von 200 ul von Indigokarmin kostenlos AWF. Ersetzen Sie diese korrigierte Wert als OD 610AWF in der Gleichung unten. </li><li> Berechnen Sie den Verdünnungsfaktor (dh fache Verdünnung) aus den korrigierten Absorptionswerte als: Apoplast Verdünnungsfaktor = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) </li><li> Multiply Konzentration oder Aktivität Werte von AWF mit dem Verdünnungsfaktor, um die Konzentration / Aktivität in apoplastischen Flüssigkeit schätzen in planta. </li></ol> 4. Konzentration von AWF zu Endfestigkeit durch Gefriertrocknung <ol><li> Schalten Sie den Gefriertrockner und einellow es bei der Arbeitstemperatur und den Druck zu stabilisieren. </li><li> Pool die gewünschte Menge an frischem oder gespeicherte AWF Proben. </li><li> Verteilen Sie die Proben gleichmäßig auf 2 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Bestimmen Sie die Rekonstitution Volumen: Rekonstitutionsvolumen = Volumen vor dem Gefriertrocknen / Apoplast Verdünnungsfaktor </li><li> Bei geschlossenen Lidern, Gefriert die Röhrchen in flüssigem Stickstoff. </li><li> Übertragen Sie die Tiefkühlrohre an einen oder mehrere Kühlgefriertrocknen Gefäße. Während der Übertragung der Rohre, ersetzen Sie den Deckel mit einer, mit einem spitzen Gegenstand durchbohrt worden ist, um den Gasaustausch zu ermöglichen. </li><li> Befestigen Sie die Geräte mit dem Gefriertrockner und lyophilisieren der Proben vollständig. </li><li> Entfernen Sie die Proben aus der Maschine und rekonstituieren AWF durch Zugabe der berechneten Menge an destilliertem Wasser. </li><li> Ersetzen Sie die undurchbrochene Deckel und die Proben bei -80 ° C lagern. </li></ol> 5. Metabolit-Analyse mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie 17 &lt;ol&gt; <li> Je 200 ul der AWF in ein 1,5-ml-Tube </li><li> Hinzufügen 700 ul Methanol, das 10 ug / ml Ribitol als interner Standard. </li><li> Hitze bei 70 ° C für 10 min. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 11.000 x g. </li><li> Übertragen Sie 700 ul der Überstand in ein frisches 1,5 ml-Tube. </li><li> Fügen Sie 375 ul kaltem Chloroform und Vortex für 10 Sekunden. </li><li> Fügen Sie 500 ul dH 2 O und Vortex für 10 Sekunden. </li><li> Zentrifuge für 15 min bei 2200 x g. </li><li> Übertragen wurden 150 ul der oberen wässrigen Schicht in ein neues 1,5-ml-Röhrchen, dann in einem Vakuum-Konzentrator die Proben vollständig trocknen, ohne Wärme. </li><li> Man löst die Proben in 30 ul Pyridin, enthaltend 20 mg / ml Methoxyaminhydrochlorid. </li><li> Inkubiere bei 70 ° C unter Schütteln für 2 h kräftig. </li><li> Dann werden 50 ul MSTFA (N-Methyl-N- (trimethylsilyl) trifluoracetamid). </li><li> Bei 37 ° C unter Schütteln für 30 min. </li><li> Über Proben der GC-MS-Datei herunterladenatible Glasfläschchen. </li><li> Führen GC-MS-Analyse der Proben. Siehe Lisec et al. 2009 17, für Details über GC-MS-Geräte-Setup und Leistung. </li></ol>

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Optimierung der Pflanzengewebe Quelle Biologische und technische Veränderung kann groß sein, wenn die Durchführung Apoplast Extraktionen, damit ein hoch standardisierten Workflow ist hilfreich, um Kontinuität über Experimente zu erhöhen (Abbildung 1). Wichtig ist, dass die Quelle von Pflanzengewebe standardisiert werden, einschließlich Blatttyp, Blattalter, Wachstum / Umweltbedingungen und der Tageszeit (Tabelle 1). Große Unterschiede gibt es in der Leichtigkeit, mit der verschiedene Blätter infiltriert und die AWF anschließend durch Zentrifugieren gewonnen; Diese Unterschiede sind mit Spaltöffnungen Nummer, Maschenweite und Mesophyll Widerstand 12,14 korreliert. Auch zwischen den verschiedenen Sorten von P. vulgaris gibt es große Unterschiede in der Leichtigkeit und dem Ertrag der AWF Extraktionsverfahren; zB Blättern der Tendergreen Vielfalt werden dabei zugänglicher AWF Extraktion mit dieser Methode als die kanadischen Wonder Sorte. InnerhalbP. vulgaris die ersten Laubblätter sind der größte und am leichtesten zu infiltrieren, so dass sie die offensichtliche Wahl für apoplastischen Extraktionen. Apoplastischen Luft und Wassermenge wurde gezeigt, dass mit Blattalter bei mehreren Spezies, was zu Unterschieden in AWF Extrahierbarkeit 12,14 variieren. In P. vulgaris, ältere Blätter werden wesentlich schwieriger zu infiltrieren und ergeben weniger AWF beim Zentrifugieren; daher wurden Blätter geerntet, wenn sie voll Expansion erreicht. Blätter, die schwer zu infiltrieren anschließend erfordern höhere Geschwindigkeiten Zentrifugation, um den AWF erholen. Man sollte daher verschiedene Blattarten und Sorten Bildschirm sorgfältig vor der Entscheidung über eine Gewebequelle für große AWF Extraktionen. Pflanzenwachstumsbedingungen muss auch im Rahmen des Experiments