Name: Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives In-vitro- Experimental Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie 3D-neuronale Kulturen mit Mikroelektrodenarrays koppeln, um verbesserte elektrophysiologische Aufnahmen zu ermöglichen. Diese Methode nutzt Glas-Mikroperlen als Gerüst für physiologisch relevante Netzwerke.

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Die Autoren danken Giorgio Carlini für die technische Unterstützung bei der Entwicklung der Begrenzungsstruktur und Dott. Ornella LoBrutto für die gründliche Überarbeitung des Manuskripts. Die Forschung, die diese Ergebnisse hat die Finanzierung von 7. Rahmenprogramm der Europäischen Union erhalten (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers Schema) unter Finanzhilfevereinbarung 284.772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

Das experimentelle Protokoll wurde von der Europäischen Animal Care Gesetzgebung (2010/63 / EU), von der italienischen Gesundheitsministerium in Übereinstimmung mit dem DL 116/1992 von den Richtlinien der Universität Genua (Prot genehmigt. N. 13130, Mai 2011). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Zahl der Tiere, für das Projekt zu reduzieren und ihr Leiden zu minimieren. 1. Herstellung von Materialien und Unterstützungen <ol><li> Konstruieren Sie die Form, um die PDMS (Poly-Dimethyl-Siloxan) Einschränkung mit Hilfe einer CNC (Computer Numerical Control) Fräsmaschine zu bauen. Eine solche Form ist aus Polycarbonat mit dem zentralen Zylinder in Polytetrafluorethylen (PTFE) realisiert. Dieses Material ermöglicht eine einfachere Entnahme der Maske, sobald das PDMS ausgehärtet ist. HINWEIS: Das Design der Form wurde von Computer-Aided-Design (CAD) durchgeführt und dann an die CNC-Fräsmaschine ausgeliefert. </li><li> Bereiten Sie die PDMS-Elastomer. PDMS ist ein organisches Polymer. Er besteht aus zwei Elementen zusammengesetzt istEin Härtungsmittel und ein Polymer. Mischen sie von einem Volumenverhältnis von 1:10, wobei ein Teil des Härtungsmittels und neun Teile Polymer. Setzen Sie die beiden Komponenten in einer Petrischale, schütteln und legen Sie die Mischung in der Vakuumkammer für 10 Minuten, um Luftblasen zu beseitigen. 3 g PDMS ausreichend sind für eine Einschränkung. </li><li> Konstruieren Sie die PDMS-Einschränkung. Legen Sie die PDMS-Material in den Formgeber und legen Sie sie in den Ofen für 30 Minuten bei 120 ° C. Die PDMS-Einschränkung die Form eines idealen Zylinders mit einem äußeren und inneren Durchmesser von 22,0 und 3,0 mm betragen und einer Höhe von 650 um. </li><li> Am Tag vor dem Plattieren Paar der Maske auf den aktiven Bereich der Mikroelektrodenanordnungen (MEAs) mittels einer Pinzette unter einem Stereomikroskop und Sterilisieren der PDMS-Maske in einem Ofen bei 120 ° C. </li><li> Sterilisation der Mikroglaskugeln (Nenndurchmesser von 40 ± 2 um; zertifiziert mittleren Durchmesser von 42,3 ± 1,1 &amp; mgr; m) in 70% Ethanol für 2 h in einem konischen Röhrchen und drehen every 30 Minuten, um alle Mikrokügelchen freizulegen. </li><li> Entfernen Sie die Ethanol-Lösung aus dem Fläschchen und spülen Sie die Mikroperlen zweimal mit sterilem Wasser. </li><li> Konditionieren des zentralen Teils der MEA Bereich begrenzt durch die PDMS Maske (Durchmesser gleich 3,0 mm) mit 24 &amp; mgr; l der gemischten Lösung von Poly-D-Lysin und Laminin bei 0,05 ug / ml. </li><li> Beschichtung der Mikrokügelchen mit Adhäsionsproteine, Laminin und Poly-D-Lysin bei 0,05 ug / ml und lassen Sie sie über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C, um eine stabile und langanhaltende neuronale Netz zu erhalten. </li><li> Entfernen der Haftfaktoren sowohl von der