Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die chemische Toxizität der Keimbahn anhand des Fadenwurms C No Haitis elgan umfassend zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Würmer synchronisiert werden, indem eine verdünnte Bleichlösung zu einer gemischten Wurmpopulation des C Elgan PXOL one GFP-Stammes hinzugefügt wird. Dieser Schritt erzeugt eine große Anzahl von Embryonen, die durch ihre Eierschale vor dem Bleichen geschützt sind.

Der zweite Schritt besteht darin, eine synchronisierte L-1-Larvenpopulation zu erzeugen, indem die Embryonen in Flüssigkeit ohne Nahrung schlüpfen. Als nächstes wachsen die Würmer bis zu ihrem vierten Larvenstadium oder L vier heran, woraufhin sie 65 Stunden lang den interessierenden Chemikalien in Flüssigkeit ausgesetzt sind. Der letzte Schritt ist die fluoreszenzmikroskopische Visualisierung der Expression der GFP-Reporter in Embryonen in der Gebärmutter der Würmer.

Letztendlich spiegelt der Anteil der GFP-positiven Embryonen im Vergleich zur DMSO-Kontrolle die Antigenität der getesteten Verbindungen wider. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. Rodin-Modellen oder Zellkultur-Assays, besteht darin, dass wir die Nukleazität und Keimbahntoxizität von Chemikalien in einem Ganztiermodell beurteilen können, während wir gleichzeitig einen Hochdurchsatz-Assay durchführen, der das Verfahren durchführt. Heute ist die Postdoktorandin Dr. Daniella Perotti.

Die grafischen Würmer für dieses Verfahren wurden zuvor wie im begleitenden Protokolltext beschrieben hergestellt, sammeln die GR-Würmer aus dem Nematodenwachstumsmedium oder den NGM-Platten, indem sie mit ein bis zwei Millilitern M nine gewaschen und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt werden. Lassen Sie den GR-Wurm etwa fünf bis 10 Minuten lang auf den Boden des konischen 15-Milliliter-Rohrs sedimentieren. Entfernen Sie anschließend den Überstand, ohne das Wurmkorn zu stören.

Füllen Sie das Wurmpellet in zwei bis vier Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie einen Milliliter verdünnte Bleichlösung in jedes Röhrchen. Zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion unter dem Stereomikroskop, um zu bestätigen, dass alle Würmer tot sind.

Bleichen Sie nicht länger als fünf Minuten, da die Embryonen absterben könnten. Sammeln Sie die Würmer eine Minute lang durch Zentrifusion. Bei 3000 U/min.

Entfernen Sie das Supernat und fügen Sie einen Milliliter steriles M nine hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien, die nach der Bleichbehandlung mit den Würmern in Kontakt kommen, steril sind. Waschen Sie die Würmer zweimal mit M neun Medien.

Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie M neun bis 100 bis 200 Mikroliter hinzu. Geben Sie mit einer Weidepipette aus Glas einen Tropfen der Wurmmischung M neun auf klare NGM-Platten und inkubieren Sie sie mindestens 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius, damit die Embryonen ohne Nahrung schlüpfen können. Das Wachstum der Larven wird bei L gestoppt: eine Stufe zwei Synchronisationsschritte.

Bleichen und L-Wort-Hunger werden verwendet, da es entscheidend ist, eine hochgradig synchrone warme Population zu erreichen, um die Anzahl der L-Vier-Larven zu maximieren, die für die Exposition verwendet werden. Einen Tag nach der Etablierung einer synchronisierten L-1-Larvenpopulation sammeln Sie die L-1-Larven von den durchsichtigen NGM-Platten. Waschen Sie die Platten mit ein bis zwei Millilitern M neun und geben Sie die L eins Larven in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen.

Lassen Sie die toten erwachsenen Würmer etwa fünf Minuten lang auf dem Boden des konischen 15-Milliliter-Röhrchens sedimentieren. Sammeln Sie den Überstand an der Stelle, an der sich die L-1-Würmer befinden, in einem neuen konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Die Würmer werden durch Zentrifusion für zwei Minuten bei 2.600 U/min ausgefällt.

Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie ca. 500 Mikroliter übrig. Bestimmen Sie die Konzentration der Würmer in der M neun Lösung, indem Sie die Anzahl der Würmer in 10 Mikroliter Tropfen zählen. Zählen Sie mit einem Stereomikroskop mindestens fünf Tropfen.

Stellen Sie die Konzentration der Würmer auf 20 bis 25 Würmer pro Mikroliter in M neun ein und geben Sie dann 50 Mikroliter der Wurmmischung M neun auf NGM-Platten. Im Sitzen mit OP 50 inkubieren die fütternden Bakterien 65 Stunden lang bei 15 Grad Celsius, damit die synchronisierte Population von L eins wachsen kann, bis sie die Stufe L vier erreicht. In diesem Screen wird ein CL gegen einen Stamm verwendet, der einen fluoreszierenden Transkriptionsreporter enthält, um eine Keimbahnstörung und die Induktion embryonaler Aneuploidie zu erkennen.

Sammeln Sie die L vier Larven von den durchsichtigen NGM-Platten, indem Sie die Platten mit ein bis zwei Millilitern M neun waschen und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Lassen Sie den Wurm L vier etwa fünf bis 10 Minuten lang auf den Boden des konischen 15-Milliliter-Röhrchens sedimentieren. Entfernen Sie dann den Überstand, ohne das Wurmkorn zu stören.

