Name: Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie eine miniaturisierte Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie ohne Papierblottingschritte. Diese Methode ermöglicht die Analyse empfindlicher Proteine aus Nanolitervolumina und einzelnen Zellen.

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Die Autoren möchte die Werkstatt das Biozentrum der Universität Basel für ihre Unterstützung, S. A. Müller für kritische Diskussionen und lesen sorgfältig das Manuskript, A. Fecteau-LeFebvre für technische Hilfe mit EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann für Membranprotein test-Proben (alle vom C-CINA, Biozentrum, Universität Basel) und A. Engel, emeritierter Universität Basel für seine inspirierende Gespräche. Proben wurden freundlicherweise von s. Ringler, M.-A. Mahi, und T. Schwede (Biozentrum, Universität Basel), p. Leiman (Labor für Strukturbiologie und Biophysik, EPFL) und R. Diaz-d ' Avalos (Structural Biology Center New York, USA). Das Projekt wurde von der Swiss Nanoscience Institute (SNI, Projekt P1401, Aargau Projekt MiPIS) und dem Schweizerischen Nationalfonds (SNF, Projekt 200021_162521) unterstützt.

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Die Autoren Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg und Thomas Braun erklären die folgende konkurrierende finanzielle Interesse: das CryoWriter-Konzept ist Teil der Patentanmeldung PCT / EP2015/065398 und EP16194230.

Das Instrument "CryoWriter" und die Protokolle erforderlich zur Vorbereitung Probe Netze für NS und Cryo-EM aus nL Größe insgesamt Probenvolumen und vollständig zu vermeiden den klassischen Papier-Blot-Schritt werden vorgestellt. Mikrofluidische Prinzipien und einem mikromechanischen System werden in der CryoWriter zu diesem Zweck kombiniert.
Unsere Erfahrung zeigt, dass wenn die miniaturisierten in diesem Manuskript vorgestellten Methoden verwendet werden, Parameterraum für EM-Grid Vorbereitung größer als bei klassischen Methoden und unter enger Kontrolle des Benutzers. Wichtig ist, macht die erhöhte Reproduzierbarkeit erreicht es möglich, vor dem Bildschirm mit Probe-Puffersystem, ergänzt mit einem leicht verfügbaren Test Protein, um die optimalen Parameter zu bestimmen, bevor das eigentliche Experiment durchgeführt wird. Dies hält Verzehr die Stichprobe von Interesse auf ein absolutes minimum und ist sehr zu empfehlen. Wichtige Schritte für beide NS und Cryo-EM Raster Vorbereitung sind: (i) grundieren des Pumpsystems; für Sub-Nanoliter Volumen Dosieren, muss System-Flüssigkeit (Wasser) entgast und bubble-kostenlos. (Ii) genaue Steuerung der Glimmentladung oder Plasma Reinigung Schritt; die Oberflächeneigenschaften des Rasters EM sind entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse. (Iii) Probe Klimaanlage; der Zeitaufwand für die Konditionierung, z. B.mit NS, hängt von der Puffertyp, Salzgehalt und Konzentration (Abbildung 3) sowie auf die Düsengeometrie der Microcapillary24. (iv) Verdampfungsraten für NS-EM-Vorbereitungen auf eine quantitative EM; die Wirkung von Kaffee-Ring kann verbieten, die Quantitative Analyse der NS-EM-Vorbereitungen und muss unterdrückt werden, indem langsam Verdunstungsraten gesteuert durch die DP-Bühne.
Verschiedene Aspekte der vorgestellten Raster Vorbereitung Methoden sind frei kombinierbar, so dass die Entwicklung der vielseitigen Protokolle für bestimmte Proben. Typische Beispiele wären die Entfernung eines Stoffes, die hochauflösende EM, z.B., Glycerin, durch eine Klimaanlage Schritt vor dem Gitter Vorbereitung für Cryo-EM verhindert; die Einführung der Mediator Moleküle, wie Liganden durch Konditionierung vor die Gittern bereit sind; oder die Untersuchung der einzelnen Zelle lysate von NS oder Cryo-EM (Abbildung 6).