Glasoberfläche der MEA und den Mikroglaskugeln. Aspirat etwa 95% der Beschichtungslösung mit einer Pipette und eine kleine Volumen- 24μl- sterilem Wasser auf der Oberfläche MEA. Saugen Sie wieder mehr als 95% des Wassers und lassen Sie die MEA trocken unter der laminaren Haube 1 Stunde vor dem Ausplattieren der Zellen. HINWEIS: Im Fall von Mikrokügelchen statt absaugen BeschichtungLösung und eine erste Wäsche mit sterilisiertem Wasser und ein zweiter mit dem Grundmedium und seine Ergänzung wie B27, um die Glasoberfläche, wo Neuronen plattierenden konditionieren. Lassen Sie sich nicht die Mikroperlen trocken. Lassen sie in Suspension in dem Kulturmedium im Inneren der Ampulle. </li><li> Verteilen, mittels einer Pipette -200 μl- die Suspension der behandelten Mikrokügelchen (ca. 32.000) auf einer Multiwellplatte mit Membraneinsatz (Porendurchmesser 0,4 um), wo sie selbstorganisieren Bildung einer gleichförmigen Schicht. </li><li> Füllen Sie jede auch der Membran mit 0,5 ml Medium, und steckte es in den Inkubator (T = 37,0 o C, CO 2 = 5%), bis die Neuronen sind bereit, plattiert werden (3.2). </li></ol> 2. Dissection von Embryonen und Dissoziation von Tissue <ol><li> Haus erwachsene weibliche Ratten (200-250 g) bei einer konstanten Temperatur (22 ± 1 ° C) und die relative Luftfeuchtigkeit (50%) im Rahmen eines regelmäßigen Hell-Dunkel-Zeitplan (licht auf 7.00 Uhr bis 19.00 Uhr) in derTierhaltung. Stellen Sie sicher, dass Lebensmittel und Wasser sind frei verfügbar. </li><li> Anesthetize eine schwangere weibliche Ratten nach 18 Tagen Entwicklung (E18) unter Verwendung von 3% Isofluran. Dann, zu opfern das Tier durch Genickbruch. </li><li> Entfernen hippocampi voneinander Rattenembryo und legen Sie sie in eiskaltes Hanks ausgewogener Salzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+. An Tag 18 der Entwicklung Hippocampus und Cortex Geweben sind sehr weich und müssen nicht in kleine Stücke geschnitten werden. Weitere Details können gefunden 18,19 werden. </li><li> Dissoziation des Gewebes in 0,125% Trypsin / Hanks-Lösung, die 0,05% DNAse für 18-20 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen der überstehenden Lösung mit einer Pasteurpipette und Stoppen der enzymatischen Verdau durch Zugabe von Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) für 5 min. </li><li> Entfernen Sie das Medium mit FBS und einmal mit dem Medium mit seiner zu ergänzen, zu 1% L-Glutamin, Gentamycin 10 ug / ml zu waschen. Entfernen Sie wieder das Medium mit einer Pasteur-pipette und füllen es wieder mit einer kleinen Menge (500 ul) des Wachstumsmediums mit seiner Ergänzung, 1% L-Glutamin, Gentamycin 10 ug / ml. </li><li> Dissoziieren die Gewebepellet mechanisch mit einem schmalen Pasteurpipette bis eine milchige Suspension von Zellen ist offensichtlich. Es ist nicht notwendig, die Zellsuspension zentrifugiert. </li><li> Verdünnen des geringen Volumens der Zellsuspension mit dem Wachstumsmedium, um ein Endvolumen von 2,0 ml zu erhalten. Zählen Sie die erhaltenen Zellkonzentration mit einem Hämocytometer Kammer. Verdünnte diese Konzentration in einer 1: 5, um die gewünschte Zellkonzentration von 600-700 Zellen / &amp; mgr; l zu erhalten. </li></ol> 3. Zell Plating <ol><li> Platten Zellen in einer Dichte von etwa 2000 Zellen / mm 2 auf die aktive Fläche der MEA von der PDMS Einschränkung definiert, um eine 2D neuronalen Netzwerks. Hinweis: Jeder Hippocampus etwa 5 x 10 5 Zellen enthält, (1 x 10 6 für einen einzigen Embryo). Sezieren 6 Embryonen auf einen Gesamtbetrag von 6 x 10 bekommen6 Zellen in 2 ml, und einer geschätzten Konzentration von 3.000 Zellen / &amp; mgr; l. Verdünnen Sie diese Konzentration bei 1: 5, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten und die Platte ca. 600-700 Zellen / ul. Wenn die MEA Bereich durch die PDMS-Einschränkung begrenzt ist etwa 7.065 mm 2, und die Gesamtzahl der plattierten Zellen 600 Zellen / ul x 24 &amp; mgr; l = 14.400 Zellen, die endgültige Dichte 2.038 Zellen / mm 2. </li><li> Platzieren der MEA Vorrichtungen in den Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre CO 2 (5%) bei 37 ° C. </li><li> Verteilen 160 ul der Suspension mit einer Zellkonzentration von 600-700 Zellen / ul (etwa 100.000 Zellen) auf die Oberfläche der Monoschicht Mikrokugeln im Inneren der Multiwell-Platten angeordnet, um die Vorstufe für den Aufbau von dreidimensionalen Kultur abzuschließen. Setzen die Multiwell-Platten im Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre CO 2 (5%) bei 37 ° C. </li></ol> 4. 3D-Neuronal Network Construction <ol><li> 6-8 Stunden nach der Plattierung, übertragen Sie die Suspension (Mikroperlen mit Neuronen) von den Multiwell-Platten sehr sorgfältig in den durch die PDMS-Einschränkung begrenzt durch die mit einer Pipette für ein Volumen von etwa 30-40 &amp; mgr; l eingestellt. Nach jeder Übertragung, warten Sie etwa eine halbe Minute, um die Mikroperlen zur Selbstorganisation in einem sechseckigen kompakten Aufbau zu ermöglichen. </li><li> Nachdem alle Schichten abgeschieden werden und sich spontan zusammengebaut, füllen Sie mit einem großen Tropfen von etwa 300 ul Medium die Spitze des von der PDMS-Einschränkung begrenzt. </li><li> Setzen die 3D-Struktur an die MEA gekoppelt im Inkubator (T = 37,0 ° C, CO 2 = 5%) für 48 Stunden, bevor eine endgültige Volumen (etwa 1 ml) des Wachstumsmediums Kultur mit Ergänzung. HINWEIS: Beachten Sie die Gesamtzahl der Perlen auf der Multiwell-Platten mit Membraneinsatz (30.000) und die Anzahl der Perlen auf einer einzigen Schicht auf die MEA-Gerät (6000). Die resultierende 3D-Struktur besteht aus 5 Schichten zusammengesetzt microbeads und Zellen. Unter Berücksichtigung, dass die 3D neuronalen Netzwerk nicht geometrisch vollkommen, könnte das resultierende 3D-Struktur von 5-8 Schichten bestehen. </li><li> Am Tag nach der Beschichtung, sorgfältig fügen Sie das endgültige Volumen des Mediums (etwa 900 ul) in der MEA-Ring. Aufrechterhaltung der 3D-Kulturen in einem befeuchteten CO 2 -Atmosphäre (5%) bei 37 ° C für 4-5 Wochen. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche. </li></ol> 5. konfokale Mikroskopie Acquisition <ol><li> Fixierung der biologischen Proben auf der Bühne des Mikroskops in einer Halterung. Stellen Sie den Laser (Argon, 496 bis 555 nm), der Abtastgeschwindigkeit (400 Hz), bei dem, um das Bild, das Gain und Offset (-0,3%) der PMT für jedes Bild zu erwerben, um die richtige Bandbreite Emissionsfilter und um zu erfassen um eine Sättigung zu vermeiden und um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Ergebnisteil meldet die verwendet werden, um die Bilder von 4 zu erwerben Werte. </li><li> Für den Erwerb der z -stack Sequenz, Tannest wählen, den Wert der z-Position der oberen und der unteren Schicht der Probe, und wählen Sie dann die Schrittweite auf die Übernahme vorzunehmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In dieser Arbeit wird eine neuartige experimentelle in vitro-Plattform aus 3D gemacht entwickelt neuronalen Kulturen auf MEAs für Netzwerk-Elektrophysiologie wurde vorgestellt gekoppelt. Die Verwendung von Mikrokügelchen als Gerüst, um das Auswachsen neuritischen entlang der z-Achse zu ermöglichen wurde maßgeschneidert, um mit der planaren MEA integriert werden. Auf diese Weise können die erhaltenen Mikrosystem ergibt eine gültige und zuverlässige in vitro- 3D-Modells, um die austretenden elek...