so weit wie möglich vereinheitlicht werden. Die Verwendung von Kammern nicht bevorzugt, da sie ermöglichen konstante Luftfeuchtigkeit, Temperatur und light Intensität Regimenter beibehalten werden. Das Ernten der Blätter immer an der gleichen Tageszeit auftreten, da die Konzentrationen der Metaboliten, Enzyme etc. variieren während des Tageszyklus 14. Schließlich, um sicherzustellen, dass die Anlage verlässt alle ähnliche Turgordruck, sollten die Pflanzen bald vor (ca. 1 Stunde) der Ernte bewässert werden. Optimierung der Blattunterwanderung und Zentrifugation Unerwünschte zytoplasmatischen Kontamination der AWF durch partielle Zellyse eintreten werden, wenn die mechanische Belastung durch die Zellen auftritt, ist während der Infiltration oder Zentrifugationsschritte zu hoch. Daher sollte das Verfahren für eine gegebene Blatttyp ein optimierter Kompromiss zwischen der Maximierung Ausbeute und zur Minimierung zytoplasmatischen Kontamination der AWF sein. In allen Fällen sollte man den niedrigsten Zentrifugation Geschwindigkeit, mit der AWF gewonnen werden kann, um mögliche mechanische Zerstörung der Blattzellen zu vermeiden. Optimierung der centrifutionsGeschwindigkeit sollte empirisch für jede Blatttyp durch die Beobachtung der Zahl erholt und Apoplast Kontamination über einen Bereich von Zentrifugation Geschwindigkeiten bestimmt werden. Es wurde beobachtet, dass die Markerenzymaktivitäten, wie MDH, G6PDH und Glucose-Phosphat-Isomerase, bleiben, bis ein Schwellenwert Zentrifugalkraft überschritten wird, oberhalb derer diese Aktivitäten erhöhen schnell, vermutlich aufgrund zytoplasmatischen Leck 9,12,14 gering. Die Verwendung von Parafilm zur Unterstützung während der Zentrifugationsstufe, wie von Baker et al. 2012 11 angemerkt, kann die Wirksamkeit der AWF Extraktion zu verbessern und kann eine mechanische Beschädigung der durch übermäßige Faltung und Verdichtung verursacht Blattspreite minimieren. Weiterhin ist die Verwendung von Parafilm verbessert die Visualisierung des Blattes nach der Zentrifugation bei sollte das Blatt auf Beschädigungen und Vollständigkeit der AWF Extraktions untersuchen. Nouchi 12 beschreiben die Optimierung der AWF Erholung von geschnittenen Reisblattstücke, die difficult zu infiltrieren und erfordern höhere Zentrifugiergeschwindigkeiten AWF wegen ihrer kleinen Stomata Öffnungen zu sammeln. Verbesserte Benetzung des Reisblattoberfläche, entweder durch Voreinweichen der Blätter in destilliertem Wasser oder die Zugabe eines Tensids zu der Tränkflüssigkeit, erleichtert das Infiltrationsverfahren. Eine höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit (6000 xg) wurde auch verwendet, während der Überwachung für Kontamination apoplastischen 12. Während Einzelblattstücke gibt es immer die Gefahr, daß cytoplasmatische Kontamination werden häufiger auch bei intensivem Waschen der Wundstellen; Schnitt Blätter sollte daher nur bei Bedarf verwendet werden. Für viele Studien von destilliertem Wasser als Tränkflüssigkeit 11 verwendet wird. Jedoch können Verbindungen zur Tränkflüssigkeit wie Salze oder Puffer zugegeben werden, um die Extraktion bestimmter apoplastischen Verbindungen, insbesondere Proteinen, 13 zu verbessern. Lohaus 14 untersuchten die Wirkung der Ionenstärke und des osmotischen on die Zusammensetzung des zurückgewonnenen AWF und fanden sie zu vernachlässigen. Änderungen des pH der Infiltrationsmedium kann jedoch die AWF Zusammensetzung 14 beeinflussen. Die richtige Handhabung und Lagerung der extrahierten apoplastischen Flüssigkeit ist wichtig. AWF ist gezeigt worden, um eine Fülle von Proteasen und anderen Enzymen 13,20 sowie flüchtige organische Verbindungen enthalten. Deshalb, um Veränderungen in der Zusammensetzung der AWF nach der Wiederherstellung ist es empfehlenswert, Proben auf Eis oder auf andere Weise bei -80 ° C gelagert zu halten reduzieren. Weiterhin sollte enzymatischen Assays AWF sobald wie möglich durchgeführt werden nach der Extraktion zu Enzyminaktivierung durch Proteolyse verlängerte Verdünnungs begrenzen oder Gefrieren-Auftauen. Das Verfahren der Infiltration verdünnt das apoplastischen Fluid und es ist oft notwendig, das Ausmaß dieser Verdünnung zu bestimmen. Der Zentrifugationsschritt kann auch verdünnt das AWF mit Wasser aus intrazellulären Kompartimenten. Ein Verdünnungsfaktor mussed, um in vivo Apoplast chemischen Konzentrationen schätzen, wenn Messungen an AWF gemacht. Ein Verdünnungsfaktor ist es auch notwendig AWF wieder vollzählig konzentriert ein, wenn er als Apoplast imitiert Wachstumsmedium für Mikroben - so passend in vivo Metabolitkonzentrationen so genau wie möglich. Mehrere Variationen existiert auf dem in Schritt 4 zur Bestimmung der AWF Verdünnungsfaktor durch Messung der