Die Verwendung von Mikrofluidik und minimales Beispiel Beträge in den vorgestellten Methoden wird Papier Löschpapier Schritte vollständig entfernt. Dies ist ein großer Vorteil weil Papier Löschpapier eine harte Behandlung für Proteine ist, potenziell Kontamination der Probe mit unerwünschten Ionen und von Natur aus führt zu massiven Probenverlust. Auf der anderen Seite werden Effekte möglicherweise verursacht durch die Luft-Wasser-Grenzfläche die dünne Probe Film gebildet, wenn Cryo-EM-Proben in klassischer Weise zubereitet werden nicht vermieden, wenn die CryoWriter verwendet wird. Gitter für Cryo-EM können mit einer weniger als 0,2 s Wartezeit zwischen Beispielanwendung und Verglasung (Daten nicht gezeigt) vorbereitet werden. Jedoch wie Proteine durch Diffusion ein paar Zehntel Nanometer in wenigen Nanosekunden Reisen, gibt es immer noch genug Zeit für sie mit der Luft-Wasser-Grenzfläche von 100 nm dicken Probe Film mehrmals zu kollidieren. Jedoch die Menge an Proteinen, die das Festhalten an der Luft-Wasser-Grenzfläche durch diese kurze Zeitlücken deutlich gesenkt werden könnte und möglicherweise verhindern, dass Protein-Denaturierung oder partikelausrichtung eingeschränkt. Ein weiterer vielversprechender Ansatz, der sensible Proteine aus der Luft-Wasser-Grenzfläche schützen könnte soll die Probe Film von niedermolekularen oberflächenaktive Stoffe abdecken. Diese Verbindungen konnten schnell durch eine Klimaanlage-Stufe in der CryoWriter vor dem Gitter Vorbereitung eingeführt werden. Die hohe Oberflächen-Volumen-Verhältnis von mikrofluidischen Systemen ist eine weitere Einschränkung der CryoWriter als Probe kann möglicherweise verloren gehen durch unspezifische Adsorption an die Microcapillary Oberfläche und Quantitative Analyse von Partikelzählung zu stören. Das Problem richtet sich auf zwei Arten: Erstens die Probe nicht reisen große Entfernungen innerhalb der Microcapillary. In der Tat bleibt das Probenvolumen Nanoliter an der Kapillare Spitze in der Verarbeitung. Zweitens die Oberfläche zum Volumen-Verhältnis ist weiter reduziert, indem mikrokapillaren mit relativ großen inneren Durchmesser, z.B., 180 µm. Dritter, die Oberflächen der mikrokapillaren können leicht passiviert werden, falls erforderlich, z. B., indem Sie sie behandeln mit handelsüblichen Polylysin Ethanol Glykole (PLL-PEG).
Die hochauflösende Analyse von Proteinen durch die EM Einzelkorn-Ansatz erfordert nur 100.000 bis einige Millionen Bilder der einzelnen eiweißteilchen. Dies bedeutet, dass mikrofluidischen Techniken genug Protein-komplexe für die strukturelle Untersuchung bereitstellen können. Eine miniaturisierte Immuno-Niederschlag-Methode für die schnelle Lokalisierung der Proteinkomplexe (ca. 1 Stunde) von minimalen Zelle Mengen (ca. 40.000 Zellen) wurde früher28entwickelt. Diese Methode wird jetzt direkt mit der miniaturisierten Probe Vorbereitungsphase von der CryoWriter verknüpft werden. Das Endziel ist eine integrierte mikrofluidische Pipeline für ultraschnelle Protein isoliert und Cryo-EM Raster Vorbereitung zu entwickeln, die weniger als zwei Stunden in allen erfordert. Darüber hinaus beweist Abbildung 6, die winzige Menge und das Volumen des Materials für die Probenvorbereitung und die fast verlustfreie Klimaanlage und Raster Vorbereitung Verfahren mit Hilfe der CryoWriter benötigt machen Sie es möglich, das Protein zu studieren komplexe einzelner Zellen. Zusammen, bilden die miniaturisierte Immuno-Niederschlag-Methode und die CryoWriter die Grundlage für eine neue Proteomik-Methode namens "Einzelzelle visuelle Proteomics", wie wir vor kurzem für Hitzeschock Experimente24gezeigt. Daten-Analyse-Algorithmen ausgerichtet auf die Analyse der "visuellen Proteomics" Bilder werden derzeit getestet.