In vitro zweidimensionale (2D) neuronale Netze zu Micro-Elektroden-Arrays (MEAs) gekoppelt arethe Goldstandard angenommen, um das Zusammenspiel von neuronaler Dynamik und der zugrunde liegenden Konnektivität studieren experimentellen Modell. Bei der Entwicklung, Nervenzellen neu zu komplexen Netzwerken, die auch angezeigt werden definedspatio-temporalpatternsof Tätigkeit 1,2 (dh platzt, Netzwerk-Bursts, zufällige spiking Aktivität). MEAs erfassen die elektrophysiologische Aktivität von vielen Websites (von zehn bis Tausende von Mikroelektroden), so dass eine detaillierte Untersuchung der Dynamik zum Ausdruck auf Netzwerkebene. Darüber hinaus ist die Verwendung von dissoziierten Kulturen macht possibile, um technisch-Netzwerke zu entwerfen. Es ist einfacher, auf diese Weise zu verstehen, die funktionalen Beziehungen zwischen dem aufgezeichneten elektrophysiologische Aktivität und die Parameter der Netzwerkorganisation, wie Zelldichte 3 Grad an Modularität 4,5, Gegenwart heterogener neuronalen populations 6 usw. Aber alle in vitro-Studien auf distanzierte kultivierten Zellen werden auf 2D neuronale Netze. Dieser Ansatz führt zu Vereinfachungen in Bezug auf die in vivo (eigen 3-dimensional, 3D-System): (i) in einem 2D-Modell, Somata und Wachstumskegeln sind abgeflacht und die Axone-Dendriten Auswuchs kann nicht in allen Richtungen 7 verbreiten. (ii) 2D-in-vitro-Netzwerke weisen stereoelektrophysiologischen Dynamik durch Platzen Tätigkeit, die die meisten Neuronen des Netzes 8 dominiert. In jüngster Zeit verschiedene Lösungen entwickelt worden, um die Konstruktion von in-vitro-3D dissoziierten neuronalen Netzen zu ermöglichen. Die gemeinsame Idee besteht in der Schaffung eines Gerüsts, wo Nervenzellen können in einer 3D-Mode wachsen. Ein solches Gerüst kann mit Polymer-Gelen und festen porösen Matrizen 9-13 realisiert werden. Durch Ausnutzung der mechanischen Eigenschaften der Polymere ist es möglich, Zellen in thes einbettene Strukturen durch einen einheitlichen Block von 3D-Kulturen von Neurosphären 11 definieren. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die starre mechanische Eigenschaft der Neurosphären 9,12. Jedoch haben diese Materialien beschränkt Porosität, und sie garantieren nicht die Zellmigration in der Matrix. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist eine mögliche Lösung besteht im Trennen der Matrix in &quot;Einheit&quot; Modulen. Leider konnte die Größe und Form der Partikel Vielfalt Packung in regulären Schichtstrukturen zu behindern. In 7, Cullen und Mitarbeiter entwickelt einen 3D-neuronalen Konstrukt up von Neuronen und / oder Astrozyten innerhalb eines bioaktiven extrazellulären Matrix-basierten Gerüst gemacht. Eine solche konstruiert Nervengewebe in vitro Untersuchungen erlaubt, zu studieren und zu manipulieren neurobiologischen Reaktionen innerhalb von 3D-Mikro-Umgebungen. Dieses Modell besteht aus Neuronen und Gliazellen im gesamten extrazellulären Matrix (ECM) und / oder Hydrogel Gerüste (500-600 &amp; mgr; m dick) verteilt. In dieser Co5000 Zellen / mm 3 - ndition eine optimale Zelllebensfähigkeit (mehr als 90%) wurde durch Ausplattieren Zellen bei einer endgültigen Dichte von ungefähr 3,750 gefunden. Es ist zu beachten, dass eine solche Dichtewert ist viel niedriger als die in der in-vivo-Zustand, in dem die Zelldichte der Maus Hirnrinde als etwa 90000 Zellen / mm 3 14 werden. Um diese Einschränkung zu überwinden und Mitarbeiter Pautot 15 realisiert ein 3D in vitro System, in dem die Zelldichte und die Netzwerkverbindung gesteuert werden, um in vivo-Bedingungen ähnlich und ermöglichen eine Echtzeitabbildung des Netzwerks. In der Praxis wird diese Methode auf dem Konzept, das dissoziiert kultivierten Neuronen können auf Siliciumdioxid-Mikroperlen wachsen basiert. Diese Kügelchen eine Wachstumsoberfläche groß genug für neuronalen Zellkörpern zu haften und ihre Verzweigungen zu wachsen, reifen, zu erweitern und zu definieren synaptische Kontakte zu anderen Neuronen. Diese Methode nutzt die spontane Versammlung Eigenschaften von monodispersen Perlen form 3D-Schichten-hexagonalen Arrays mit verschiedenen Untergruppen von Neuronen auf verschiedenen Ebenen mit eingeschränkter Konnektivität zwischen Nervenzellen auf verschiedenen Perlen. Die erzielte Zelldichte bei diesem Verfahren betrug etwa 75.000 Zellen / mm 3. Vor kurzem haben wir Pautot Methode angepasst MEAs 16: Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die 3D-elektrophysiologische Aktivität stellt einen größeren Repertoire von Aktivitäten als die von 2D-Netze ausgedrückt. 