Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Struktur makromolekularer Komplexe durch Einzelteilchenanalyse von Elektronenkryomikroskopie-Daten mit der Bildverarbeitungssoftware SPHIRE zu bestimmen. Die Einzelpartikel-Kryo-EM wird zu einer Mainstream-Technologie für die Untersuchung von Makromolekülstrukturen mit nahezu atomarer Auflösung. SPHIRE ist ein neuartiges Softwarepaket, das eine halbautomatische Verarbeitung von Kryo-EM-Daten auf benutzerfreundliche Weise ermöglicht.

Der Hauptvorteil von SPHIRE ist der automatische Validierungsmechanismus. Die meisten Verfahren müssen nur einmal durchgeführt werden, und die Ergebnisse sind objektiv und reproduzierbar. Mit hochauflösender Kryo-EM lassen sich einzelne Rückstände platzieren und geben so entscheidende Einblicke in die Organisation und Funktion komplexer mikromolekularer Maschinen.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, sollten bedenken, dass das Erreichen einer hochauflösenden Struktur stark von der Qualität der Probe und der Eingabedaten abhängt. Um die SPHIRE-Anwendung zu verwenden, öffnen Sie die GUI über das Terminal. Öffnen Sie die DIENSTPROGRAMME, um ein Kryomikroskopie-Bild mit e2display anzuzeigen.

Verwenden Sie das integrierte Messwerkzeug, um die längste Partikelachse in Ångström pro Pixel zu messen. Öffnen Sie die Projekteinstellungen. Legen Sie die Größe des CTF-Fensters mindestens auf die Größe des Partikelrahmens fest.

Legen Sie die Größe des Partikelkastens auf eine gerade Zahl fest, die mindestens dem 1 1/2-fachen des Partikeldurchmessers entspricht. Stellen Sie den Partikelradius auf mindestens die Hälfte der gemessenen Länge ein. Geben Sie die Punkt-Gruppen-Symmetrie ein, falls bekannt, und die ungefähre Molekülmasse.

Registrieren Sie die Einstellungen. Öffnen Sie anschließend im Menü FILM die Ausrichtung des Mikrographenfilms. Legen Sie die Pfade für die ausführbaren Dateien unblur und summovie fest.

Wählen Sie einen nicht ausgerichteten Rohfilm aus und ersetzen Sie die Variable Dateiname durch einen Platzhalter, um das Pfadmuster für das Eingabemikrogramm festzulegen. Benennen Sie das Ausgabeverzeichnis. Geben Sie die Anzahl der Filmbilder, die Mikroskopspannung und die Belichtung pro Bild ein.

Führen Sie den Prozess aus, um dosisgewichtete und dosisungewichtete bewegungskorrigierte durchschnittliche Schliffbilder zu erstellen. Öffnen Sie als Nächstes das CTER-Menü und wählen Sie CTF-Schätzung aus. Legen Sie die dosisungewichteten Schliffbilder als Eingabe fest.

Benennen Sie das Ausgabeverzeichnis, und geben Sie die Datenerfassungsparameter ein. Legen Sie die niedrigste Frequenz auf 0285 inverse Angström und die höchste Frequenz auf 0,285 inverse Angström fest. Führen Sie den Prozess aus, um eine Liste von CTF-Parametern zu generieren.

Öffnen Sie anschließend das Menü FENSTER und wählen Sie Partikelauswahl. Legen Sie die dosisgewichteten Mikroskopbilder als Eingabe fest und starten Sie das Dienstprogramm e2boxer. Führen Sie die Partikelauswahl manuell oder automatisch durch.

Extrahieren Sie die ausgewählten Partikel in Bildstapel und kombinieren Sie die Stapel zu einem einzelnen virtuellen Bildstapel in einer BDB-Datenbank. Nachdem die Partikel ausgewählt und gestapelt wurden, öffnen Sie das ISAC-Menü und wählen Sie ISAC 2D-Clustering aus. Legen Sie den virtuellen Image-Stack in der BDB-Datenbank als Eingabe fest.

Schätzen Sie die Anzahl der Bilder pro Klasse. Geben Sie die verbleibenden Parameter ein und generieren Sie die 2D-Klassendurchschnitte. Sobald die 2D-Klassifizierung abgeschlossen ist, verwenden Sie das Dienstprogramm "Daten anzeigen", um die validierten reproduzierbaren Klassendurchschnitte anzuzeigen.