Hard- und Software für die strukturelle Analyse von Protein-komplexe durch Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) hat in den letzten Jahren massiv vorangetrieben. Die vorgenommenen Verbesserungen ebnete den Weg für eine "Entschließung Revolution"1,2 und Strukturforschung, grundlegend verändert. Die Revolution begann mit dem Aufkommen der Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM)3,4, so dass die Vorbereitung von biologischen Proben unter physiologischen Bedingungen Strahlenempfindlichkeit abnimmt und verhindert Probe verdampfen im Hochvakuum der Getriebe-Elektronenmikroskop-5. In den folgenden Jahren stieg die inkrementellen Fortschritts allmählich die erzielbare Auflösung. Unter diesen Neuerungen waren die Anwendung der Feldemission Gewehren6,7, und in jüngerer Zeit, verbessert Daten-Analyse-Algorithmen, z. B. maximum-Likelihood-Methoden-8,-9. Direkte Elektron Detektors Kameras10,11,12,13, Filmmodus Bildgebung und der zugehörigen Software Entwicklungen14,15, 16 , 17, zur Verfügung gestellt des endgültigen Durchbruch zu atomarer Auflösung für biologische Proben vorgeschriebenen Einzelkorn Analyse (für eine Rezension siehe Cheng, Grigorieff, Et al. 18). die Bedeutung der Cryo-EM wurde vor kurzem durch die Verleihung des Nobelpreises für Chemie zu drei von den Pionieren erkannt.
Zu eine biologische Probe durch TEM image, die Methode verwendet, um das EM-Raster mit Probe (nachfolgend als "Raster Vorbereitung" genannt) zu laden muss sicherstellen, dass die daraus resultierenden Probe-Schicht (i) dünn genug ist (&lt; 100 nm), vermeiden umfangreiche Lärm durch unelastische oder multiplizieren verstreut Elektronen, (Ii) hält die Hochvakuum des Elektronenmikroskops, und (Iii) die Biomoleküle vor Strahlenschäden schützt. Zwei Methoden werden verwendet, um diese Voraussetzungen zu erfüllen: Negative Fleck(NS)19,20 Verfahren (Abb. 1A) adsorbieren, die Probe zu einem dünnen Carbon-Film, Biomoleküle in amorphen Schwermetall einbetten und dann ermöglichen Sie die Montage an Luft trocknen. Dies ist einfach und schnell, und die geladenen EM-Raster (nachfolgend als "Probe Grids" genannt) sind einfach zu speichern und kann für längere Zeit aufbewahrt werden (in der Regel Jahre). In TEM die Vorbereitungen ausstellen, hohen Kontrast aufgrund der NS und Elektron-Dosen als Cryo-Präparate zu tolerieren, aber die Auflösung beschränkt sich auf ca. 20 Å Cryo-EM-Verfahren, die (Abbildung 1B) beschäftigen löchrigen Kohlenstoff unterstützt. Eine dünne Folie aus der Beispiellösung erstreckte sich über die Löcher und das EM-Raster stürzte sich in ein Cryogen, in der Regel flüssiges Ethan zu schnell abkühlen unter-150 ° C. Das Ergebnis ist eine amorphe, verglast, 50 bis 100 nm dicken Film der Lösung in die Löcher der Unterstützung. Dünne, amorphe Film widersteht das Hochvakuum im Elektronenmikroskop und im Idealfall, biologische Strukturen in ihrem nativen Zustand bewahrt. Die Verfahren kann biologische Proben in hoher Auflösung abgebildet werden. Jedoch sind Sample-Gitters bei Temperaturen unter-150 ° C jederzeit zur Entglasung vermeiden aufzubewahren. Es kann mit einer relativ hohen Elektron Dosis aufgrund der niedrigen Temperatur, aber der Kontrast abgebildet und Signal-Rausch-Verhältnis ist dennoch gering. Daher durchschnittlich Techniken werden eingesetzt, um den Kontrast zu erhöhen und, sofern die Probe aus verschiedenen Blickwinkeln abgebildet wird, eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Karte rekonstruiert werden kann. Die am häufigsten verwendeten und sehr erfolgreiche Methode zur 3D-Rekonstruktion ab sofort ist der Einzelkorn-Ansatz. Eine aktuelle Übersicht finden Sie unter Cheng bei al.18.
Negativen Fleck TEM (NS-EM) ist wichtig für das Screening und Qualitätskontrolle, bei hohem Kontrast erforderlich ist oder wenn nur begrenzte Mengen an Probe zur Verfügung stehen (Adsorption an den Kohlenstoff-Film im Allgemeinen konzentriert sich die Probe). Einzelkorn Cryo-EM ist die Gold-Standard-Methode, wenn hochauflösende 3D Rekonstruktionen von der Proteinstruktur angestrebt werden.