3D reife Kulturen weisen eine verbesserte Dynamik in der sowohl Netzwerk-Burst und zufällige Spike-Aktivität koexistieren. Ähnlich Tang-Schomer und Mitarbeiter 17 realisiert eine Seidenproteinbasis poröse Gerüst, das eine primäre kortikale Kultur in vitro für einige Monate beibehält, und nahm die elektrophysiologische Aktivität mittels einer Wolfram-Elektrode. In dieser Arbeit wurden die experimentellen Verfahren, um 3D-neuronalen Netzen, um MEAs gekoppelt bauen beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>0,05 &Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>0,05 &Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>0,125 % verdünnt 1:2 in HBSS ohne CA++, MG++</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>0,05 % verdünnt&nbsp; in Hanks-Lösung</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21103049</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>2% Medium supplenant</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G.1272</td><td>5 mg/L</td></tr><tr><td>Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS)</td><td>Corning Sigma</td><td>481939</td><td>Härter und das Polymer</td></tr><tr><td>Micro-Electrode Arrays</td><td>Multi Channel Systems (MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA mit: Elektrodengitter 8x8; Elektrodenabstand und -durchmesser 200 und 30 & Mikro; m; Kunststoffring ohne Gewinde</td></tr><tr><td>Microbead</td><td>Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp; 1 gr Glasteil Größe Stds 40 & Mikro m</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar Sigma CLS</td><td>3413</td><td>Multiwell-Platten mit Membraneinsatz (6,5 mm Durchmesser, porös 0,4 &; Mikro; m)</td></tr><tr><td>HBSS ohne Ca++ ,Mg++&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Puffer Lösung&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Teflon</td><td>Sigma</td><td>430935-5G</td><td>Polytetrafluorethylen</td></tr><tr><td>Ratte</td><td>Sprague Dawley</td><td>Wistar Ratte</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskopie Aufrecht</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20.0x0.50 WASSER Objektiv</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40.0x0.80 WASSER Objektiv</td><td>Leica</td><td>Leica HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>25.0x0.95 WASSER Objektiv</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

schnittstellen 3d engineered neuronalen kulturen auf mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; in-vitro-</em&gt; experimental modell

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Derzeit sind großräumige Netzwerke, die von dissoziierten Neuronen abgeleitet sind, die in vitro auf extrazellulären Mikrowandlern wachsen und sich entwickeln, das Goldstandard-Versuchsmodell, um grundlegende neurophysiologische Mechanismen zu untersuchen, die an der Bildung und Aufrechterhaltung neuronaler Zellanordnungen beteiligt sind. In-vitro-Studien beschränkten sich jedoch auf die Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität, die von zweidimensionalen (2D) neuronalen Netzen erzeugt wird. Angesichts der komplexen Beziehung zwischen Struktur und Dynamik ist jedoch eine deutliche Verbesserung notwendig, um die Entstehung und die Entwicklungsdynamik von dreidimensionalen (3D) Netzwerken zu untersuchen. In dieser Arbeit wird eine neuartige experimentelle Plattform vorgestellt, in der 3D-Hippocampus- oder kortikale Netzwerke an planare Mikro-Elektroden-Arrays (MEAs) gekoppelt sind. 3D-Netzwerke werden realisiert, indem Neuronen in ein Gerüst aus Glasmikrokügelchen (30-40 μm Durchmesser) eingepflanzt werden, auf dem Neuronen wachsen und komplexe, miteinander verbundene 3D-Anordnungen bilden können. Auf diese Weise ist es möglich, konstruierte 3D-Netzwerke zu entwerfen, die aus 5-8 Schichten mit einer erwarteten endgültigen Zelldichte bestehen. Die zunehmende Komplexität in der morphologischen Organisation der 3D-Anordnung führt zu einer Verstärkung der elektrophysiologischen Muster, die von dieser Art von Netzwerken angezeigt werden. Im Vergleich zu den Standard-2D-Netzwerken, in denen eine stark stereotype Bursting-Aktivität auftritt, verändert die 3D-Struktur die Bursting-Aktivität in Bezug auf Dauer und Häufigkeit und ermöglicht die Beobachtung von zufälligerer Spike-Aktivität. In diesem Sinne ähnelt das entwickelte 3D-Modell eher in vivo neuronalen Netzen.

