Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die extrazelluläre Vesikelzirkulation im Blut mit zwei verschiedenen Methoden zu isolieren und zu analysieren. Für die individuelle extrazelluläre Vesikel-Detektionsmethode. Thrombozytenarmes Plasma oder PPP wird zunächst aus einer Blutprobe isoliert.

Das PPP wird dann mit den interessierenden Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gefärbt. Für das Bead-basierte Nachweisverfahren werden die extrazellulären Vesikel mit Kügelchen inkubiert, und dann werden die beadgebundenen Vesikel mit den relevanten Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gefärbt. Letztendlich kann der Gehalt an zirkulierenden extrazellulären Vesikeln durch Analyse der Proben mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektronenmikroskopie oder der magnetischen Bead-Trennung besteht darin, dass sie viel schneller ist und die Beurteilung der gesamten extrazellulären Escal-Population ermöglicht, anstatt auf bestimmte Subpopulationen beschränkt zu sein. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da der Erfolg dieser Methode eine strikte Einhaltung der gezeigten Manöver und Zytometer-Setup-Parameter erfordert. Um qualitativ hochwertige Daten mit minimalen täglichen Schwankungen zu erzeugen, beginnen Sie mit der Zentrifugation von Vollblutproben, um das Plasma von der Buffy-Hülle und den roten Blutkörperchen zu trennen. Als nächstes werden 1,2 Milliliter Aliquots des Plasmaüberstands in 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen überführt, wobei darauf geachtet wird, dass die unteren Schichten, die den Buffy Coat und die roten Blutkörperchen enthalten, nicht gestört werden, und dann den Überstand erneut zentrifugieren, um Blutplättchen und große Zellfragmente zu entfernen.

Am Ende des Schleuderns werden alle bis auf die letzten 200 Mikroliter der PSM-Proben vorsichtig in neue Röhrchen umgefüllt, wobei darauf zu achten ist, dass die Pellets nicht beschädigt werden. Mischen Sie dann das Plasma mehrmals auf und ab und geben Sie 320 Mikroliter jeder Probe in die oberste Reihe einer 96-Well-Platte. Um die Proben zu färben, kombinieren Sie die Antikörper von Interesse für jedes der drei Panels in einzelnen Zentrifugalfilterröhrchen mit einem Nullpunkt von 22 Mikrometern und schleudern Sie die Antikörper mit einer Zentrifuge mit festem Winkel und einer Geschwindigkeit nach unten.

Wenn der gesamte Antikörper den Filter passiert hat, geben Sie die entsprechende Menge der Mischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, wie in der Abbildung dargestellt. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um die PPP-Proben zu mischen, und übertragen Sie dann 100 Mikroliter jeder Probe auf die Antikörper in Reihe zwei. Mischen Sie dann die Proben erneut, wechseln Sie die Spitzen und geben Sie je nach Bedarf 100 Mikroliter Probe in jede der nächsten beiden Antikörperreihen.

Für das Experiment. Inkubieren Sie die Platte nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit 220 Mikrolitern PBS pro Vertiefung, um die Reihen sechs bis acht in einer biologischen Sicherheitswerkbank zu durchlaufen. Übertragen Sie dann mit einer breitenverstellbaren Mehrkanalpipette den Inhalt jeder Vertiefung in das entsprechende Zentrifugalfilterröhrchen, ohne die Spitzen zu wechseln.

Verwenden Sie 200 Mikroliter PBS aus einer der Waschreihen, um die Vertiefungen zu spülen, aus denen die Proben gerade entnommen wurden. Füllen Sie dann die Spüllösung in dieselben Filter um, in die zuvor die PSM-Proben gegeben wurden, und schließen Sie die Zentrifugalfilter. Nachdem alle gefärbten PSM-Proben zusammen mit ihren Spüllösungen übertragen wurden, werden die Proben in einer Zentrifuge mit festem Rotor heruntergeschleudert.

Achten Sie nach dem Schleudern darauf, dass keine Flüssigkeit auf den Filtern zurückbleibt. Anschließend werden die Oberseiten der Filter in 300 Mikroliter PBS resuspendiert und der resuspendierte Inhalt für die sofortige durchflusszytometrische Analyse in vormarkierte Röhrchen überführt. Das Waschen der gefärbten Proben mit Zentrifugalfiltern verbessert die Trennung zwischen dem Hintergrundsignal und den positiven Markersignalen.

Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass einige der kleineren extrazellulären Vesikel, einschließlich Exosomen, durch die Türen des Filters verloren gehen können. Um die Proben zu analysieren, stellen Sie zunächst die Parameter für die Vorwärts- und Seitenstreuspannung auf eine logarithmische Skala ein und wählen Sie für jeden Parameter die niedrigsten vom Zytometer zugelassenen Schwellenwerte aus. Während dann eine Röhre mit einem Nullpunkt von 22 Mikrometern betrieben wird, passt das gefilterte PBS diese Spannungen auf die höchsten Werte an, die den Großteil des Hintergrundrauschens ausschließen. Führen Sie als Nächstes ein Rohr aus, das eine Mischung aus Kügelchen enthält, die einen Mikrometer und kleiner sind, und zeichnen Sie ein Tor um die Kügelchenpopulation in einem vorwärts nebeneinander liegenden Streudiagramm, um alle Ereignisse unter den Ein-Mikrometer-Kügelchen zu erfassen.