<img alt="Diagramm der Mikromanipulationstechniken; Umfasst Tröpfchenabscheidung, Extraktion von Nanostrukturen und Transfer." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Prinzipien der TEM Raster Vorbereitung und Vergleich zwischen klassischer (Bereich A, B) und einem mikrofluidischen Ansatz (Feld C, D). A) klassische NS-EM Raster Vorbereitung: über 3 µL der Probe sind von hand auf eine EM-Gitter abgedeckt mit einer kontinuierlichen Carbon Folie (nachfolgend als eine "NS-EM Grid" genannt) pipettiert (i). Nach der Inkubation für ca. 10 s, Filterpapier wird verwendet, um entfernt die überschüssige Flüssigkeit von der Seite (Ii), verlassen die adsorbierten Biomoleküle in einem dünnen Wasserfilm zu beflecken. Anschließend wird das Protein in einer Heavy-Metal-Salz-Lösung, z. B., 2 % Uranyl Acetat, für 20 inkubiert s (Iii), und wieder die Flüssigkeit wird durch Löschpapier seitlich mit Filterpapier (iv) entfernt. Schließlich bleibt das EM-Grid an der Luft trocknen. B) klassische Cryo-EM Raster Vorbereitung: über 3 µL der Probe durch einen Zeiger auf eine löchrige Carbon Folie pipettiert werden. Um eine dünne Probe Film zu bilden, wird die überschüssige Flüssigkeit von Papier-Blot-Gesicht-on aus ein- oder beidseitig (Ii) entfernt. Schließlich ist das Netz rasch in flüssigem Ethan für Verglasung (Iii) gestürzt. C) NS-EM Raster Vorbereitung mit dem CryoWriter-Setup: A 5 nL Volumen wird aus dem Probe-bestand mit einer Microcapillary (i) abgesaugt. Für Probe Konditionierung taucht die Microcapillary Spitze in die Klimaanlage-Lösung, z.B.2 % Ammoniumacetat. Ionen und kleine Moleküle werden durch Diffusion (Ii) ausgetauscht. Beachten Sie, dass die Abmessungen der Microcapillary sicherzustellen, dass der gesamte Prozess Diffusion angetrieben ist. Proteine haben viel geringere Verbreitung Konstanten als Salzionen und sind nicht wesentlich24verloren. Schließlich ist die Probe verzichtet auf das Gitter und (Iii) trocknen. D) Prinzipien der Cryo-EM Raster Vorbereitung mit der CryoWriter-basierte Methode: eine EM-Raster mit einer löchrigen Carbon Folie abgedeckt ist auf der Oberfläche einer temperaturgesteuerten Plattform platziert und von Pinzette gehalten. Die Temperatur der Plattform wird mit einem Versatz von der Taupunkt-Temperatur der Grid-Umgebung gesteuert. Das Raster wird bezogen auf die Microcapillary mit der Probe verschoben und die Microcapillary wird abgesenkt, bis es wenige Mikrometer über dem Raster ist. Anschließend sind wenige nanoliter Probe daraus verzichtet, während die Bühne spiralförmig bewegt wird; überschüssige Flüssigkeit wird erneut abgesaugt (i). Nach EM Raster Grundierung die Microcapillary wird zurückgezogen und das Gitter bleibt auf dem kontrollierten Bahnsteig Temperatur (nachfolgend als Taupunkt (DP) Bühne genannt) für eine kurze Zeit erlauben eine kontrollierte Menge der Probe zu verdampfen. Für Sprung Einfrieren ist das Gitter schnell zurückgezogen von der Bühne mit der Pinzette (Ii), umgedreht um 90° in die vertikale Position und stürzte in ein Cryogen-Bad (Iii) (nachfolgend als "Pick-und-Sprung" Mechanismus genannt). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Leider haben die Gitter Vorbereitung Methoden für NS und Cryo-EM nicht wesentlich verbessert, da sie erfunden wurden. Aktuelle Nachteile sind der hohe Sample-Verbrauch (ca. 3 µL 1 mg/mL Protein) und die große Menge der Probe (&gt; 99 %) verloren (Abb. 1A, B). Darüber hinaus ist die klassische Methode verwendet, um Netze für Cryo-EM vorbereiten eine harte Prozedur für Proteine: zuerst, es beinhaltet einen umfangreichen Gesicht-auf Papier-Blot-Schritt (Abbildung 1B, Ii), und zweitens ist das Protein der Luft-Wasser-Grenzfläche ausgesetzt für eine erhebliche Menge an Zeit21. Hier eine alternative Methode zum Beispiel Vorklimatisierung Raster Probenvorbereitung und Nachbearbeitung (Raster zu trocknen oder Verglasung) für NS-EM (Abbildung 1C) oder Cryo-EM (Abbildung 1D) dargestellt. Die hauseigene gebaute Setup, genannt "CryoWriter", verwendet miniaturisierte Beispiel Umgang mit Technologie und mikrofluidischen Prinzipien zu Aspirieren, Zustand und verzichten Probe, Vermeidung von Papier Löschpapier komplett und bieten alternative Methoden, um dünne Proben für Cryo-EM. Es deutlich reduziert den Verbrauch der Probe und verbessert Benutzersteuerelement über Probenvorbereitung als Ganzes. Darüber hinaus ermöglicht die Methode neuartige experimentelle Anwendungen; wie die Herstellung von isolierten biologischen Komponenten einzelner Zellen in ein Konzept namens "Einzelzelle visuelle Proteomics"22,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Liquid Handling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapillarspitze</td><td>Neues Objektiv</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 & micro; m Spitzen-ID, 100 &micro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 & micro; m Spitzen-ID, 150 &micro; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td>Leithülse</td><td>Neues Objektiv</td><td>CONGAS-1&nbsp;</td><td>Leitfähiges Elastomer für HV-Kontakt, 