. In diesem experimentellen Verfahren wird eine relevante Rolle der Mikrokügelchen, die die mechanische Gerüst für das Wachstum des 3D neuronales Netzwerk definieren gespielt 1A und B-Anzeige, die die Anordnung der Mikrokügelchen (Nenndurchmesser von 40 ± 2 um; zertifiziert mittlere Durchmesser 42,3 ± 1,1 &amp; mgr; m) in der Ebene. Die Besonderheit solcher Strukturen besteht darin, daß Mikrokügelchen spontan selbst zusammensetzen, die einen kompakten hexagonalen Geometrie (1B und C). D...

In dieser Arbeit wird ein neuartiges experimentelles Modell, in dem 3D-Neuronenkulturen an planare Mikroelektrodenarrays (MEAs) gekoppelt sind, presented. 3D Netzwerke aufgebaut werden, indem Neuronen in ein Gerüst aus Glasmikrokügelchen eingepflanzt werden, auf dem Neuronen wachsen und miteinander verbundene 3D-Strukturen bilden.

Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein neuartiges Modell von in vitro dreidimensionalen neuronalen Netzwerken vorzustellen, die mit Mikroelektrodenarrays gekoppelt sind. Dies wird erreicht, indem zunächst der zentrale Bereich des MEA mit einer Mischlösung aus Poly-D-Lysin und Laminin konditioniert und anschließend die Mikroperlen mit den Adhäsionsproteinen Laminin und Polylysin beschichtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Suspension der behandelten Mikroperlen auf eine Mehrmuldenplatte zu verteilen, wo sie sich selbst organisieren und eine einheitliche Schicht bilden. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen pro Quadratmillimeter auf den aktiven Bereich der MEA aufzuplatzieren, um 2D-neuronale Netzwerke zu erzeugen. Sechs bis acht Stunden nach dem Auftragen wird die Suspension von den Mehrfach-Platten auf die MEA überführt, und die Mikroperlen können sich zu einer hexagonal dichten Struktur selbst organisieren. Abschließend wird die 3D-Netzwerke mittels konfokaler Mikroskopie visualisiert und mit den herkömmlichen 2D-neuronalen Netzwerken verglichen, die über der MEA gezüchtet wurden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie in vitro zweidimensionalen Zellkulturen, liegt darin, dass in einem zweidimensionalen Modell Somen und Wachstumskonen abgeflacht sind und die Axone sich nicht in alle Richtungen ausbreiten können. Außerdem dominiert eine Burstsaktivität die elektrophysiologischen Dynamiken zweidimensionaler Netzwerke, während in einem dreidimensionalen Netzwerk zusätzlich eine zufällige Spikingsaktivität auftritt. Wir hatten erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir die Forschungsarbeit von Sophie Potto lasen, die sie 2008 in Nature Methods veröffentlichte, in der sie MICROBITS als Gerüst zur Konstruktion dreidimensionaler neuronaler Netzwerke verwendete.Anschließend passten wir diese Methode an, um die ersten dreidimensionalen In-vitro-Aufnahmen durchzuführen. Zum Herstellen des PDMS-Elastomers mischen Sie den Härter und ein Polymer im Volumenverhältnis von eins zu neun in einer Petrischale. Schütteln Sie anschließend das Gemisch und geben Sie es für 10 Minuten in die Vakuumkammer, um Luftblasen zu entfernen.Um die PDMS-Abdeckung herzustellen, wird das PDMS-Material in die Form gegeben und anschließend für 30 Minuten bei 120 Grad Celsius in den Ofen gestellt. Die PDMS-Abdeckung sollte zylindrisch sein mit einem Außendurchmesser bzw. Innendurchmesser von 22,0 bzw. 3,0 Millimetern und einer Höhe von 650 µm am Tag vor der Zellplattierung. Die Maske wird unter einem Stereomikroskop mit dem aktiven Bereich der MEA gekoppelt und anschließend die PDMS-Maske im Ofen bei 120 Grad Celsius sterilisiert.Als Nächstes sterilisieren Sie die Glasperlen in einem kegelförmigen Gefäß mit 70 % Ethanol für zwei Stunden, wobei alle 30 Minuten