Hohe Auflösung Elektronenmikroskopie der Helicobacter pylori Cag Typ IV-Sekretionssystem Pili Produziert in variierenden Bedingungen von Iron Verfügbarkeit

Das Verfahren visualisiert die Hyperproduktion von CAG-Typ-4-Sekretionssystem pii, die unter Bedingungen der Eisenlimitierung auftritt, die erste Kultur h pylori unter Bedingungen der Eisenlimitierung. Der zweite Schritt besteht darin, h pylori mit Magenepithelzellen zu co-kultivieren. Als nächstes bereiten Sie die Co-Kultur-Proben für die Rasterelektronenmikroskopie auf.

Letztendlich wird die hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie verwendet, um eine erhöhte PI-Augenproduktion des CAG-Typ-4-Sekretionssystems unter Bedingungen der Eisenlimitierung zu zeigen. Die Technik in diesem Manuskript ist wichtig für h pylori-bedingte Krankheiten wie Magenkrebs, da das CAG-Sekretionssystem vom Typ 4 mit einem erhöhten Risiko für negative Krankheitsergebnisse verbunden ist. Damit ein besseres Verständnis der Regulation dieser wichtigen Bakterienoberfläche.

Organelle könnte neue chemotherapeutische Angriffspunkte aufdecken Und der Vorteil der hochauflösenden Rasterelektronenmikroskopie gegenüber bestehenden Methoden wie der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass die einzelne Typ-4-Sekretpille I sichtbar gemacht werden kann. Personen, die mit dieser Methode der Elektronenmikroskopie noch nicht vertraut sind, haben Probleme mit dem Verfahren, insbesondere mit der Nasschemie, da sie ein sorgfältiges Timing und eine feinfühlige Hand am Blut erfordert. Agarplatten wachsen.

H Pylori PMs, S one Bakterien und ihre isogene CAG e-Mutante, der ein funktionierendes Typ-4-Sekretionssystem fehlt. Impfen Sie Kulturen und modifizierte Ella-Brühe, die mit Cholesterin angereichert ist, um über Nacht zu wachsen. Als nächstes säen Sie eine GS-humane Magenepithelzelle auf Polylysin-behandelte Deckgläser in 12-Well-Platten für unterschiedliche Bedingungen der Eisenverfügbarkeit.

H pylori wird auf eine optische Dichte 600 von 0,3 in modifizierter Bru-Bouillon verdünnt. Medien, die 100 Mikromolaren Eisenchlorid, 200 Mikromolare des synthetischen Eisenchelator-Dippers oder 200 Mikromolare des Dippers plus 200 Mikromolaren Eisenchlorid-Kultur enthalten. Die Proben zentrifugieren nun vier Stunden lang die Bakterien bei 1000 g und Resus suspendiert die Pellets in einem gleichen Volumen frischer, modifizierter Bru-Brühe, die mit Cholesterin ergänzt ist.

Messen Sie die Bakteriendichte. Als nächstes infizieren Sie die Epithelzellen mit den h pylori bei einer Infektionsvielfalt von 20 zu eins. Führen Sie serielle Verdünnungen durch und plattieren Sie die Bakterienzellen auf Blutagarplatten.

Um die Lebensfähigkeit der bakteriellen Zellen zu beurteilen, legen Sie die Co-Kulturen für vier Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Dekantieren Sie den Überstand aus den h pylori I und a GS Co-Kulturen. Waschen Sie die adhärenten Zellen vorsichtig dreimal mit 0,05 molaren Natriumschichtpuffern.

Anschließend fixieren Sie die Proben für zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend die Proben dreimal mit 0,05 molaren Natrium-Cacoat-Puffer. Für eine sekundäre Fixierung werden 0,1%Osmiumtetroxid in 0,05 molaren Natrium-Cacoat-Puffer in zwei aufeinanderfolgenden 10-minütigen Fixierungsschritten zugegeben.

Nach drei Wäschen dehydrieren Sie die Proben mit erhöhten Ethanolkonzentrationen. Geben Sie die Proben in eine Trocknermaschine für kritische Punkte und füllen Sie dann die Kammer mit flüssigem Kohlendioxid. Ethanol wird aus der Kammer gespült und die Kammer wieder mit flüssigem Kohlendioxid gefüllt.