12" lang</td></tr><tr><td>Quarzglasschlauch</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Standard FS Schlauch, 150 & micro; m ID, 363 & Mikro; m AD, 5 Meter</td></tr><tr><td>PressFit Steckverbinder</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. PressFit-Verbinder 0,25 bis 0,25 mm ID, Stück 25&nbsp;</td></tr><tr><td>Spritze 10 & Mikro; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Luer-Spitze (Nadel nicht im Lieferumfang enthalten)&nbsp;</td></tr><tr><td>Spritzenpumpenregler</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS Regler</td></tr><tr><td>Spritzenpumpen-Dosiereinheit</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS Dosiereinheit</td></tr><tr><td><stark>Temperaturregelung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taupunktsensor</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>Feuchte-/Temperatursensor, Taupunktberechnung, USB und embedded DLL</td></tr><tr><td>Temperatur Sensor</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Oberflächenmontierbarer Temperatursensor Pt1000</td></tr><tr><td>Peltier-Regler</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp;</td><td>PID-Temperaturregler zur Ansteuerung von Peltier-getriebenen Systemen mit konstantem Spannungsausgang</td></tr><tr><td>Peltier-Element</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Wasserkühlungsblock</td><td></td> <td>-</td> <td>Wasserkühlblock für 40x40 mm Peltier-Element, Kupferbasis</td></tr><tr><td>Wasserpumpe</td><td>Digitec.ch</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 Dual 5,25 Bay Reservoirpumpe Schwarz V4</td></tr><tr><td>Wasserwärmetauscherblock</td><td></td> <td>-</td> <td>Wasserwärmetauscherblock mit 2 Lüftern zum Abkühlen des zirkulierenden Wassers</td></tr><tr><td>Kleine Wasserkühler</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX RAM Kupfer Edition 2 Stück</td></tr><tr><td>Kleine Peltier-Elemente</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3,4 A 8,1 W 3,8 V 74 &deg; C, 2 Stk</td></tr><tr><td><stark>Mechanik</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lineartisch Z-Achse</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Hochlast-Präzisions-Translationstisch, 50 mm Verfahrweg, Gleichstrommotor</td></tr><tr><td>Tischregler</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury Servo Controller</td></tr><tr><td>Mikroskop xy-Achsen-Tisch</td><td>Vorherige</td><td>wissenschaftliche H117EIL5</td><td>Motorisierter Tisch für Zeiss Axiovert 200 Inverses Mikroskop</td></tr><tr><td>Kleine Permanentmagnete</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Stabmagnet & Oslash; 5 mm, Höhe 8,47 mm, Neodym, N45, vernickelt, pk. 10</td></tr><tr><td>Kleiner Elektromagnet</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Elektromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Controller Elektromagnet</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Elektromagnet Steuerung Leiterplatte</td></tr><tr><td>Magnetnabe</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini Pinzette</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Typ 5 mini, superdünne Spitzen</td></tr><tr><td>Diverse optomechanische Teile</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>diverse mechanische Teile</td><td>Werkstatt Biozentrum, Universität Basel-Sonderanfertigungen</td> <td>Adapterplatten, Halterungen, etc. siehe angehängte CAD-Dateien</td><td></td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserdiode</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm Laserdiodenmodul 2,5 mW</td></tr><tr><td>Photodetektor</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>EM Grids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&trade; Siliziumnitrid-Membranen für TEM, Packung mit 5</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1,2/1,3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp; SIGMA</td><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negativfärbung auf Vanadiumbasis</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negativfärbung Wolframbasis</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>Das openBEB 2 Framework ist auf Anfrage erhältlich, Version 3 kann</td></tr><tr><td>heruntergeladen werden CryoWriter Steuerung Software (openBEB-Plugin)</td><td></td><td>Auf Anfrage erhältlich, für Treibersoftware von Drittanbietern können zusätzliche Gebühren anfallen.</td><td></td></tr></tbody></table>

miniaturisierte probenvorbereitung für transmissions-elektronenmikroskopie

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritt wird Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) zunehmend eine Standardmethode für die strukturelle Analyse von Protein-komplexe in atomarer Auflösung. Protein Isolationstechniken und probenvorbereitungsmethoden für EM bleiben jedoch einen Engpass. Eine relativ kleine Anzahl (100.000 auf ein paar Millionen) der einzelnen eiweißteilchen müssen für die hochauflösende Analyse von Proteinen durch die einzelnen Partikel EM Ansatz, Herstellung miniaturisierter Probe Umgang mit Techniken und Prinzipien mikrofluidischen abgebildet werden machbar sind.