rotiert wird, um sämtliche Perlen ausreichend zu benetzen. Entfernen Sie anschließend die Ethanol-Lösung aus dem Gefäß und spülen die Perlen zweimal mit sterilisiertem Wasser ab. Danach konditionieren Sie den zentralen Bereich des durch die PDMS-Maske begrenzten MEA-Gebiets mit 24 Mikrolitern einer Mischlösung aus Polylysin und Laminin mit einer Konzentration von 0,05 Mikrogramm pro Milliliter.Beschichten Sie die Mikroperlen mit Adhäsionsproteinen, Laminin und Polylysin bei 0,05 Mikrogramm pro Milliliter. Anschließend lagern Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius im Inkubator, um ein stabiles und langlebiges neuronales Netzwerk zu erhalten. Danach verteilen Sie die Suspension der behandelten Mikroperlen auf die Mehrfach-Well-Platte mit einem Membraneinsatz, wo sie sich selbständig anordnen und eine gleichmäßige Schicht bilden.Füllen Sie dann jedes Loch der Membran mit 0,5 Milliliter Medium. Stellen Sie es bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator, bis die Neuronen in diesem Schritt bereit zum Ansäen sind. Nachdem eine trächtige weibliche Ratte im 18. Tag der Embryonalentwicklung geopfert wurde, gewinnen Sie die Rattenembryonen und entfernen anschließend die Hippocampi von jedem Rattenembryo.Geben Sie sie in eiskalte Hanks-Lösung. Salzlösung ohne Calcium und Magnesium. Danach das Gewebe in 0,125 %iger Trypsin-Hanks-Lösung mit 0,05 %iger DNAse für 18 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius dissoziieren.Danach den Überstand mit einer Pasteurpipette entfernen. Die enzymatische Verdauung durch Zugabe von Medium mit 10 % FBS für fünf Minuten stoppen. Anschließend das Medium mit FBS entfernen und einmal mit dem Wachstumsmedium waschen, das mit 1 % L-Glutamin und Gentamycin bei 10 Mikrogramm pro Milliliter ergänzt ist.Entfernen Sie anschließend das Medium und füllen Sie es erneut mit 500 Mikrolitern Wachstumsmedium auf. Ergänzen Sie es mit 1 % L-Glutamin und Gentamycin in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter.L&ouml;sen Sie das Gewebepellet mechanisch mit einer engen PE-Pipette auf, bis eine milchige Zellsuspension sichtbar ist. Danach verd&uuml;nnen Sie ein kleines Volumen der Zellsuspension mit dem Wachstumsmedium, um ein Endvolumen von 2,0 Millilitern zu erhalten. Bestimmen Sie die erhaltene zellul&auml;re Konzentration mit der H&auml;mocytometerkammer.Verdünnen Sie diese Konzentration anschließend im Verhältnis 1:5, um die gewünschte Zellkonzentration von 600 bis 700 Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen pro Quadratmillimeter auf den aktiven Bereich der MEA, der durch die PDMS-Struktur vorgegeben ist, um ein zweidimensionales neuronales Netzwerk zu erzeugen. Danach stellen Sie die MEA-Vorrichtung in den Inkubator mit einer Atmosphäre aus 5 % feuchtem Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.Um den Vorversuch für den Aufbau einer 3D-Kultur abzuschließen, verteilen Sie 160&nbsp;Mikroliter der Suspension mit einer Zellkonzentration von 600 bis 700&nbsp;Zellen pro Mikroliter auf der Oberfläche der Mikroperlen-Monoschicht, die sich innerhalb der Mehrlochplatten befindet. Anschließend stellen Sie die Mehrlochplatten in den Inkubator mit einer feuchten Atmosphäre mit 5&nbsp;% Kohlendioxid bei 37&nbsp;°C. Sechs bis acht Stunden nach der Aussaat übertragen Sie 30 bis 40&nbsp;Mikroliter der Suspension mit Mikroperlen und Neuronen in den durch die PDMS-Abgrenzung definierten Bereich der MEA. Warten Sie nach jeder Übertragung etwa eine halbe Minute, damit sich die Mikroperlen zu einer hexagonalen Struktur selbst organisieren können.Nachdem alle Schichten abgeschieden wurden und sich spontan bei 300 Mikrolitern Medium auf der Oberfläche