Stellen Sie sicher, dass mehrere Partikelorientierungen dargestellt werden und die Klassendurchschnitte von zufriedenstellender Qualität sind. Generieren Sie einen neuen virtuellen Image-Stack, der nur Partikel enthält, die zu den validierten Klassendurchschnitten gehören. Öffnen Sie als Nächstes das VIPER-Menü und verwenden Sie das Dienstprogramm Daten anzeigen, um die Klassendurchschnitte anzuzeigen.

Löschen Sie Klassendurchschnitte mit schlechter Qualität oder identischen Ansichten des Partikels. Speichern Sie die verbleibenden Klassendurchschnitte in einer neuen Datei. Wählen Sie dann Anfangsmodell RVIPER aus, und verwenden Sie die kleine Auswahl an Klassendurchschnitten als Eingabe.

Führen Sie den Befehl aus, um ein erstes reproduzierbares 3D-Modell des Proteins zu generieren. Untersuchen Sie das Modell im molekularen Grafikprogramm Chimera. Vergleichen Sie das Modell mit einer bekannten Struktur eines homologen Proteins oder einer Domäne aus dem interessierenden Protein.

Kehren Sie zum VIPER-Menü in SPHIRE zurück und wählen Sie 3D-Referenz erstellen. Generieren Sie ein erstes 3D-Referenzmodell mit der richtigen Pixelgröße und einer 3D-Maske. Öffnen Sie das MERIDIEN-Menü und wählen Sie 3D-Verfeinerung.

Geben Sie den Eingabebildstapel und die anfänglichen Pfade der 3D-Referenzdatei ein. Benennen Sie das Ausgabeverzeichnis, und legen Sie die Maske des Referenzmodells als 3D-Maske fest. Wählen Sie Harte 2D-Maske anwenden aus.

Legen Sie die Anfangsauflösung auf 20 bis 25 Ångström fest, und führen Sie die 3D-Verfeinerung aus, um die ungefilterten Halbvolumina zu erzeugen. Schauen Sie sich dann in ungefiltertem halbem Volumen in Chimera an. Bestimmen Sie einen Binarisierungsschwellenwert, bei dem alle Proteindichten miteinander verbunden sind, Rauschartefakte jedoch nicht.

Kehren Sie zum MERIDIEN-Menü von SPHIRE zurück und öffnen Sie Adaptive 3D Mask. Geben Sie den ungefilterten Schwellenwert für die Eingabe und Binarisierung mit halbem Volumen ein. Benennen Sie die Ausgabemaske, und führen Sie den Vorgang aus, um eine 3D-Maske mit weichen Kanten zu generieren.

Öffnen Sie dann die Option Scharfzeichnen, und wählen Sie beide ungefilterten Halblaute aus. Legen Sie die 3D-Maske mit weichem Rand und halbem Volumen als die vom Benutzer bereitgestellte Maske fest. Führen Sie den Prozess aus, der die halben Volumina zusammenführt und dann das zusammengeführte Volume filtert und schärft.

Öffnen Sie die Protokolldatei, um die endgültige Auflösungsschätzung anzuzeigen. Generieren Sie eine 3D-Karte der Partikelwinkelverteilung des Eingabebildstapels, der während der 3D-Verfeinerung generiert wurde. Öffnen Sie das geschärfte und gefilterte 3D-Modell in Chimera.

Überprüfen Sie die Dichtekarte und ihre hochauflösenden Funktionen. Öffnen Sie die Winkelverteilung in Chimera, und stellen Sie sicher, dass die Euler-Winkel isotrop verteilt sind. Öffnen Sie das Menü SORT3D, und wählen Sie 3D-Variabilitätsschätzung aus.

Generieren Sie eine 3D-Variabilitätskarte aus dem virtuellen Stapel von Partikelbildern, die zu den validierten Klassendurchschnitten gehören. Generieren Sie aus dieser Variabilitätskarte eine binarisierte 3D-Maske für das anschließende fokussierte 3D-Clustering. Öffnen Sie dann das 3D-Clustering-RSORT3D, und wählen Sie das Verzeichnis der vorherigen 3D-Verfeinerung als Eingabe aus.

Benennen Sie das Ausgabeverzeichnis und legen Sie die globalen und fokussierten 3D-Masken fest. Verwenden Sie mindestens 5.000 bis 10.000 Bilder pro Gruppe für große Datensätze. Führen Sie den Sortierprozess aus, um Volumen jeder homogenen 3D-Gruppe zu generieren.

Verwenden Sie Chimera, um die Struktur mit der höchsten scheinbaren Auflösung zu identifizieren. Kehren Sie zum Menü SORT3D in SPHIRE zurück und öffnen Sie Local Subset Refinement. Legen Sie den Pfad der Teilmengentextdatei auf die Partikel-ID-Clusterdatei fest, die der Struktur mit der höchsten Auflösung entspricht.