Eine miniaturisierte, beflecken-papierfrei EM Raster Vorbereitung Methode zur Probe Vorkonditionierung, EM Raster Grundierung und Post-Processing, die verbraucht nur Nanoliter-Volumen der Probe wird vorgestellt. Die Methode verwendet eine Dosieranlage mit Sub-Nanoliter Präzision, Kontrolle der Flüssigkeitsaufnahme und EM Raster Priming, eine Plattform, die Raster-Temperatur, wodurch die Bestimmung der relativen Luftfeuchtigkeit über das EM-Raster und einen Pick-und-Sprung-Mechanismus zur Probe zu kontrollieren Verglasung. Für Cryo-EM ein EM-Gitter befindet sich auf der Bühne mit kontrollierter Temperatur und die Probe wird in einer Kapillare abgesaugt. Die Kapillare Spitze befindet sich in der Nähe der Oberfläche, das Gitter wird mit der Probe geladen und Exzess ist neu in der Microcapillary abgesaugt. Anschließend wird die Probe Film stabilisiert und leicht verdünnt durch kontrollierte Wasserverdampfung durch den Versatz der Plattform im Vergleich zu den Taupunkt Temperatur geregelt. Zu einem bestimmten Zeitpunkt wird der Pick-Sprung-Mechanismus ausgelöst, Grundierte EM Netz in flüssigem Ethan für Probe-Verglasung schnell zu übertragen. Alternativ stehen Probe-Konditionierung Nanoliter große Probenvolumina auf negative Fleck (NS) EM vorzubereiten.
Die Methoden stark Probe Verbrauch reduzieren und vermeiden Ansätze potenziell schädliche Proteine, wie z. B. das Filterpapier Beflecken in konventionellen Methoden verwendet. Darüber hinaus ermöglicht die winzige Menge der Probe erforderlich neue experimentelle Strategien, wie schnelle Probe Konditionierung, Kombination mit einzelligen Lyse für "visuelle Proteomics" oder "Verlustfrei" total Probenvorbereitung für die Quantitative Analyse der komplexen Proben.

Instrument und Verfahren zur Herstellung von Nanoliter große Probenvolumina für Transmissions-Elektronenmikroskopie wird vorgestellt. Papier-Blot-Schritte sind nicht erforderlich, wodurch die nachteiligen Folgen, die dies für Proteine, deutlich reduziert Probenverlust und ermöglicht die Analyse der einzelnen Zelle lysate für visuelle Proteomics haben kann.