Die Probe wird dann auf den kritischen Punkt von 31,1 Grad Celsius und 1073 PSI gebracht. Montieren Sie nun die Deckgläser auf Aluminium-REM-Probenstummel und malen Sie eine dünne Linie aus kolloidalem Silber an den Probenrand zur Erdung. Während der REM-Bildgebung werden die Proben mit einer Sputterbeschichtungsmaschine mit fünf Nanometern Gold-Palladium beschichtet, um das Sekundärelektronensignal der Probe und den Kanteneffekt zu erhöhen. Untersuchen Sie die Proben mit einem Rasterelektronenmikroskop mit einer Feldemissionskanone im Hochvakuummodus bei einem Arbeitsabstand von fünf bis 10 Millimetern.

Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf fünf Kilovolt ein. Stellen Sie dann die Spotgröße auf zwei bis 2,5 ein. Kippen Sie nun die Probe um 15 bis 25 Grad, um eine bessere Sicht auf die Schnittstelle zwischen Wirt und Erreger für die Betrachtung mit hoher Vergrößerung zu erhalten.

Priorisieren Sie die Bildgebung von Bakterien, die an den Rändern der Epithelzellen anhaften, für PI lebenserwärmende Bakterien, die durch Wirts-Erreger-Interaktionen angereichert sind. Öffnen Sie die Mikrographendateien in der Image J-Software. Identifizieren Sie Pi li als Strukturen, die sich zwischen der Bakterienzelle und der Wirtszelle mit einer einheitlichen Breite von 10 bis 13 Nanometern und einer Länge von 60 bis 150 Nanometern bilden.

Kalibrieren Sie das Messwerkzeug, indem Sie mit dem Werkzeug für gerade Linien eine Linie zeichnen und dann im Dropdown-Menü auf die Registerkarte "Analysieren" klicken. Wählen Sie Maßstab einstellen und geben Sie den Wert des Vergrößerungsbalkens unter bekannter Abstand ein und stellen Sie die Längeneinheit auf den Nanometer ein. Klicken Sie dann auf OK.

Zeichnen Sie nun mit einem Geradenwerkzeug über die Länge oder Breite der Piloten und drücken Sie dann Strg M, um jeden Piloten zu messen und die gemessenen Werte in einem Tabellenkalkulationsprogramm aufzuzeichnen. Verwenden Sie zuvor festgelegte Längen- und Breitenparameter, um Merkmale zu ignorieren, die nicht zum Profil des CAG-Sekretionssystems vom Typ vier passen. Quantifizieren Sie dann die Anzahl der PI I auf der Grundlage von Werten, die im Bereich liegen, statistisch analysiert, eine Quantifizierung des PI LI mit einem zweiseitigen Schüler-T-Test.

In diesem Experiment wurden h pylori unter eisenarmen Bedingungen unter Verwendung des synthetischen Chelators Dip Parital in Konzentrationen kultiviert, die das Wachstum nicht signifikant hemmen. Die Bakterien produzierten bei der Co-Kultivierung mit menschlichen Magenzellen zahlreiche PII des CAG-Typ-4-Sekretionssystems. Umgekehrt, wenn eine exogene Quelle für den Nährstoff Eisen vorhanden ist, wird die Bildung von CAG-Typ-4-Sekretionssystem PII unterdrückt.

Die Quantifizierung des PII an der Schnittstelle des Wirtserregers zeigt, dass h pylori unter Bedingungen der Eisenrestriktion eine zweifache Erhöhung des CAG-Typ-4-Sekretionssystems PI eye aufweist, der prozentuale Anteil der pilierten Zellen steigt um 11% im Vergleich zu Zellen, die nur in Medium gezüchtet werden. Interessanterweise bleiben die PI LI-Dimensionen unter allen Bedingungen der Eisenverfügbarkeit konsistent, obwohl die Aktivität des CAG-Typ-4-Sekretionssystems, gemessen durch die IL-8-Sekretion des Wirts, unter Bedingungen der Eisenrestriktion erhöht und unter Bedingungen der überschüssigen Eisenverfügbarkeit unterdrückt wird. In Übereinstimmung mit der Beteiligung des CAG-Typ-4-Sekretionssystems verändert die Eisenverfügbarkeit die Biogenese von PI LI auf der Oberfläche einer CAG-e-Mutante nach ihrer Entwicklung nicht.

Diese REM-Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet des CAG-Typ-4-Sekretionssystems, um die Proteinlokalisierung zu erforschen. In Bezug auf den CAG-Typ vier Sekretionssystem-Kissen. Kürzlich wurde entdeckt, dass das Effektorprotein CAG a an der Spitze der Sekretpille vom Typ 4 lokalisiert ist.