Stellen Sie nun die Durchflussrate des Zytometers auf niedrig und stellen Sie mit den Kügelchen den Durchflussregler am Zytometer auf die gewünschte Ereignisrate ein. Dann werden mit einer Röhre mit Regenbogenfluoreszenzpartikeln, die in PBS verdünnt sind, 5.000 Ereignisse erfasst, wobei die mittlere Intensität der Werte für die Vorwärtsstreuung auf der Streuseite und jeden Farbkanal aufgezeichnet wird. Wenn alle Parameter eingestellt sind, lassen Sie jede Probe genau ein oder zwei Minuten lang laufen. Nachdem die erste Messung für jedes Röhrchen abgeschlossen ist, mischen Sie 20 Mikroliter 10 %MP 40 in jede Probe und lesen Sie die Röhrchen für die gleiche Zeit erneut ab, um die Subtraktion der in der lysierten Probe festgestellten positiven Ereignisse über einen gleichen Zeitraum zu ermöglichen.

Um die extrazellulären Vesikel durch bead-basiertes Einfangen zu erkennen, beginnen Sie damit, unbeschichtete sechs Mikrometer Polystyrolkügelchen zweimal mit RPMI-Medien zu waschen, gefolgt von Resus in zwei Millilitern desselben. Als nächstes fügen Sie 6.000 Kügelchen zu jedem neuen Faxrohr hinzu, zu dem Negativkontrollröhrchen bei 400 Mikrolitern Medium, zu allen anderen Röhrchen je nach Bedarf 200 Mikroliter PPP oder extrazentrifugierte extrazelluläre Vesikel und 200 Mikroliter Medium. Stellen Sie das endgültige Volumen in jedem Röhrchen auf 400 Mikroliter ein.

Mit mehr Medien. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Waschen Sie die Kügelchen am nächsten Morgen mit zwei Millilitern Medium.

Der Überstand wird aspiriert und jede unspezifische Bindung mit 400 Mikrolitern 5%igem Rinderserumalbumin drei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Shaker blockiert. Waschen Sie die Kügelchen nach drei Stunden in zwei weiteren Millilitern Medium und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern frischem Medium. Filtern Sie nun die Antikörper und geben Sie das entsprechende Volumen des gefilterten Antikörpercocktails in jedes Röhrchen, und waschen Sie die Kügelchen nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius in weiteren zwei Millilitern Medien.

Diesmal werden die Pellets in 400 Mikrolitern Medium resuspendiert und die Proben sofort durch Durchflusszytometrie analysiert, wobei die Parameter für die Vorwärtsstreuung auf den niedrigsten vom Durchflusszytometer zugelassenen Schwellenwert eingestellt werden, wie gerade gezeigt. Zum Schluss wird die Singulett-Bead-Population eingeblendet und 2000 Ereignisse pro Probe erfasst. Sowohl die Einzel- als auch die Bead-basierte Nachweismethode können verwendet werden, um das Vorhandensein der extrazellulären Vesikel in den PPP-Proben nachzuweisen, wie in diesen Punktdiagrammen dargestellt. Für den individuellen Nachweisassay wird die lysierte Kontrolle verwendet, um die Gates für die entsprechende nicht gelistete Probe zu setzen.

Die Mehrzahl der Ereignisse sollte innerhalb des extrazellulären Vesikelgatters liegen. In dieser Abbildung zeigten diese Bi-Parameter-Diagramme beispielsweise den Nachweis der Marker CD 1 0 8 A und CD 2 35 A, bei denen es sich um zwei Marker für rote Blutkörperchen handelt, von denen bekannt ist, dass sie auf Zellen koexistieren. Wie erwartet, sind mehr als die Hälfte der positiven Ereignisse auf den extrazellulären Vesikeln positiv für beide Marker, während in diesen nach Parameterdiagrammen die extrazelluläre Vesikelexpression von zwei Markern, von denen bekannt ist, dass sie nicht koexistieren, auf Zellen mit der beadbasierten Detektionsmethode unterschiedliche separate positive Populationen aufweisen.

Es gibt keine Trennung zwischen der positiven und der negativen Population und Ereignisse treten in den doppelt positiven Quadranten auf, obwohl sie normalerweise nicht auf denselben Zelltypen zu finden sind, da beide Arten von extrazellulären Vesikeln an eine einzige Perle binden. Daher werden die Daten aus dieser Methode am besten anhand von Histogrammen analysiert, die mit den Negativkontrolldaten überlagert sind, wobei eine offensichtliche Verschiebung der Markerexpression in den beaded Proben im Vergleich zu den Kontrollen nach der Beherrschung beobachtet wird. Diese Technik kann verwendet werden, um 12 Blutproben mit drei Antikörper-Panels in drei bis vier Stunden mit der individuellen Nachweismethode oder in eineinhalb Tagen mit der Bead-Methode zu analysieren, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, bei der Behandlung jeder Probe konsistent zu sein und sicherzustellen, dass die Durchflussrate des Zytometers und die Fluoreszenzintensitäten zu Beginn jedes Experiments korrekt angepasst wurden, um den Versuchseinstellungen des Vortages zu entsprechen, insbesondere wenn mehrere Proben über mehrere Tage durchgeführt werden.