Verdünnung einer Markerverbindung zur Tränkflüssigkeit zugegeben beschriebenen Verfahrens. Für alle Verfahren der AWF Verdünnung Berechnung davon aus, dass die Infiltrationsflüssigkeit nicht merklich absorbiert oder durch die Blattzellen während der AWF Recovery-Prozess verdünnt. Diese Annahme wurde zuvor für die Infiltrationsschritt 14 überprüft, sondern für den Zentrifugationsschritt ungeprüft. Die Markerverbindung muss auch nicht absorbiert werden, transportiert oder geändert wird, während im Apoplasten. Indigokarmin ist die am weitesten verbreitete und gründlich von Farbstoffen verwendet, getestetfür AWF Verdünnung Berechnungen. Indigokarmin zeigt eine geringe Absorption zu Kationenaustauscherharz von isolierten Zellwände und wurde als geeignet für AWF Berechnungen in Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum und Glycine max 11,21,22 sein. Doch in einigen Blatttypen, zum Beispiel Reis und Gurken, Indigokarmin schien nicht vollständig nach der Infiltration, die zu einer Unterschätzung der AWF Verdünnungsfaktor 12,21 führen würde wiederhergestellt werden. Das Fehlen von Rückgewinnungs Indigokarmin kann darauf zurückzuführen sein, ihre Anfälligkeit in Isatin Sulfonat von Superoxid 23, der bekanntlich in den Apoplasten hergestellt werden, insbesondere unter Stress 24 Spaltung. Spaltung Indigokarmin in Isatin sulfonat führt zu einem Verlust der Absorption bei 610 nm und einer Zunahme bei 245 nm zur Folge. Ob diese Reaktion in nennenswertem Umfang in den Apoplasten auftritt, oder ob diese Reaktion durch die Zugabe von Superoxid-Fänger zu Infiltrat gehemmt werdenIonenflüssigkeit wurde bisher nicht untersucht worden. Blaudextran wurde statt Indigokarmin zur Quantifizierung der AWF Verdünnungsfaktor in Reis eingesetzt Blätter 12, wenn ihre Stabilität und Erholung der AWF wurde nicht berichtet. Alternativ können radioaktiv markierte Verbindungen, wie [14 C] Sorbit oder anderen quantifizierbaren internen Standards anstelle von Farbstoffen und die Abnahme der Radioaktivität oder der Konzentration gemessen und verwendet, um den Verdünnungsfaktor in analoger Weise 11,14,25 Berechnung verwendet werden. Grenzen der Technik Ein paar Einschränkungen gibt es für die Infiltration-Zentrifugation AWF Isolierungsmethode. Erstens kann die Verdünnung des Apoplasten während der Infiltration eine Antwort von der Pflanze hervorzurufen. Wenn die umgebenden Blattzellen erkennen eine verminderte Konzentration für bestimmte Komponenten des apoplastischen Fluid können sie durch Ausscheidung weiteren Metaboliten Verzerrung der Auslegung Metabolitkonzentrationen reagieren. Ineine Beurteilung dieses Problems wurde festgestellt, dass weder die Zeit zwischen dem Eindringen und Zentrifugation noch moderate Unterschiede in der Ionenstärke der Tränkflüssigkeit beeinflußt die Zusammensetzung des extrahierten AWF 14,22. Daher werden alle Artefakte Apoplasten Verdünnung gedacht werden, um resultierende minimal sein. Ein zweiter möglicher Nachteil ist, dass die Elution der AWF durch Zentrifugation nicht alle im Apoplasten mehreren Gründen vorhandenen Moleküle nicht erfassen. Einige Verbindungen, insbesondere Kationen und Proteine ​​können dicht mit der negativ geladenen Zellwand assoziiert und nicht mit dem AWF 13 eluieren. Andere Moleküle, wie Proteine ​​ist möglicherweise zu groß, um effizient aus den Apoplasten zu den Zentrifugiergeschwindigkeiten verwendet 14 eluieren. Reaktive Sauerstoffspezies sind eine wichtige Klasse von Verbindungen in den Apoplasten erzeugt, aber aufgrund der kurzlebigen Natur dieser Verbindungen, und nicht näher Anforderungen für ihre Herstellung, ihre prEsence ist nicht gut von AWF Extraktion eingefangen. Es ist nicht bekannt, wie genau AWF stellt die in vivo Zusammensetzung Apoplasten Fluid und dies kann zwischen Spezies variieren. Mehrere Tests bestehen, um zytoplasmatische Kontamination festzustellen, obwohl keiner sind allgemein akzeptiert. Assays von überwiegend cytoplasmatischen Enzymen (zB G6PDH, Hexose-Phosphat-Isomerase, MDH) haben den Vorteil, dass sie leicht durchführen, kann aber nicht gut mit cytoplasmatischen Leck 14,18 korrelieren. Die Beurteilung der zytoplasmatischen Metaboliten (zB Hexose Phosphate, Chlorophyll) ist vielleicht bezeichnend, aber weniger gut untersucht 11. Dennoch können beide Arten von Assay nützlich für relative Quantifizierung apoplastischen Kontamination zwischen den Proben sein. Idealerweise sollten mehrere unabhängige Messungen verwendet werden, um die Integrität der AWF Probe validieren. Zwar erkennt seine Grenzen, die Infiltration-centrifugatihier beschriebene Technik bleibt eine einfache und robuste Technik, die in der Studie der apoplastischen Proteine, primäre und sekundäre Metaboliten und anorganischen Ionen.

