Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zirkulation extrazellulärer Vesikel im Blut mit zwei verschiedenen Methoden zu isolieren und zu analysieren. Für die Einzelnachweismethode extrazellulärer Vesikel wird zunächst thrombozytenarmes Plasma oder PPP aus einer Blutprobe isoliert.

Das PPP wird anschließend mit den fluorochromkonjugierten Antikörpern der gewünschten Spezifität gefärbt. Bei der bead-basierten Nachweismethode werden die extrazellulären Vesikel mit Beads inkubiert und die an die Beads gebundenen Vesikel anschließend mit den entsprechenden fluorochromkonjugierten Antikörpern markiert. Letztendlich kann der Gehalt an zirkulierenden extrazellulären Vesikeln durch Analyse der Proben per Durchflusszytometrie bestimmt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektronenmikroskopie oder der magnetischen Bead-Separation besteht darin, dass sie wesentlich schneller ist und die Beurteilung der gesamten extrazellulären Escal-Population ermöglicht, anstatt auf bestimmte Subpopulationen beschränkt zu sein. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden im Allgemeinen Schwierigkeiten haben, da der Erfolg dieser Methode eine strikte Einhaltung der demonstrierten Handgriffe und der Cytometer-Einstellparameter erfordert, um hochwertige Daten mit minimalen täglichen Schwankungen zu erzielen. Beginnen Sie damit, Vollblutproben zu zentrifugieren, um das Plasma vom Buffy-Coat und den roten Zellen zu trennen. Überführen Sie anschließend 1,2 Milliliter-Aliquote des plasmatischen Überstands in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, wobei darauf zu achten ist, die unteren Schichten mit dem Buffy-Coat und den roten Zellen nicht aufzurühren. Zentrifugieren Sie den Überstand danach erneut, um verbliebene Thrombozyten und große Zellfragmente zu entfernen.

Am Ende der Zentrifugation vorsichtig alles bis auf die letzten 200 Mikroliter der PPP-Proben in neue Röhrchen überführen, wobei darauf geachtet werden muss, die Pellets nicht aufzulösen. Anschließend das Plasma mehrmals auf und ab pipettieren und jeweils 320 Mikroliter jeder Probe in die oberste Reihe einer 96-Well-Platte übertragen. Um die Proben zu färben, kombinieren Sie die gewünschten Antikörper für jedes der drei Panels in einzelnen Zentrifugalfilterröhrchen mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern und zentrifugieren Sie die Antikörper mit einem Festwinkelrotor bei konstanter Geschwindigkeit.

Nachdem das gesamte Antikörper durch den Filter gelaufen ist, die entsprechende Menge der Mischung wie in der Abbildung dargestellt in jede Vertiefung der 96-Loch-Platte geben. Anschließend mit einer Mehrkanalpipette die PPP-Proben mischen und dann 100 Mikroliter jeder Probe zu den Antikörpern in Reihe zwei übertragen. Danach die Proben erneut mischen, die Pipettenspitzen wechseln und je 100 Mikroliter Probe entsprechend zu den nächsten beiden Reihen mit Antikörpern übertragen.

Führen Sie für das Experiment die Platte 30 Minuten bei 220 Mikrolitern PBS pro Vertiefung in einer biologischen Sicherheitswerkbank von Reihe sechs bis acht ein. Inkubieren Sie die Platte anschließend bei vier Grad Celsius. Überführen Sie dann mithilfe einer breitenverstellbaren Mehrkanalpipette den Inhalt jeder Vertiefung in das entsprechende zentrifugale Filtersetz, ohne die Aufsätze zu wechseln.

Verwenden Sie 200 Mikroliter PBS aus einer der Spülreihen, um die Vertiefungen, aus denen die Proben gerade entfernt wurden, auszuspülen. Überführen Sie dann die Spüllösung auf dieselben Filter, auf die zuvor die PPP-Proben gegeben wurden, und verschließen Sie die Zentrifugalfilter. Sobald alle gefärbten PPP-Proben zusammen mit ihren Spüllösungen überführt wurden, zentrifugieren Sie die Proben in einem Festrotor-Zentrifugengerät.

Nach dem Zentrifugieren sicherstellen, dass sich keine Flüssigkeit mehr auf den Filtern befindet. Anschließend die Filteroberflächen in 300 Mikroliter PBS resuspendieren und den resuspendierten Inhalt in vorbeschriftete Röhrchen für eine sofortige Durchflusszytometrie-Analyse überführen. Das Waschen der gefärbten Proben mithilfe von Zentrifugalfiltern verbessert die Trennung zwischen Hintergrund- und positiven Markersignalen.

Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass einige der kleineren extrazellulären Vesikel, einschließlich Exosomen, durch die Poren des Filters verloren gehen können. Um die Proben zu analysieren, stellen Sie zunächst die Spannungsparameter für Forward- und Side-Scatter auf eine logarithmische Skala ein und wählen Sie die niedrigsten Schwellenwerte, die das Cytometer für jeden Parameter zulässt. Während Sie dann eine Probe mit null Komma zwei zwei Mikrometer gefiltertem PBS durchlaufen lassen, justieren Sie diese Spannungen auf die höchsten Werte, bei denen der Großteil des Hintergrundrauschens ausgeschlossen bleibt. Danach führen Sie eine Probe durch, die eine Mischung aus Beads enthält, die ein Mikrometer und kleiner sind, und zeichnen ein Gate um die Bead-Population in einem Forward- versus Side-Scatter-Diagramm, um alle Ereignisse unterhalb der ein-Mikrometer-Beads zu erfassen.

