Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die bakterielle Oberflächenmotilität, bekannt als Schwärmen, auf standardisierte und reproduzierbare Weise sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Platten für die Oberflächenmotilität vorbereitet und ausgehärtet werden. Im zweiten Schritt werden die Platten für den Oberflächenmotilitätstest mit Bakterien beimpft und anschließend unter kontrollierten Bedingungen inkubiert.

Anschließend werden die Wachstumsmuster der Bakterien auf den Plattentests in Echtzeit abgebildet. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bilder zur Quantifizierung auszuwerten. Letztendlich bietet dieses Verfahren einen standardisierten Protokollablauf zur Vorbereitung von Oberflächenmotilitätstests, um quantitative dynamische Informationen wie die Expansionsrate des Schwarmwachstums oder die Verteilung der Bioproduktdichte für typische bakterielle Oberflächenformen zu gewinnen.

Viele Gruppen führen Oberflächenmotilitätsassays durch. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir einen systematischen Protokollablauf bereitstellen, der die zahlreichen Variablen minimiert, die zu Inkonsistenzen führen können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der bakteriellen Oberflächenmotilität zu beantworten, beispielsweise wie Bakterien unterschiedliche Oberflächen besiedeln.

Obwohl diese Methode mit einigen Modifikationen Aufschluss über die Schwarmbeweglichkeit von Pseudomonas geben kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung anderer oberflächenassoziierter Bakterien nutzen. In der Regel haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da geringfügige Änderungen im Protokoll oder in der Laborumgebung die Ergebnisse des Schwarmassays stark beeinflussen können. Die Durchführung des Verfahrens wird Morgan, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren.

Zur Einleitung des Protokolls bereiten Sie ein Agar-Gemisch vor, indem Sie 200 Milliliter FAB-Medium ohne Ammoniumsulfat, 0,9 Gramm Noble-Agar und 0,2 Gramm Aminosäuren in einer 500-Milliliter-Medienflasche kombinieren. Mischen Sie das Medium mithilfe eines Rührplättchens gründlich. Anschließend sterilisieren Sie das Medium in einem Autoklaven bei 121,1 Grad Celsius über einen Zeitraum von 22 Minuten mit der Schnellentlüftungsfunktion.

Direkt nach der Sterilisation den Flaschenverschluss festziehen, um eine Verdunstung des Wassers zu verhindern. Das Medium auf ein magnetisches Rührgerät stellen und unter aktiver Rührung auf 50 Grad Celsius in einer Umgebung mit Raumtemperatur abkühlen lassen. Falls das Agar zu einem späteren Zeitpunkt des Experiments verwendet werden soll, kann es 15 Stunden lang ohne aktive Rührung in einem Wasserbad oder Inkubator bei 60 Grad Celsius warmgehalten werden.

Wenn das Medium etwa 50 Grad Celsius erreicht hat, zwei Milliliter filtersterilisiertes Glukose zugeben und unter Verwendung standardmäßiger steriler Techniken gründlich mit dem Magnetrührstab umrühren, um Blasenbildung im Medium zu verhindern. In einer Sterilwerkbank unter Verwendung einer sterilen serologischen Pipette 7,5 Milliliter des Mediums in einzelne 60-Millimeter-Petri-Schalen abfüllen. Falls eine größere Schwarmoberfläche gewünscht ist, 25 Milliliter des Mediums in 100-Millimeter-Petri-Schalen abfüllen.

Alle Schalen ungestapelt stehen lassen und die Haube mit einer Blasenwasserwaage überprüfen, um eine gleichmäßige horizontale Oberfläche für das Erstarren des Agars sicherzustellen. Für 60-Millimeter-Platten die Schalendeckel beiseitelegen und das unbedeckte Agar in der Haube 30 Minuten lang aushärten lassen. Größere 100-Millimeter-Schalen benötigen eine längere Aushärtezeit.