<html> Die Anlage Apoplast ist die interzellulären Raum, die Pflanzenzellen umgibt. Dies ist ein dynamisches Umfeld, in dem viele Stoffwechsel- und Transportprozesse stattfinden. Das Hauptstrukturkomponente des Apoplasten ist die Zellwand, die zusammengebaut und durch Enzyme, strukturelle Proteine ​​und Metaboliten im Apoplasten befindet modifiziert. Bei gesunden Pflanzenzellen Apoplasten wird im allgemeinen in einem sauren Zustand gehalten ermöglicht Aminosäuren, Zucker und anderen Nährstoffen aus den Apoplasten zum Zytoplasma von H + symport 1 eingeführt werden. Während Saccharose Verkehr, Saccharose bewegt sich von photosynthetischen Quellen durch den Apoplasten und in Phloem Gefäßsystem; Saccharose wird dann durch einen osmotischen Potential apoplastischen Invertasen Abspalten Saccharose in der Spüle Organe 2 gehalten transportiert. Zucker und andere Nährstoffe können auch nach oben transportiert werden und reichern sich in der Stomata Hohlräume durch die Transpirationsstrom 3. &quot;&gt; Apoplasten stellt auch ein Umwelt Nische viele Krankheitserreger aufzubauen deren parasitäre Lifestyle. Bakterielle Pflanzenpathogene haben die Fähigkeit, hohe Dichten in den Apoplasten, das sie durch natürliche Öffnungen wie Stomata oder durch Wunden 4 Zugriff zu vermehren. Die Konzentration der Aminosäure Säuren und andere Stickstoffverbindungen in Tomaten Apoplast gezeigt worden sind, aus, um den Nährstoffbedarf von Bakterien und Pilzen 5,6 unterstützt sein. Primäre Abwehrreaktionen gegen mikrobielle Krankheitserreger auch im Apoplasten auftreten, nämlich die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies durch extrazelluläre Peroxidase . und Oxidasen und die Stärkung der Zellwand durch Vernetzung und Kallose Ablagerung 7. Die Pflanzenzellwand ist reich an sekundären Metaboliten mit antimikrobiellen Aktivitäten, die biochemische Natur dieser sekundären Metaboliten variiert zwischen den Arten 8. Als Ergebnis des oben erwähnened und andere Prozesse enthält Blatt apoplastischen Fluid eine Vielzahl von Proteinen, Zuckern, organischen Säuren, Aminosäuren, Sekundärmetaboliten, Metalle und andere Kationen (zum Beispiel Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Konzentrationen an gelösten Stoffen im Apoplasten der Triebe sind weitgehend durch das Gleichgewicht der Transportprozesse zwischen den Apoplasten und Xylem, Phloem und Zytoplasma 9 auftretenden gesteuert. Allerdings Stoffwechselreaktionen und mikrobielles Wachstum auch konsumieren oder produzieren apoplastischen gelöste Stoffe. Die Zusammensetzung des Apoplasten ist bekannt, dass zwischen Pflanzenarten und Genotypen und als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen, einschließlich Licht, Ernährung und biotische und abiotische Stressfaktoren 9 abweichen. Durch die Untersuchung der Zusammensetzung des Apoplasten und wie sie sich ändert, einschließlich Eigenschaften wie Redox und osmotische Potential, pH-Wert, Nährstoff / Metabolit Verfügbarkeit und enzymatischen Aktivitäten, kann man neue Erkenntnisse darüber, wie Pflanzen wieder gewinnenchen an ihre Umgebung. Verständnis oder die Charakterisierung der molekularen Veränderungen, die in den Apoplasten Lösung auftreten ist kompliziert, weil es eine räumlich strukturiert und dynamische Fach, in dem Metaboliten und / oder Ionen können flüchtige, transienten oder mit der Zellwand und Zellmembran assoziiert ist. Darüber hinaus werden verschiedene Analysetechniken erforderlich, um die Reihe von verschiedenen chemischen Typen abdecken. Um die Zusammensetzung des löslichen Apoplasten zu studieren, muss Fluid üblicherweise aus dem Gewebe herausgezogen werden. Es gibt verschiedene Verfahren, um aus verschiedenen Geweben, einschließlich einer neu vorgeschlagenen Filterstreifenmethode 10 extrahieren Apoplast Flüssigkeit, aber die meisten etablierten Extraktionsverfahren für Blätter ist Infiltration-Zentrifugation. Diese Technik hat sich bereits 11-13 bewertet worden und 14 Lohaus et al. 2001 eine gründliche Prüfung der viele der technischen Parameter der Methode. Wie der Name, die Infiltration-centrifu implizierttions Technik ist ein zweistufiges Verfahren, die im wesentlichen um Ersatz des apoplastischen Luftraum mit einer wässrigen Flüssigkeit Infiltration, die mit dem nativen apoplastischen Flüssigkeit vermischt, gefolgt von der Gewinnung der Infiltration / apoplastischen Fluidgemisch durch sanfte Zentrifugation der Blätter. Da das wiedergewonnene Flüssigkeit wird verdünnt und nicht alle in den Apoplasten vorliegenden Verbindungen (siehe unten), enthält, wird diese Flüssigkeit allgemein als Apoplasten Waschflüssigkeit (AWF) oder manchmal interzellulären Waschflüssigkeit, anstatt apoplastischen Fluid bekannt. Die Infiltrations Zentrifugationstechnik leicht skalierbar wodurch einzelne oder gepoolte AWF Proben ausreichender Lautstärke erzeugt und an eine Vielzahl von stromabwärts biochemischen und analytische Techniken (unterzogen werden, wie zB Protein-Elektrophorese, Messung der Enzymaktivität, NMR, viele Arten von Chromatographie und Massen Spektrometrie). Blatt AWF ist auch nützlich als Apoplasten imitiert Wachstumsmedium für die Untersuchung der Wechselwirkung von Pflanzen kolonisierenden Mikroorganismen with ihre Umgebung 5. In der folgenden Protokolle beschreiben wir, wie die Infiltration-Zentrifugationstechnik mit Phaseolus vulgaris cv durchzuführen. Tendergreen Blätter, und geben einige Beispiele für Downstream-Analysen mit dem Fokus auf Metabolomics. Wichtig ist, dass Methoden zur Bewertung der Qualität der AWF werden zusammen mit Beratung zur Verfügung gestellt, das Verfahren für unterschiedliche Blattarten zu optimieren.