Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Strukturbiologie zu beantworten, wie z. B. die Herstellung empfindlicher Proteine, bei denen eine begrenzte Menge an Protein verfügbar ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass im Vergleich zu herkömmlichen Probenvorbereitungsmethoden nur kleinste Probenmengen erforderlich sind und dass kein harter Papiertupfschritt erforderlich ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Einzelzellanalyse mittels visueller Proteomik oder die Diagnose von proteinbedingten Krankheiten.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir die Technologie zur Verfügung hatten, um hochauflösende Strukturen mit nur etwa 100.000 einzelnen Teilchen zu lösen. Bereiten Sie zunächst die Probe vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Bauen Sie als Nächstes den Ethanbecher, den Kryobox-Halter und die Spinne zusammen.

Und füllen Sie den Kryobehälter bis zum Rand mit flüssigem Stickstoff. Nach ein paar Minuten ist der Becher kühl und frei von flüssigem Stickstoff. Öffnen Sie dann die Ethangasflasche und lassen Sie das Gas langsam in den Ethanbecher strömen.

Lassen Sie den Becher mit flüssigem Ethan füllen, bis der Füllstand zwei bis drei Millimeter unter der Oberseite liegt. Dies dauert einige Minuten und erfordert etwa fünf Milliliter flüssiges Ethan. Entfernen Sie die Spinne, setzen Sie den Polystyroldeckel darauf und setzen Sie den Kryobehälter auf die Halterung im Kryo-Writer.

Fassen Sie das glühentladene EM-Gitter mit der Kryo-Schreibpinzette, verknoten Sie die Pinzette auf dem Elektromagneten und schrauben Sie den Mikromanipulator fest, um das Gitter flach auf dem Tisch auszurichten, mit der Kohlefilmseite nach oben. Zurück in der Software doppelklicken Sie auf grid_save. Stellen Sie dann die Position der Mikrokapillare so ein, dass sich die Spitze etwa 10 Mikrometer über der Gitteroberfläche befindet.

Achten Sie darauf, dass sich die Mikrokapillare frei über das Gitter bewegen kann, ohne sie irgendwo zu berühren. Und ziehen Sie die Mikrokapillare bei Bedarf einige Mikrometer zurück. Bringen Sie es dann wieder in die Mitte des Rasters und speichern Sie die neue Position als Raster.

Bewegen Sie die Mikrokapillare zurück in die Ausgangsposition. Spülen Sie anschließend die Mikrokapillare mit einigen Dutzend Nanolitern Systemflüssigkeit und verwenden Sie fusselfreies Gewebe, um Tropfen aus der Mikrokapillare zu entfernen. Wenn nun alles vorbereitet ist, starten Sie das Makroskript

Das Makro bewegt sich zunächst in Position und gibt fünf Nanoliter Systemflüssigkeit ab, um alle Luftblasen an der Spitze zu entfernen, und bewegt sich dann in die Probenposition. Als nächstes aspiriert es 65 Nanoliter Probe und injiziert dann fünf Nanoliter zurück in das Probenröhrchen. Dies berücksichtigt System-Backlash und ermöglicht ein synchronisiertes Schreiben.

Nachdem es sich in die Gitterposition bewegt hat, initiiert es ein Schreibmuster, das dazu führt, dass sich die Mikrokapillare über das Gitter bewegt und gleichzeitig 45 Nanoliter Probe abgibt. Dann bewegt er die Mikrokapillare zurück in die Mitte des Gitters, senkt sie um weitere 10 Mikrometer ab und entzieht überschüssige Probenflüssigkeit. Schließlich zieht das Makro die Mikrokapillare zurück und schaltet den Elektromagneten aus, wodurch der Tauchgefriermechanismus eingeleitet wird.

Sobald Sie sich vom Magneten gelöst haben, lösen Sie den Magnetadapter vorsichtig vom Kolben und übertragen Sie das Gitter schnell aus dem Ethanbecher in den Kryobehälter, in dem sich die Kryobox befindet, und legen Sie das Gitter in einen freien Schlitz. Bereiten Sie zunächst die Zellen vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, und montieren Sie den Indiumzinnoxid-Objektträger auf den Mikroskopeinsatz. Verwenden Sie zwei Schrauben, um die Rutsche auf dem Aluminiumeinsatz zu befestigen und den elektrischen Kontakt zwischen der Indiumzinnoxidbeschichtung der Schiene und dem elektrisch geerdeten Aluminiumrahmen sicherzustellen.

Nehmen Sie dann das Zellkulturmedium aus der Vertiefung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 300 Mikrolitern Elektroporationspuffer. Bewahren Sie die Zellen nach der letzten Wäsche im Elektroporationspuffer auf. Platzieren Sie als Nächstes den Aluminiumeinsatz, der den Indiumzinnoxid-Objektträger in der Inkubatorstufe der Lebendzelle hält, auf dem Setup.