Die Luftfeuchtigkeit, Luftzirkulation und Temperatur eines bestimmten Labors können es erforderlich machen, die Aushärtungszeit für eine optimale Schwarmbildung Ihres Bakteriums zu testen. Nach dem Trocknen sollten die APLs unverzüglich mit Zellen beimpft werden, die separat zuvor in die gewünschte Wachstumsphase vorgezüchtet wurden. Gehen Sie zunächst wie folgt vor: Picken Sie eine isolierte Bakterienkolonie von einer frischen LB-Platte ab und impfen Sie diese in sechs Milliliter Kulturmedium an.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius mit horizontalem Schütteln. Am nächsten Tag impfen Sie ein bis fünf Mikroliter der Übernachtkultur auf die getrockneten Schwarmagarplatten auf, indem Sie die Agaroberfläche mit einem sterilen Holzstäbchen oder einem Drahtinokulationsnadel piksen, abhängig von der Bakterienstamm. Überführen Sie die Schwarmtestplatten in einen Inkubator mit einer Temperatur von entweder 30 Grad Celsius, 37 Grad Celsius oder 42 Grad Celsius. Drehen Sie die Platten um, sodass überschüssige Feuchtigkeit an der Deckeloberseite kondensiert und nicht auf dem Agar. Äquilibrieren Sie die Bakterien bei stammspezifischen Temperaturen für entweder zwei oder vier Stunden unmittelbar vor der Zeitrafferaufnahme.

Überführen Sie als Nächstes die Platten in die In-vivo-Bildgebungseinheit, sodass sich die Bakterien auf der Agaroberfläche nach unten in Richtung der invertierten Kamera der Einheit befinden. Füllen Sie alle Petrischalen-Deckel mit einer geringen Menge Wasser. Anschließend wird jeder Deckel mit der wasserbenetzten Seite nach oben auf die invertierten AER-Platten platziert.

Siegeln Sie im Inneren der Bildgebungseinheit die Bildgebungskammer, um eine konstante Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, passen Sie die Bildgebungseinstellungen der Einheit an und beginnen Sie mit der zeitraffenden Aufnahme der Schwärmaktivität. Nach der Echtzeit-Bildgebung können die Schwärmdynamiken der Bakterien mithilfe gängiger Bildanalyseverfahren wie Image J in einem Experiment zur Oberflächenmotilität ausgewertet werden. Die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts des Agars unmittelbar vor der Inokulation ist entscheidend, um erfolgreiche Schwärmergebnisse zu erzielen.

Optimale AER-Platten fördern einen kompakten Inokulationspunkt und verstärken die Schwarmaktivität von Bakterien, während übermäßig getrocknete Platten die Oberflächenmotilität zusätzlich zur Feuchtigkeit beeinträchtigen. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Zusätzen im Kulturmedium kann ebenfalls die Schwarmaktivität von Bakterien in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur beeinflussen, insbesondere wenn Bakterienstämme verwendet werden, die Lumineszenz oder fluoreszierende Proteine exprimieren. Die dynamischen Wechselwirkungen beim Schwarmwettbewerb zwischen zwei verschiedenen Bakterienspezies können mittels Zeitraffervideo aufgezeichnet werden. Darüber hinaus lassen sich mit zeitlich aufgelöster Fluoreszenzmikroskopie Änderungen in der lokalen Zelldichte sowie die Biosyntheserate von beweglichkeitsfördernden Lipiden innerhalb des bakteriellen Schwarmes bestimmen und quantifizieren.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die konfokale Mikroskopie angewendet werden, um Fragen zum Verhalten einzelner Zellen zu beantworten und eine detaillierte, mikroskopische Analyse der bakteriellen Oberflächenmotilität zu erzeugen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen standardisierten und reproduzierbaren Schwarm-Assay durchführt und eine umfassende Analyse der bakteriellen Oberflächenmotilität erhält, indem Oberflächenmotilitäts-Assays vorbereitet, inkubiert und beimpft sowie die Ergebnisse hinsichtlich Wachstumsmustern der Bakterien verarbeitet und analysiert werden.