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher</td><td>12-640&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>4 Zoll Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Seitenarmkolben</td><td>SciLabware</td><td>12972831</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumquelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>50-813-28&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Schwingrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>Indigokarmin</td><td>Sigma</td><td>I8130</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>SciQuip</td><td>Christ Alpha 2-4 LD</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>biorad</td><td>166-0612EDU</td><td></td></tr><tr><td>Oxalessigsäure</td><td>Sigma</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose-6-phosphat</td><td>Sigma</td><td>G7250</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10128023001</td><td></td></tr><tr><td>MDH Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K654-100</td><td></td></tr><tr><td>G6PDH Assay Kit</td><td>Sigma</td><td>MAK015-1KT</td><td></td></tr><tr><td>G-6-P Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K657-100</td><td></td></tr><tr><td>Ribitol</td><td>Sigma</td><td>A5502</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>472476</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkonzentrator</td><td>Thermor Scientific</td><td>SC250EXP</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyaminhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>226904</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoracetamid</td><td>Sigma</td><td>394866</td><td></td></tr></tbody></table>

die infiltration-zentrifugation technik zur gewinnung von apoplastischen flüssigkeit aus pflanzenblättern verwenden phaseolus vulgaris als beispiel

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Apoplasten ist eine deutliche extrazellulären Raum in Pflanzengeweben, die außerhalb der Plasmamembran liegt, und enthält die Zellwand. Die apoplastischen Raum von Pflanzenblättern ist der Ort von mehreren wichtigen biologischen Prozessen wie Zellwandbildung, zelluläre Nährstoff- und Wasseraufnahme und Exportanlagen-Endophyten Interaktionen und Abwehrmechanismen gegen Krankheitserreger. Die Infiltration-Zentrifugationsverfahren wird auch eine robuste Technik für die Analyse der löslichen Apoplasten Zusammensetzung verschiedener Pflanzenspezies hergestellt. Das durch dieses Verfahren erhaltene Flüssigkeit wird häufig als Apoplasten Waschflüssigkeit (AWF) bekannt. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Vakuuminfiltration und Zentrifugationsverfahren für AWF Extraktion aus Phaseolus vulgaris (Französisch Bohne) cv. Tendergreen Blätter. Die Grenzen dieses Verfahrens und der Optimierung des Protokolls für andere Pflanzenarten diskutiert. Wiederhergestellte AWF können in einer breiten Palette von Downstream experimen verwendet werdents, die die Zusammensetzung des Apoplasten charakterisieren sucht und wie er in Reaktion auf Pflanzenart und Genotyp, der Pflanzenentwicklung und den Umgebungsbedingungen ändert, oder um zu bestimmen, wie Mikroorganismen wachsen in Apoplasten Fluid und auf Veränderungen in der Zusammensetzung.

Typische Ergebnisse für AWF Extraktionen auf gesunde 3 Wochen alt P. durchgeführt vulgaris cv. Tendergreen Blättern, unter Verwendung von destilliertem Wasser als Tränkflüssigkeit werden in Tabelle 2 gezeigt. Junge P. vulgaris Blätter zugänglich sind, um die Infiltration und am Zentrifugationsgeschwindigkeit hier verwendeten (1000 × g) das Entfernen der Mehrzahl der Tränkflüssigkeit durch Zentrifugation direkt ersichtlich, wie die Blätter wieder ihre ursprüngliche grüne Farbe. P. vulgaris Blattfrischgewicht betrug durchschnittlich 1,1 xg vor der Infiltration und ergab 0,5 ml AWF pro Gramm Frischgewicht. Die Proteinkonzentration der AWF wurde bestimmt auf 0,18 ± 0,08 mg / ml unter Verwendung eines Standard Bradford-Test. Der Verdünnungsfaktor für diese Blätter, durch die Messung Indigokarmin Verdünnung berechnet, betrug 2,3 ± 0,3-fache. Die oben genannten Werte können erheblich zwischen den Arten und Pilotversuche unterscheiden sind erforderlich, um die Ausbeute der AWF pro Gramm Blattfrisch wir bestimmen,ight sowie die AWF Proteinkonzentration und Verdünnungsfaktor, der für einen bestimmten Blatttyp erwartet werden kann. Beschädigungen der Integrität der Zellen kann sowohl während des Infiltrationsschritt während des Zentrifugationsschritts auftreten, wenn die Änderungen im Druck zu schnell sind, und wenn die Zentrifugalkraft zu hoch ist. Es ist daher notwendig, AWF Proben für