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Strukturbiologie zu beantworten, wie z. B. die Herstellung empfindlicher Proteine, bei denen eine begrenzte Menge an Protein verfügbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass im Vergleich zu herkömmlichen Probenvorbereitungsmethoden nur kleinste Probenmengen erforderlich sind und dass kein harter Papiertupfschritt erforderlich ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Einzelzellanalyse mittels visueller Proteomik oder die Diagnose von proteinbedingten Krankheiten.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir die Technologie zur Verfügung hatten, um hochauflösende Strukturen mit nur etwa 100.000 einzelnen Teilchen zu lösen. Bereiten Sie zunächst die Probe vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Bauen Sie als Nächstes den Ethanbecher, den Kryobox-Halter und die Spinne zusammen.Und füllen Sie den Kryobehälter bis zum Rand mit flüssigem Stickstoff. Nach ein paar Minuten ist der Becher kühl und frei von flüssigem Stickstoff. Öffnen Sie dann die Ethangasflasche und lassen Sie das Gas langsam in den Ethanbecher strömen.Lassen Sie den Becher mit flüssigem Ethan füllen, bis der Füllstand zwei bis drei Millimeter unter der Oberseite liegt. Dies dauert einige Minuten und erfordert etwa fünf Milliliter flüssiges Ethan. Entfernen Sie die Spinne, setzen Sie den Polystyroldeckel darauf und setzen Sie den Kryobehälter auf die Halterung im Kryo-Writer.Fassen Sie das glühentladene EM-Gitter mit der Kryo-Schreibpinzette, verknoten Sie die Pinzette auf dem Elektromagneten und schrauben Sie den Mikromanipulator fest, um das Gitter flach auf dem Tisch auszurichten, mit der Kohlefilmseite nach oben. Zurück in der Software doppelklicken Sie auf grid_save. Stellen Sie dann die Position der Mikrokapillare so ein, dass sich die Spitze etwa 10 Mikrometer über der Gitteroberfläche befindet.Achten Sie darauf, dass sich die Mikrokapillare frei über das Gitter bewegen kann, ohne sie irgendwo zu berühren. Und ziehen Sie die Mikrokapillare bei Bedarf einige Mikrometer zurück. Bringen Sie es dann wieder in die Mitte des Rasters und speichern Sie die neue Position als Raster.Bewegen Sie die Mikrokapillare zurück in die Ausgangsposition. Spülen Sie anschließend die Mikrokapillare mit einigen Dutzend Nanolitern Systemflüssigkeit und verwenden Sie fusselfreies Gewebe, um Tropfen aus der Mikrokapillare zu entfernen. Wenn nun alles vorbereitet ist, starten Sie das Makroskript.Das Makro bewegt sich zunächst in Position und gibt fünf Nanoliter Systemflüssigkeit ab, um alle Luftblasen an der Spitze zu entfernen, und bewegt sich dann in die Probenposition. Als nächstes aspiriert es 65 Nanoliter Probe und injiziert dann fünf Nanoliter zurück in das Probenröhrchen. Dies berücksichtigt System-Backlash und ermöglicht ein synchronisiertes Schreiben.Nachdem es sich in die Gitterposition bewegt hat, initiiert es ein Schreibmuster, das dazu führt, dass sich die Mikrokapillare über das Gitter bewegt und gleichzeitig 45 Nanoliter Probe abgibt. Dann bewegt er die Mikrokapillare zurück in die Mitte des Gitters, senkt sie um weitere 10 Mikrometer ab und entzieht überschüssige Probenflüssigkeit. Schließlich zieht das Makro die Mikrokapillare zurück und schaltet den Elektromagneten aus, wodurch der Tauchgefriermechanismus eingeleitet wird.Sobald Sie sich vom Magneten gelöst haben, lösen Sie den Magnetadapter vorsichtig vom Kolben und übertragen Sie das Gitter schnell aus dem Ethanbecher in den Kryobehälter, in dem sich die Kryobox befindet, und legen Sie das Gitter in einen freien Schlitz. Bereiten Sie zunächst die Zellen vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, und montieren Sie den Indiumzinnoxid-Objektträger auf den Mikroskopeinsatz. Verwenden Sie zwei Schrauben, um die Rutsche auf dem Aluminiumeinsatz zu befestigen und den elektrischen Kontakt zwischen der Indiumzinnoxidbeschichtung der Schiene und dem elektrisch geerdeten Aluminiumrahmen sicherzustellen.Nehmen Sie dann das Zellkulturmedium aus der Vertiefung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 300 Mikrolitern Elektroporationspuffer. Bewahren Sie die Zellen nach der letzten Wäsche im Elektroporationspuffer auf. Platzieren Sie als Nächstes den Aluminiumeinsatz, der den Indiumzinnoxid-Objektträger in der Inkubatorstufe der Lebendzelle hält, auf dem Setup.Lokalisieren Sie die Zellkultur mit dem Mikroskop und wählen Sie einen Bereich ohne Zellen. Nähern Sie sich der Mikrokapillarspitze auf der Objektträgeroberfläche und berühren Sie sie sanft. Ziehen Sie