Stellen Sie nun die Durchflussrate des Cytometers auf niedrig ein und verwenden Sie die Beads, um den Durchflussratenregler am Cytometer auf die gewünschte Ereignisrate einzustellen. Erheben Sie anschließend mit einem Gefäß von regenbogenfarbenen fluoreszierenden Partikeln, die in PBS verdünnt sind, 5.000 Ereignisse und notieren Sie die mittlere Intensität der Werte für den Vorwärtsstreulicht-, Seitenstreulicht- und jeden Farbkanal. Wenn alle Parameter eingestellt sind, führen Sie jede Probe exakt eine oder zwei Minuten lang durch. Nachdem die erste Messung für jedes Gefäß abgeschlossen ist, mischen Sie 20 Mikroliter 10 % MP 40 in jede Probe ein und messen Sie die Gefäße erneut für die gleiche Zeitspanne, um die Subtraktion der in der lysierten Probe über einen gleichlangen Zeitraum detektierten positiven Ereignisse zu ermöglichen.

Um extrazelluläre Vesikel mittels bead-basierter Anreicherung nachzuweisen, waschen Sie zunächst unbeschichtete sechs Mikrometer große Polystyrol-Perlen zwei Mal mit RPMI-Medium und resuspendieren Sie diese anschließend in zwei Millilitern desselben Mediums. Danach geben Sie 6.000 Perlen in jedes neue FACS-Röhrchen, zum negativen Kontrollröhrchen 400 Mikroliter Medium und zu allen anderen Röhrchen jeweils 200 Mikroliter PPP oder ultrazentrifugierte extrazelluläre Vesikel, wie angebracht, sowie 200 Mikroliter Medium. Stellen Sie das Endvolumen in jedem Röhrchen auf 400 Mikroliter ein.

Mit mehr Medium. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler. Am nächsten Morgen waschen Sie die Kügelchen mit zwei Millilitern Medium.

Aspirieren Sie den Überstand und blockieren Sie unspezifische Bindungen mit 400 µL 5 % Rinderserumalbumin, indem Sie die Probe drei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler inkubieren. Nach drei Stunden waschen Sie die Kügelchen mit zwei weiteren Millilitern Medium und resuspendieren die Pellets in 100 µL frischem Medium. Filtern Sie nun die Antikörper und geben Sie das entsprechende Volumen des filtrierten Antikörpercocktails in jedes Röhrchen. Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius waschen Sie die Kügelchen erneut mit zwei Millilitern Medium.

Resuspendieren Sie die Pellets dieses Mal in 400 Mikrolitern Medium und analysieren Sie die Proben unverzüglich per Durchflusszytometrie, wobei die Streulichtparameter im Vorwärtsbereich auf die niedrigste vom Durchflusszytometer zugelassene Schwelle eingestellt werden, wie gerade gezeigt. Gaten Sie schließlich auf die Population der Einzelbeads und erfassen Sie 2000 Ereignisse pro Probe. Sowohl die individuelle als auch die bead-basierte Detektionsmethode kann verwendet werden, um das Vorhandensein extrazellulärer Vesikel in den PPP-Proben nachzuweisen, wie durch diese Punktdiagramme veranschaulicht. Bei dem individuellen Detektionsassay dient die lysierte Kontrolle zur Einstellung der Gates für die entsprechende nicht lysierte Probe.

Der Großteil der Ereignisse sollte innerhalb des Gates für extrazelluläre Vesikel liegen. Beispielsweise zeigen diese biparametrischen Darstellungen den Nachweis der Marker CD108A und CD235A, zwei rote Blutkörperchen-Marker, die bekanntermaßen gemeinsam auf Zellen vorkommen. Wie erwartet, sind über die Hälfte der positiven Ereignisse auf den extrazellulären Vesikeln für beide Marker positiv, während in diesen biparametrischen Darstellungen die Expression zweier Marker auf extrazellulären Vesikeln, die bekanntermaßen nicht gemeinsam auf Zellen vorkommen, mittels der bead-basierten Nachweismethode deutlich getrennte positive Populationen aufweist.

Es besteht keine Trennung zwischen den positiven und negativen Populationen, und Ereignisse erscheinen in den doppelt-positiven Quadranten, obwohl sie normalerweise nicht auf denselben Zelltypen vorkommen, da beide Arten von extrazellulären Vesikeln an eine einzelne Perle binden. Daher sollten die Daten dieser Methode am besten mithilfe von Histogrammen analysiert werden, die mit den Daten der negativen Kontrolle überlagert sind, wobei bei den perlengebundenen Proben im Vergleich zu den Kontrollen eine sichtbare Verschiebung der Markerexpression beobachtet wird, sobald die Methode beherrscht ist. Diese Technik kann verwendet werden, um 12 Blutproben mit drei Antikörpanelen innerhalb von drei bis vier Stunden mit der individuellen Nachweismethode oder innerhalb von eineinhalb Tagen mit der Perlenmethode zu analysieren, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass jede Probe einheitlich behandelt wird, und sicherzustellen, dass die Durchflussrate des Zytometers und die Fluoreszenzintensitäten zu Beginn jedes Experiments korrekt eingestellt wurden, um den experimentellen Bedingungen des Vortages zu entsprechen, insbesondere wenn mehrere Proben über mehrere Tage hinweg analysiert werden.