Marker zytoplasmatischer Kontamination zu testen; Idealerweise werden mehrere unabhängige Tests durchgeführt. Hier werden die Ergebnisse von drei möglichen Tests in Tabelle 2 angegeben. In gut durch Extraktionen P. vulgaris AWF war G6PDH durch eine Standard-Enzymtest nicht nachweisbar. Dies steht im Einklang mit anderen Berichten, wo G6PDH Aktivität wird erst oberhalb eines Schwellen Zentrifugalkraft 12 nachweisbar. Im Gegensatz dazu wird ein Basisniveau der Malat-Dehydrogenase-Aktivität (2,5 U / ml) war in allen P. nachweisbaren vulgaris AWF Proben mit einem Standard-Stoffwechseltest. Die Erhöhung der Zentrifugalkraft fürce über einem Schwellenwert von 1.000 x g führte zu einer erhöhten MDH-Aktivitäten (Ergebnisse nicht gezeigt). Da das Apoplast von anderen Spezies ist bekannt, endogene MDH-Aktivität 18 enthält, wird das hier erfasste Menge oberhalb dieser Grundpegel als echt apoplastischen Aktivität und signifikante Erhöhungen weisen auf Verschmutzung. Metaboliten, die vermutlich vorwiegend zytoplasmatischen sein, wie Hexose-6-Phosphate, können auch verwendet werden, um Kontamination AWF beurteilen. Hier erfasst GC-MS-Analyse Null oder Spurenmengen von G-6-P in AWF Extraktionen. Im Gegensatz dazu schneiden Maiswurzelbereiche, G-6-P wurde nach AWF Extraktion bei allen Zentrifugiergeschwindigkeiten detektiert und erhöhte Konzentration mit höheren Drehzahlen, was anzeigt zytoplasmatischen Verunreinigungen 10. Metabolit-Analyse durch GC-MS von P. vulgaris Blatt AWF ergibt typischerweise 40 - 60 identifizierbare Metaboliten und eine etwa gleiche Anzahl von nicht identifizierbare Verbindungen (Abbildung 2). Odernische Säuren, einfache Zucker und Aminosäuren stellen den Großteil der identifizierbare Metaboliten jedoch sekundäre Pflanzenstoffe haben auch festgestellt und von AWF 11 quantifiziert. Verschiedene Beispiel Peaks aus diesen unterschiedlichen Molekülklassen sind in Figur 2 markiert Abwärts analytische Techniken sind für diese Proben AWF um verschiedene Moleküle zu quantifizieren, z. Beispiel: ICP-MS, NMR, HPLC, Atomabsorptionsspektroskopie, Proteinmassenspektroskopie. Die Proteinkomponente des Apoplasten wird auch in der AWF dargestellt, wie in dem Coomassie-Brilliant-Blue gefärbtes SDS-PAGE-Gel in 3 gezeigt. Unter anderen Funktionen sind die apoplastischen Enzyme für die Synthese der Zellwand und der Erzeugung von extrazellulärer reaktiver verantwortlich Sauerstoffspezies. Proteomik der AWF aus verschiedenen Spezies Dutzende einzelner Proteine ​​identifiziert und gezeigt, dass die Proteinkomponente des Apoplasten reagiert Environmental Stress 13,19. Im Idealfall sollte AWF Extrakt frei von Verunreinigungen sein von zytoplasmatischen Proteinen, wie Rubisco; aber in der Praxis ist dies schwierig zu erreichen. Die Anwesenheit eines Rubisco Proteinbande bei ~ 53 kDa nach SDS-PAGE ein weiterer qualitativer Assay für die Integrität der AWF Proben. Zum Beispiel kann die Probe in Spur 2 in Figur 3 eingelegt enthält eine größere Menge von Rubisco Kontamination der von Spur 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris AWF </td></tr><tr><td> Volumen der AWF (ml g -1 Blatt FW) </td><td> 0,49 ± 0,09 </td></tr><tr><td> Protein Konz. (Mg ml -1) </td><td> 0,18 ± 0,08 </td></tr><tr><td> Verdünnungsfaktor </td><td> 2,3 ± 0,3 </td></tr><tr><td> G6PDH Aktivität (U ml -1) </td><td nicht nachgewiesen></td></tr><tr><td> Glc-6-P (mg ml -1) </td><td> nicht nachgewiesen </td></tr><tr><td> MDH-Aktivität (U ml -1) </td><td> 2,5 ± 0,9 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Typische Ergebnisse für AWF Extraktionen von P. vulgaris cv. Tendergreen Blätter. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg"> Abbildung 1. Standard Apoplast Extraktion Workflow. Die Zahlen beziehen sich auf die Schritte in dem Protokoll. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg"> Abbildung 2. Ein Beispiel GC-MS-Chromatogramm von P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF Die numerierten Beispiel Metabolit Peaks sind: 1-malonsäurediethylester, 2-phosphat, 3-Succinat, 4-unbekannt, 5-Malat, 6-Asparagin, 7-ribitol (interne standard), 8-Citrat, 9-Glucose, 10-Inosit, 11-Kaffeesäure, 12-Saccharose. <img alt="Figur 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250"> Figur 3 Ein Beispiel SDS-PAGE mit Coomassie-gefärbtes Gel P. Vulgaris AWF Blattextrakten. Dieses Gel zeigt einen Vergleich zwischen den Proteinkomponenten von zwei AWF Extraktionen, die in der Menge von cytoplasmatischen Verunreinigungen unterscheiden sich durch die reichlich vorhandenen plastidären Enzym Rubisco. Nach AWF Extraktions beide Proben wurden in einem 4-fachen Überschuß (v / v) kaltem Aceton Aceton Proteinfällung unterzogen und in Wasser bei einem Zehntel des ursprünglichen Volumens wieder aufgelöst. Spuren 1 und 2 enthalten 40 ug Protein. Die Bande, die dem Rubisco große Kette (~ 53 kDa) wird durch einen Pfeil angezeigt. M r: Protein-Molekulargewichtsmarker.

Dieses Protokoll beschreibt die optimierte Extraktion von Apoplast-Waschflüssigkeit aus Pflanzenblättern, wobei französische Bohnenpflanzen (Phaseolus vulgaris) als Modellbeispiel verwendet werden.