Fügen Sie drei bis fünf Milliliter M neun hinzu und bestimmen Sie die Konzentration der Würmer in der M neun Lösung, indem Sie die Anzahl der Würmer in 10 Mikrolitertropfen zählen. Zählen Sie mit einem Stereomikroskop mindestens fünf Tropfen pro Probe. Resuspendieren Sie die Würmer in einer Konzentration von einem Wurm pro Milliliter in M neun.

Die zuvor zubereiteten OP 50-Bakterien mit M neun zehnfach verdünnen. Stellen Sie sicher, dass die resuspendierten Bakterien Raumtemperatur erreichen, da niedrigere Temperaturen die Wurmentwicklung beeinflussen, indem Sie eine Mehrkanalpipette verwenden. Geben Sie zuerst 100 Mikroliter der Wurmmischung M neun in jede Vertiefung einer zwei Milliliter tiefen 96-Well-Platte mit rundem Boden. Als nächstes geben Sie am Ende 400 Mikroliter der verdünnten OP 50-Bakterien in jede Vertiefung

Jede Vertiefung enthält 100 Würmer in 500 Mikrolitern. Geben Sie 0,5 Mikroliter der Testchemikalie in die gewünschten Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 100 Mikromolar zu erreichen. Eine Konzentration, die üblicherweise in chemischen Screens in CL elgan verwendet wird, setzt Ethanol- oder DMSO-Lösungsmittelkontrollen bei einer Endkonzentration von 0,1 % als Positivkontrolle aus.

Verwenden Sie 100 Mikromolare ohne Cosol. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie. Achten Sie darauf, die Plattenvertiefung abzudichten, um eine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen zu vermeiden.

Wickeln Sie die Platte mit Alufolie ein. Stellen Sie die Platte für eine geeignete Zeit in einen Schüttler mit der entsprechenden Temperatur. Halten Sie die Raumtemperatur bei etwa 20 Grad Celsius, da die Temperatur das Wachstum der Würmer nach Beendigung der chemischen Exposition im Schüttler beeinflusst.

Lassen Sie die 96-Well-Platten 10 bis 15 Minuten ruhen, damit die adulten Würmer mit einer Mehrkanalpipette auf den Boden der Platte sedimentieren können. Entfernen Sie 350 Mikroliter des M neun aus jeder Vertiefung und achten Sie darauf, die Würmer am Boden der Platte nicht zu stören. Waschen Sie die Würmer mit einem Milliliter M neun und lassen Sie die Platte nochmals 10 bis 15 Minuten ruhen, damit sich die erwachsenen Würmer zu Boden sedimentieren können.

Entfernen Sie einen Milliliter des M neun aus jeder Vertiefung und achten Sie sehr darauf, die Würmer am Boden der Platte nicht zu stören. Wiederbeleben, die Würmer in den restlichen M neun aufhängen. Sammeln Sie 100 Mikroliter der Wurmmischung M neun von der 96-Well-Platte und laden Sie sie in die Wells einer schwarzen Wand mit klarer Bottom 384-Well-Platte.

Wiederholen Sie den Vorgang mit Würmern aus 4 96-Well-Platten, bis alle Wells der 384-Well-Platte geladen sind. Es ist wichtig, dass alle Vertiefungen das gleiche Volumen haben, um die Effizienz und Geschwindigkeit des Autofokus während des Bildaufnahmeprozesses zu erhöhen. Geben Sie dann einen Mikroliter Lale in jede Vertiefung und lassen Sie die Würmer etwa 30 Minuten lang inkubieren.

Lale fungiert als Acetylcholinrezeptor-Agonist und immobilisiert die Würmer, überträgt die Platte an ein Weitfeldmikroskop mit hohem Inhalt, das eine automatisierte Bildgebung ermöglicht. Verwenden Sie eine High-Content-Bilderfassungs- und Analysesoftware gemäß den Richtlinien des Herstellers. Wählen Sie die vier x Objektive aus, um ein Bild pro Bild aufzunehmen.

Stellen Sie die GFP-Bildgebungsparameter auf 45 Millisekunden Belichtung und die Bildauflösung auf 2160 x 2160 ein. Beginn der Bildaufnahme Exponierte Würmer werden direkt auf 384-Well-Platten abgebildet. Die Anzahl der Würmer, die mindestens einen GFP-positiven Embryo enthalten, wird für jede Vertiefung gezählt und mit der Gesamtzahl der Würmer in dieser Vertiefung normalisiert, wie hier gezeigt.

Die Exposition gegenüber chemischen Wirkstoffen wie dem Mikrotubuli-Gift no-code AOL führt zur Induktion eines hohen Anteils von GFP-exprimierenden Embryonen im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Die GFP-positiven Embryonen sind signifikant heller als die schwache Hintergrundfluoreszenz, die bei anderen Embryonen beobachtet wurde, sowie die Autofluoreszenz, die im Darm der Tiere beobachtet wurde. Der rote Pfeil zeigt GFP-positive Embryonen an, die in der Gebärmutter eines mit AOL behandelten Wurms ohne Code deutlich sichtbar sind.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden durchgeführt werden, wie z.B. die DNA-Färbung der Würmer, um einen genaueren Blick auf die Wirkung der Chemikalien auf die Keimbahn zu erhalten. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Toxikologie, die Reproduktionstoxizität und Keimbahntoxizität von Chemikalien schnell zu beurteilen.