Lokalisieren Sie die Zellkultur mit dem Mikroskop und wählen Sie einen Bereich ohne Zellen. Nähern Sie sich der Mikrokapillarspitze auf der Objektträgeroberfläche und berühren Sie sie sanft. Ziehen Sie dann die Spitze in 100 Mikrometern zurück und speichern Sie die Position als Zellen.

Verlassen Sie nun schnell die Zellkultur und spülen Sie die Mikrokapillarspitze mit einigen Dutzend Nanolitern Systemflüssigkeit aus, um sie dann wieder in die Zellkultur zu geben. Geben Sie während des Eintauchens einige Nanoliter in die PDMS-Vertiefung ab, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen an der Spitze eingeschlossen werden. Doppelklicken Sie auf die Position der Zelle und nähern Sie sich vorsichtig der Oberfläche des Indiumzinnoxid-Objektträgers und ziehen Sie die Spitze bei Kontakt um 10 Mikrometer zurück.

Wählen Sie an dieser Stelle eine nahegelegene Zelle für die Lyse aus und platzieren Sie die Spitze der Mikrokapillare über der Zielzelle. Starten Sie dann das Makroskript für die Einzelzelllyse.

Nach dem Start fragt das Skript nach einer Position, an die die Mikrokapillare verschoben werden soll, nachdem eine Zelle erfolgreich lysiert wurde. Geben Sie die gewünschte Position, z.B. Raster, für das EM-Raster ein. Das Makro fährt dann ohne Benutzereingriff fort und bewegt zunächst den Tisch des Mikroskops in der Zellkultur um 100 Mikrometer nach links, wo es einen Schnappschuss der Zielzelle macht.

Dann werden 15 Nanoliter doppelt destilliertes Wasser aus dem Mikrokapillarrohr abgegeben, wodurch der Puffer mit hohem Salzgehalt verdrängt und verdünnt wird, wodurch osmotischer Druck auf die Zelle ausgeübt wird. Als Nächstes bewegt sich der Tisch zurück, um die Spitze wieder über der Zielzelle zu positionieren. Dort wird ein vordefinierter Spannungsstoß angelegt, und nach 500 Millisekunden beginnt das Pumpensystem, drei Nanoliter Probe mit einer Durchflussrate von zwei Mikrolitern pro Minute anzusaugen.

Schließlich wandert der Tisch wieder nach links, wodurch die Zelle inspiziert werden kann. Es erscheint ein Fenster, in dem Sie nach Benutzereingaben gefragt werden. Wenn die Zelle erfolgreich war, geben Sie yes ein, um einen Snapshot der lysierten Zelle zu erstellen.

Anschließend bewegt sich die Mikrokapillare an die Endo-Stelle, wo sie in die Reservoirflüssigkeit eingetaucht ist. Lassen Sie die Mikrokapillare je nach Düsengeometrie acht bis 12 Minuten eingetaucht. Geben Sie anschließend fünf Nanoliter des konditionierten Zelllysats auf das Gitter.

Entnehmen Sie die Mikrokapillare und lassen Sie die konditionierte Probe langsam auf einem Taupunkttisch trocknen. Zum Schluss nimmst du das Gitter von der Bühne und lagerst es bei Raumtemperatur in einer Gitterbox. Hier sind typische Kryobilder von gefrorenen Proben mit dem beschriebenen CryoWriter-Setup zu sehen.

In der Rasterübersicht ist die Peripherie des Glaseises deutlich zu erkennen. Bei näherer Untersuchung eines Gitterschlitzes mit dem löchrigen Kohlenstofffilm, der Glaseis enthält, können weiße Löcher gefunden werden, was darauf hindeutet, dass nicht alle Löcher mit Probenpuffer gefüllt waren. In einer der Proben mit Kohlenstofflöchern ist der Schwanz eines Bakteriophagen detailliert zu erkennen.

Mit dem CryoWriter, der für die visuelle Einzelzellproteomik eingerichtet ist, kann man Dinge wie einzelne Proteine sehen, zum Beispiel filamentöses Aktin und Membranpflaster mit angehängten Proteinen. Das Bild, das Sie in Tafel 6b sehen können, ist negativ gefärbt mit einem 2%-Negativfleck, der auf einer Organotungstenverbindung basiert. Panel c zeigt ein einzelliges Lysat, das für die Kryo-EM vorbereitet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie negative Färbe- oder Kryo-EM-Gitter aus Nanoliter-Gesamtvolumina von Proteinproben oder Einzelzellextrakten herstellen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Ethan und Stickstoff äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen einer Schutzbrille und eines Laborkittels, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.