Die Infiltration-Zentrifugation Technik zur Gewinnung von apoplastischen Flüssigkeit aus Pflanzenblättern verwenden Phaseolus vulgaris Als Beispiel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Extraktion von aplastischer Flüssigkeit aus Pflanzenblättern mit Hilfe der Infiltrationszentrifugationstechnik zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem ein Blatt zuerst in Infiltrationsflüssigkeit getaucht und Druckunterschiede, die mit einer Spritze oder Vakuumpumpe erzeugt werden, genutzt werden, um es vollständig zu infiltrieren. Der zweite Schritt besteht darin, das zu zentrifugierende Blatt mit Hilfe einer Stützvorrichtung vorzubereiten.Anschließend wird das Blatt schonend zentrifugiert, um die Waschflüssigkeit APO plast zu erhalten. Der letzte Schritt besteht darin, den APO-Plast-Verdünnungsfaktor zu bestimmen und die Qualität der letzten Waschflüssigkeit zu bestimmen. Letztendlich wird der Infiltrationszentrifugationsassay verwendet, um repräsentative APO-Plast-Proben zu gewinnen, die für eine Vielzahl von Downstream-Analysen verwendet werden können.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden besteht darin, dass es einfach ist, sie für eine Vielzahl von Blatttypen zu optimieren, um obere Plus-Proben zu erhalten, die eine minimale Kontamination mit zytoplasmatischen Verbindungen aufweisen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in Bereichen wie der Pflanzenphysiologie und den Interaktionen mit Pflanzenmikroben zu beantworten, wo es wichtig ist zu verstehen, wie die Zusammensetzung der APLs zwischen Pflanzen variiert und sich unter verschiedenen physiologischen Bedingungen oder Belastungen verändert. Treffen Sie als ersten Schritt Sicherheitsvorkehrungen, indem Sie einen Laborkittel, einen Handschuh und eine Schutzbrille tragen.Bereiten Sie als Nächstes ein Volumen destilliertes Wasser vor, in das Sie die Blattprobe eintauchen können. Halten Sie eine Rasierklinge bereit, um in diesem Fall eine Probe zu entnehmen, ein Blatt der Bohnensorte zartes Grün. Lege die Rasierklinge gegen das Haustier eines Blattes und befestige das Blatt von der Pflanze.Tauchen Sie das frisch herausgeschnittene Blatt nach dem Sammeln in destilliertes Wasser, um Verunreinigungen auf der Blattoberfläche zu entfernen. Verwenden Sie dann ein saugfähiges Taschentuch oder Papier, um das Blatt vorsichtig trocken zu halten. Messen Sie das Blattgewicht, bevor Sie mit der Infiltration fortfahren.Dies wird später bei der Annäherung an das Infiltrationsvolumen helfen. Starten Sie den Infiltrationsprozess mit einer 60-Milliliter-Spritze. Wenn der Kolben entfernt ist, rollen und/oder falten Sie das Blatt vorsichtig in die Spritze.Füllen Sie anschließend die Spritze mit Infiltrationsflüssigkeit. Hier kommt destilliertes Wasser zum Einsatz. Setzen Sie den Kolben ein und drehen Sie die Spritze um, um die darin enthaltene Luft auszustoßen.Notieren Sie sich die Blattfarbe für einen späteren Vergleich. Bewegen Sie den Kolben mit einem kleinen Stück Para Param bis zur 40-Milliliter-Markierung. Decken Sie die Spritzenspitze ab.Ziehen Sie dann den Kolben bis zur 60-Milliliter-Markierung, um einen Unterdruck zu erzeugen. Drehen Sie die Spritze um, um Luftblasen von der Blattoberfläche freizusetzen. Bringen Sie den Kolben über etwa zwei Sekunden langsam wieder in die Ausgangsposition.Decken Sie die Spritzenspitze ab und stoßen Sie jegliche Luft aus. Decken Sie dann die Spitze wieder ab und drücken Sie auf den Kolben, um einen moderaten Überdruck zu erzeugen. Üben Sie weiterhin Unterdruck aus, um Luft auszustoßen und Überdruck auszuüben, bis das Blatt vollständig infiltriert ist.Ein Beweis für eine vollständige Infiltration ist die dunkle Farbe der infiltrierten Bereiche. Sobald dies zu sehen ist, entfernen Sie das Blatt aus der Spritze. Blockieren Sie das Blatt vorsichtig mit saugfähigem Papier, um Oberflächenflüssigkeit zu entfernen.Messen Sie dann das Gewicht des infiltrierten Blattes, und eine alternative Infiltrationsmethode verwendet eine Isolierflasche. Sammeln Sie erneut ein Blatt und spülen Sie es in destilliertem Wasser ab. Nachdem Sie es trocken gestrahlt haben, messen Sie das Blattgewicht.Besorgen Sie sich einen Seitenkolben mit einem Fassungsvermögen von mindestens 250 Millilitern. Lege das Blatt in den Kolben und bedecke ihn mit destilliertem Wasser. Setzen Sie dann einen Stopfen in den Kolben ein und befestigen Sie eine Vakuumpumpe am Seitenarm.Den Kolben lange genug vakuumieren, um einen Druck zu erreichen. Ungefähr 650 Millimeter Quecksilber. Den Kolben vorsichtig umrühren, um Luftblasen aus dem Blatt zu lösen, während der Druck reduziert wird.Lassen Sie dann das Vakuum vorsichtig und langsam über einen Zeitraum von ca. 10 Sekunden los. Wiederholen Sie den Vorgang des Anlegens eines Vakuums, des Rührens des Kolbens und des Loslassens des Vakuums, bis das Blatt vollständig infiltriert ist. Ein Beweis für eine vollständige Infiltration ist die dunkle Farbe der infiltrierten Bereiche.Das vollständig infiltrierte Blatt aus dem Kolben nehmen und vorsichtig mit saugfähigem Papier abtupfen. Um