Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die bakterielle Oberflächenmotilität, die als Schwärmen bezeichnet wird, auf standardisierte und reproduzierbare Weise zu visualisieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberflächenmotilitätsplatten vorbereitet und ausgehärtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Platten für den Oberflächenmotilitätstest mit Bakterien zu beimpfen und diese Platten in einer kontrollierten Umgebung zu inkubieren.

Als nächstes werden die Muster des Bakterienwachstums auf den Plattenassays in Echtzeit abgebildet. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bilder für die Quantifizierung zu verarbeiten. Letztendlich bietet dieses Verfahren ein standardisiertes Protokoll für die Vorbereitung von Oberflächenmotilitätsplatten-Assays, um quantitative dynamische Informationen wie die Schwarmexpansionsrate oder die Dichteverteilung des Bioprodukts für Oberflächenmodalbakterien zu generieren.

Viele Gruppen führen Oberflächenmotilitätstests durch. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ein systematisches Protokoll bereitstellen, das die zahlreichen Variablen minimiert, die zu Inkonsistenzen führen können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der bakteriellen Oberflächenmotilität zu beantworten, z. B. wie Bakterien verschiedene Arten von Oberflächen besiedeln.

Obwohl diese Methode mit einigen Modifikationen einen Einblick in die Motilität von Pseudomonas-Schwärmen geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Oberflächenmodalbakterien angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da kleine Änderungen im Protokoll oder in der Laborumgebung die Ergebnisse des Schwarmassays stark beeinflussen können. Das Verfahren wird von Morgan, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.

Bereiten Sie zu Beginn des Protokolls eine Agri-Mischung vor, indem Sie 200 Milliliter FAB minus Ammoniumsulfat-Schwarmmedium, 0,9 Gramm Edelagar und 0,2 Gramm Cainosäuren in eine 500-Milliliter-Medienflasche mischen. Verwenden Sie eine Rührplatte, um das Medium gründlich zu mischen. Sterilisieren Sie das Medium anschließend in einem Autoklaven bei 121,1 Grad Celsius für 22 Minuten mit einer Schnellentlüftungsoption.

Ziehen Sie unmittelbar nach der Sterilisation den Verschluss der Medienflasche fest, um eine Verdunstung des Wassers zu verhindern. Legen Sie das Medium auf eine magnetische Rührplatte und kühlen Sie den AED in einer Umgebung mit Umgebungstemperatur unter aktivem Rühren auf 50 Grad Celsius ab. Soll der Agar zu einem späteren Versuchszeitpunkt verwendet werden, kann er in einem 60 Grad Celsius warmen Wasserbad oder einem Inkubator 15 Stunden lang ohne aktives Rühren warm gehalten werden.

Wenn das Medium bei zwei Millilitern filtersterilisierter Glukose eine Temperatur von etwa 50 Grad Celsius erreicht, mischen Sie es gründlich mit dem magnetischen Rührstab, um Blasenbildung im Medium zu verhindern. Verwenden Sie in einer Haube eine sterile serologische Pipette, um 7,5 Milliliter der Ödia in einzelne 60-Millimeter-Petrischalen zu aliquotieren. Wenn eine größere Schwarmoberfläche gewünscht ist, aliquotieren Sie 25 Liter Edia in 100 Millimeter Petrischale.

Lassen Sie alle Schalen ungestapelt und überprüfen Sie die Haube mit einer Bullseye-Höhe, um eine ebene horizontale Oberfläche zu gewährleisten, auf der sich der Agar verfestigen kann. Für 60-Millimeter-Platten legen Sie die Schalendeckel beiseite und härten Sie das unbedeckte Agar 30 Minuten lang in der Haube aus. Größere 100-Millimeter-Schalen erfordern eine längere Aushärtungszeit.

Die Luftfeuchtigkeit, der Luftstrom und die Temperatur eines bestimmten Labors können es erforderlich machen, die Aushärtungszeit für ein optimales Schwärmen Ihres Bakteriums zu testen. Nach dem Trocknen sollten die APLs sofort mit Zellen beimpft werden, die separat zur gewünschten Wachstumsphase vorgezüchtet wurden. Nehmen Sie zunächst eine isolierte Bakterienkolonie aus einer frischen LB-Platte und impfen Sie sie in sechs Milliliter Kultur. Medien.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius unter horizontalem Schütteln. Am nächsten Tag impfen Sie ein bis fünf Mikroliter der Übernachtkultur über die getrockneten Schwarm-Agarplatten, indem Sie die Agaroberfläche mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Draht-Impfnadel anstechen, je nach Bakterienstamm, und überführen Sie die Schwarm-Assay-Platten in einen Inkubator mit einer Temperatur, die entweder auf 30 Grad Celsius, 37 Grad Celsius eingestellt ist. oder 42 Grad Celsius. Drehen Sie die Platten so um, dass überschüssige Feuchtigkeit auf dem Plattendeckel und nicht auf dem Agar kondensiert, und gleichen Sie die Bakterien entweder zwei oder vier Stunden lang bei stammspezifischen Temperaturen aus, kurz bevor Sie die Zeitraffer-Bildgebung durchführen.

Übertragen Sie anschließend die Platten so in die In-vivo-Bildgebungseinheit, dass die Bakterien auf der Agraroberfläche nach unten in Richtung der invertierten Kamera der Einheit zeigen. Füllen Sie alle Deckel der Petrischale mit einer kleinen Menge Wasser. Legen Sie dann jeden Deckel mit der Wasserseite nach oben auf die umgedrehten AER-Platten.

Versiegeln Sie im Inneren der Bildgebungseinheit das Bildgebungsgehäuse, um eine konstante Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, passen Sie die Bildgebungseinstellungen der Bildgebungseinheit an und beginnen Sie mit der Zeitrafferaufnahme der Schwarmaktivität. Nach der Echtzeit-Bildgebung kann die Schwarmdynamik der Bakterien mit Hilfe einer Standard-Bildanalyse wie Image J in einem Oberflächenmotilitätsexperiment analysiert werden. Die Untersuchung des Agar-Feuchtigkeitsgehalts kurz vor der Inokulation ist entscheidend für das Erzielen erfolgreicher Schwarmergebnisse.

Optimalerweise erleichtern AER-Platten einen dichten Impffleck und verstärken die bakterielle Schwarmaktivität, während über getrockneten Platten neben dem Feuchtigkeitsgehalt auch die Oberflächenmotilität unterdrückt wird, kann das Vorhandensein oder Fehlen von Medienzusätzen auch die Schwarmaktivität von Bakterien in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur beeinflussen, indem Bakterienstämme, die Lumineszenz exprimieren oder fluoreszierende Proteine verwendet werden. Die Konkurrenzdynamik des Schwärmens zwischen zwei verschiedenen Bakterienarten kann in einem Zeitraffervideo festgehalten werden. Darüber hinaus können auch Veränderungen der lokalen Zelldichte und der Biosyntheserate von mobilitätsfördernden Lipiden im Bakterienschwarm mit Hilfe der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie ermittelt und quantifiziert werden.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden, wie z.B. die konfokale Mikroskopie, können eingesetzt werden, um Fragen zum individuellen Zellverhalten zu beantworten und eine detaillierte, mikroskopische und mikroskopische Analyse der bakteriellen Oberflächenmotilität zu erstellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen standardmäßigen und reproduzierbaren Schwarmassay durchführen und eine umfassende Analyse der bakteriellen Oberflächenmotilität erhalten, indem Sie Oberflächenmotilitätsassays vorbereiten, aushärten und inokulieren und das Ergebnis in Bakterienwachstumsmustern verarbeiten und analysieren.