dann die Spitze in 100 Mikrometern zurück und speichern Sie die Position als Zellen.Verlassen Sie nun schnell die Zellkultur und spülen Sie die Mikrokapillarspitze mit einigen Dutzend Nanolitern Systemflüssigkeit aus, um sie dann wieder in die Zellkultur zu geben. Geben Sie während des Eintauchens einige Nanoliter in die PDMS-Vertiefung ab, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen an der Spitze eingeschlossen werden. Doppelklicken Sie auf die Position der Zelle und nähern Sie sich vorsichtig der Oberfläche des Indiumzinnoxid-Objektträgers und ziehen Sie die Spitze bei Kontakt um 10 Mikrometer zurück.Wählen Sie an dieser Stelle eine nahegelegene Zelle für die Lyse aus und platzieren Sie die Spitze der Mikrokapillare über der Zielzelle. Starten Sie dann das Makroskript für die Einzelzelllyse.Nach dem Start fragt das Skript nach einer Position, an die die Mikrokapillare verschoben werden soll, nachdem eine Zelle erfolgreich lysiert wurde. Geben Sie die gewünschte Position, z.B. Raster, für das EM-Raster ein. Das Makro fährt dann ohne Benutzereingriff fort und bewegt zunächst den Tisch des Mikroskops in der Zellkultur um 100 Mikrometer nach links, wo es einen Schnappschuss der Zielzelle macht.Dann werden 15 Nanoliter doppelt destilliertes Wasser aus dem Mikrokapillarrohr abgegeben, wodurch der Puffer mit hohem Salzgehalt verdrängt und verdünnt wird, wodurch osmotischer Druck auf die Zelle ausgeübt wird. Als Nächstes bewegt sich der Tisch zurück, um die Spitze wieder über der Zielzelle zu positionieren. Dort wird ein vordefinierter Spannungsstoß angelegt, und nach 500 Millisekunden beginnt das Pumpensystem, drei Nanoliter Probe mit einer Durchflussrate von zwei Mikrolitern pro Minute anzusaugen.Schließlich wandert der Tisch wieder nach links, wodurch die Zelle inspiziert werden kann. Es erscheint ein Fenster, in dem Sie nach Benutzereingaben gefragt werden. Wenn die Zelle erfolgreich war, geben Sie yes ein, um einen Snapshot der lysierten Zelle zu erstellen.Anschließend bewegt sich die Mikrokapillare an die Endo-Stelle, wo sie in die Reservoirflüssigkeit eingetaucht ist. Lassen Sie die Mikrokapillare je nach Düsengeometrie acht bis 12 Minuten eingetaucht. Geben Sie anschließend fünf Nanoliter des konditionierten Zelllysats auf das Gitter.Entnehmen Sie die Mikrokapillare und lassen Sie die konditionierte Probe langsam auf einem Taupunkttisch trocknen. Zum Schluss nimmst du das Gitter von der Bühne und lagerst es bei Raumtemperatur in einer Gitterbox. Hier sind typische Kryobilder von gefrorenen Proben mit dem beschriebenen CryoWriter-Setup zu sehen.In der Rasterübersicht ist die Peripherie des Glaseises deutlich zu erkennen. Bei näherer Untersuchung eines Gitterschlitzes mit dem löchrigen Kohlenstofffilm, der Glaseis enthält, können weiße Löcher gefunden werden, was darauf hindeutet, dass nicht alle Löcher mit Probenpuffer gefüllt waren. In einer der Proben mit Kohlenstofflöchern ist der Schwanz eines Bakteriophagen detailliert zu erkennen.Mit dem CryoWriter, der für die visuelle Einzelzellproteomik eingerichtet ist, kann man Dinge wie einzelne Proteine sehen, zum Beispiel filamentöses Aktin und Membranpflaster mit angehängten Proteinen. Das Bild, das Sie in Tafel 6b sehen können, ist negativ gefärbt mit einem 2%-Negativfleck, der auf einer Organotungstenverbindung basiert. Panel c zeigt ein einzelliges Lysat, das für die Kryo-EM vorbereitet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie negative Färbe- oder Kryo-EM-Gitter aus Nanoliter-Gesamtvolumina von Proteinproben oder Einzelzellextrakten herstellen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Ethan und Stickstoff äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen einer Schutzbrille und eines Laborkittels, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cryo Elektronenmikroskope, entweder Scanning (SEM) oder Transmission (TEM), werden häufig für die Charakterisierung von biologischen Proben oder anderen Materialien mit einem hohen Wassergehalt 1 verwendet wird. Eine SEM / Focused Ion Beam (FIB) wird verwendet, um Merkmale von Interesse in Proben zu identifizieren und extrahieren eine dünne, elektronentransparenten Lamellen für die Übertragung auf eine Kryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

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Optimierung der Probenvorbereitung für die kryogene Elektronenmikroskopie

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Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

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