Legen Sie das Verzeichnis für die 3D-Verfeinerung auf das Verzeichnis fest, das die ungefilterten halben Volumina und die Neustartiteration auf die Iteration mit der höchsten Auflösung aus der vorherigen 3D-Verfeinerung enthält. Führen Sie den Befehl aus, um lokale, ungefilterte halbe Volumes zu generieren. Erstellen Sie dann eine 3D-Maske mit weichen Kanten aus einem der lokalen Halbvolumen.

Führen Sie die lokalen Halblautstärken zusammen und schärfen Sie die zusammengeführte Lautstärke, ohne einen Tiefpassfilter anzuwenden. Öffnen Sie als Nächstes das Menü LOCALRES und klicken Sie auf Lokale Auflösung. Wählen Sie die lokalen halben Volumes aus.

Wählen Sie dann die lokale Maske mit weichen Kanten aus. Legen Sie die Gesamtauflösung auf die absolute Auflösung fest, die beim Schärfen der zusammengeführten lokalen Lautstärke geschätzt wird. Berechnen Sie die lokale Auflösung des Volumens.

Öffnen Sie als Nächstes den lokalen 3D-Filter. Legen Sie die geschärfte, ungefilterte lokale Lautstärke als Eingabe fest. Wählen Sie die Karte mit lokaler Auflösung und die 3D-Maske mit weichen Kanten aus.

Wenden Sie den Filter für die lokale Auflösung auf das geschärfte Volumen an, um das endgültige 3D-Modell zu erstellen. Öffnen Sie die resultierende Volumen- und Ortsauflösungskarte in Chimera. Starten Sie das Werkzeug Oberflächenfarbe, und wählen Sie das Volumen aus dem Menü sowie die Option zum Einfärben der Oberfläche entsprechend der lokalen Auflösung.

Der Toxinkomplex TcdA1 wurde mittels Kryomikroskopie abgebildet. Alle Bilder zeigten deutlich erkennbare Einzelteilchen und Thon-Ringe, die bis zu einer Auflösung von besser als vier Ångström im Leistungsspektrum reichten. Die Partikel wurden mit e2boxer ausgewählt und dann in einen Bildstapel extrahiert.

Zweidimensionale Klassendurchschnitte wurden durch iteratives stabiles Alignment und Clustering (ISAC) generiert. Diese Klassendurchschnitte wurden verwendet, um ein reproduzierbares 3D-Modell mit RVIPER zu berechnen. Dieses Modell stimmte gut mit der zuvor gelösten Kristallstruktur von TcdA1 überein.

Die automatische 3D-Verfeinerung dieses Modells mit MERIDIEN erzeugte eine nahezu atomare Auflösung map. 3D die Variabilitätsanalyse zeigte eine lokalisierte Flexibilität der Histidin-markierten N-terminalen Region, der Rezeptor-Bindungsdomänen und der TcB-Bindungsdomäne. Es wurden Berechnungen mit lokaler Auflösung durchgeführt.

Das geschärfte Modell wurde lokal gefiltert und eine Farbskala entsprechend der lokalen Auflösung angewendet, die eine topologische Übereinstimmung zwischen Bereichen mit hoher Variabilität und Bereichen mit niedriger Auflösung zeigt. Die endgültige Kryo-EM-Struktur von TcdA1 mit einer Auflösung von 3,5 Angström zeigte für die meisten Seitenketten klare Dichten. Eine Dichtekarte mit diesem Detaillierungsgrad kann für die Erstellung von De-novo-Atommodellen weiter verwendet werden.

Mit diesem Ansatz kann innerhalb von Stunden oder wenigen Tagen eine Struktur mit nahezu atomarer Auflösung erhalten werden, ohne dass strukturelle Informationen a priori erforderlich sind. Verwenden Sie bei diesem Verfahren nur qualitativ hochwertige Daten, und überprüfen Sie die Zwischenergebnisse. Die Zusammensetzung und strukturelle Heterogenität der Kryo-EM-Probe könnte ein limitierender Faktor für das Erreichen einer nahezu atomaren Auflösung sein.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie SPHIRE für die Strukturbestimmung in der Kryo-EM verwenden können. Wie Sie gesehen haben, ermöglichen Ihnen die in SPHIRE enthaltenen Clustering-Routinen nicht nur die Lösung der Struktur des interessierenden Proteins, sondern auch die Untersuchung der Konformationsdynamik und liefern entscheidende mechanistische Einblicke in komplexe molekulare Mechanismen.