Oberflächenflüssigkeit zu entfernen, messen Sie das Gewicht des infiltrierten Blattes, um das ungefähre Infiltrationsvolumen bestimmen zu können. Nachdem ein Blatt vollständig infiltriert wurde, bereiten Sie es für die Zentrifugation vor.Legen Sie ein Stück vier Zoll breite Para-Folie aus. Legen Sie das Blatt auf die Parafolie. Rollen Sie dann das Blatt mit einer Fünf-Milliliter-Pipettenspitze in der Para-Folie auf.Nehmen Sie einen 20-Milliliter-Spritzenkörper mit entferntem Kolben und führen Sie das aufgerollte Blatt mit der Pipettenspitze ein. Positionieren Sie alle abgeschnittenen Blattkanten mit Blick auf das Kolbenende. Besorgen Sie sich ein 50-Milliliter-Röhrchen aus Polyethylen oder Polycarbonat und führen Sie die Spritze hinein.Verwenden Sie eine Zentrifuge mit einem schwingenden Schaufelrotor. Das Röhrchen mit dem infiltrierten Blatt und die Zentrifuge mit einer Temperatur von vier Grad Celsius und 1000 g wird 10 Minuten lang geladen. Untersuchen Sie nach der Zentrifugation das Blatt, um festzustellen, ob der größte Teil der Infiltrationsflüssigkeit ausgestoßen wurde.Das Zentrifugenröhrchen enthält nun die zurückgewonnene APO-Plast-Waschflüssigkeit. Fahren Sie fort, indem Sie die zurückgewonnene und letzte Waschflüssigkeit in frische 1,5-Milliliter-Röhrchen pipettieren. Geben Sie die Proben der APO plast Waschflüssigkeit in die Zentrifuge und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 15.000 g, um alle Zellen oder Partikel zu entfernen. Nach der Zentrifugation pipettieren Sie das Supinat in frische Röhrchen.Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, bis sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden können. Eine Methode zur Beurteilung der Qualität der APO-Plat-Waschflüssigkeit ist die Berechnung des APO-Plat-Verdünnungsfaktors. Bereiten Sie dazu zwei Volumina der Infiltrationsflüssigkeit destilliertes Wasser in diesem Fall jeweils ausreichend für mehrere Infiltrationen auf ein Volumen vor.Indigokarminpulver bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikromolaren zugeben. Fügen Sie dem anderen nichts hinzu. Besorgen Sie sich eine 96-Well-Mikroplatte und füllen Sie drei Wells mit 200 Mikrolitern der Infiltrationslösung.Füllen Sie drei weitere mit Indigokarmin mit 200 Mikrolitern der unverfälschten Infiltrationslösung, legen Sie die Mikroplatte in das Lesegerät, um die Absorption jeder Flüssigkeit zu messen. Bei 610 Nanometern ergibt die durchschnittliche Extinktion für Flüssigkeit mit Indigokarmin abzüglich des durchschnittlichen Absorptionsmittels für Flüssigkeit ohne die korrigierte Absorption des Infiltrats. Replizieren Sie als Nächstes das Blattinfiltrationsprotokoll dreimal für jede der Infiltrationslösungen.Tauchen Sie eine Blattprobe in Wasser. Üben Sie bei der Verwendung der Indigokarmin-Infiltrationslösung Unter- und Überdruck aus, spülen Sie die Blätter nach der Infiltration in destilliertem Wasser ab, um alle verbleibenden Indigokarmin von der Blattoberfläche zu entfernen. Gewinnen Sie eine letzte Waschflüssigkeit durch Zentrifugation zurück.Nachdem Sie die letzte Waschflüssigkeit zurückgewonnen haben, kehren Sie zum Plattenleser in den Vertiefungen der Mikroplatte zurück. Platziert wurden 200 Mikroliter jeder der Indigokarmin-freien Extraktionen und auch 200 Mikroliter jedes Indigokarmins bei der Extraktion der Waschflüssigkeit. Messen Sie die Extinktion der Proben bei 610 Nanometern, um die korrigierte Extinktion zu erhalten.Mitteln Sie jeden Zahlensatz und nehmen Sie die Differenz. Verwenden Sie die korrigierte Extinktion des Infiltrats und die korrigierte Absorption der aplastischen Waschflüssigkeit, um den APL-Verdünnungsfaktor zu bestimmen und so Schätzungen der Konzentrationen oder Aktivitäten in der aplastischen Flüssigkeit zu erhalten. Multiplizieren Sie die Konzentrations- oder Aktivitätswerte aus der letzten Waschflüssigkeit mit dem Verdünnungsfaktor, der in der letzten Waschflüssigkeit aus der Sorte Fasi vulgaris extrahiert wird.Tender Green wurde verwendet, um diese Gaschromatographie Massenspektrum organischer Säuren herzustellen. Einfachzucker und Aminosäuren stellen den Großteil der identifizierbaren Metaboliten dar. Hier ist ein Vergleich der SDS-Seite, Kumasi Fleckengele von fasi vulgarus alast Waschflüssigkeit Blattextrakte.Die Extraktionen unterscheiden sich in der Menge der zytoplasmatischen Kontamination. Dies wird in unterschiedlichen Mengen des Gipsenzyms Rubis beobachtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, so sanft wie möglich zu sein, um Gewebeschäden oder zytoplasmatische Kontaminationen nach diesem Verfahren zu vermeiden.Andere Methoden, wie z.B. Protein- oder Metaboliten-Massenspektrometrie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Zusammensetzung der aplastischen Flüssigkeit zu beantworten. Aplastische Waschflüssigkeit kann auch als Bruttomedium verwendet werden, um die Wirkung von aplastischen Chemikalien auf die Mikroorganismen zu untersuchen, die Pflanzengewebe besiedeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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