innerhalb der durch die PDMS-Struktur begrenzten Zone angeordnet haben, wird die mit der MEA verbundene 3D-Struktur für 48 Stunden in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gestellt. Danach wird ein Milliliter Wachstumsmedium mit Zusatzstoffen hinzugefügt. Nach dreiwöchiger Kultur in vitro ist die 3D-Struktur stabil, auch ohne die PDMS-Struktur, wie gezeigt.Hier ist ein DIC-Bild einer einzelnen Schicht von an die MEA-Oberfläche gekoppelten Perlen. Die Position der schwarzen Punkte stellt die räumliche Anordnung der Elektroden dar. Die immunfluoreszenzbasierende Färbung für Map2, die durch das rote Signal wiedergegeben wird, zeigt die Verteilung der dendritischen Verzweigung und der ADA der Neurone um die Mikroperlen herum an, die direkt mit der Elektrodenebene der MEA gekoppelt sind.Diese Aufnahme zeigt die Maximalprojektion einer Zack-Sequenz einer 3D-Kultur, die ein stark verzweigtes Netzwerk darstellt, in dem Neuronen für das neue N, exprimiert in reifen postmitotischen Neuronen, markiert sind, sowie für GABA. Hier ist eine repräsentative elektrophysiologische Ableitung der hippokampalen Netzwerke in 3D-Anordnung. Und hier ist eine repräsentative elektrophysiologische Ableitung der hippokampalen Netzwerke in 2D-Anordnung.Wenn der Ablauf einmal beherrscht ist, kann er in sieben Stunden durchgeführt werden. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass, da der Ablauf mehrere Schritte umfasst, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, die Zeitschätzung für die Durchführung des gesamten Verfahrens lediglich als Hinweis dient. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, zuerst eine 2D-Schicht aus diuretischen Neuronen auf die Elektrode des MEA zu säen und anschließend die Suspension aus Mikrobits und Neuronen sehr vorsichtig von der Mehrlochplatte auf das MEA zu übertragen, um die 3D-Struktur nach ihrer Entwicklung zu erzeugen.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Computer-Neurowissenschaften, um zu untersuchen, wie die Netzwerkverbindungen die entstehenden Netzwerkdynamiken prägen können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein in vitro dreidimensionales neuronales Netzwerk, das mit Mikroelektrodenarrays gekoppelt ist, aufbaut.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs.

Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs)

Dieses Video zeigt die Entwicklung einer 3D-Neuronenkultur, die mit einem planaren Mikroelektrodenarray mit Hippocampus-Neuronen gekoppelt ist. Die isolierten Neuronen bilden ein 2D-Netzwerk auf der aktiven Fläche des Mikroelektrodenarrays und haften an Glasmikrokügelchen in einer Multi-Well-Platte mit einem Membraneinsatz. Nach der Übertragung dieser mit Neuronen beschichteten Mikrokügelchen auf die Elektrode organisieren sie sich zu einem miteinander verbundenen neuronalen 3D-Netzwerk.

Aufbau dreidimensionaler neuronaler Netzwerke, die an Mikroelektrodenarrays gekoppelt sind

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verwendung des Multielektroden-Arrays (MEA) zur Messung der synaptischen Physiologie in 3D-Kokultur-Sphären. Diese Methode ermöglicht es, die Dynamik des neuronalen Netzwerks und die Burst-Aktivität des synaptischen Netzwerks in den 3D-Sphären zu verstehen.

Verwendung von Multielektroden-Arrays zur Messung der synaptischen Physiologie in 3D-Kokulturkugeln

Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll, um in vitro modulare Netzwerke aus räumlich beschränkt, funktionell miteinander verbundenen neuronalen wachsen. Eine Polymermaske zum Strukturieren einer Proteinschicht verwendet, um die zelluläre Adhäsion über die Kultivierungssubstrat zu fördern. Vernickelt Neuronen wachsen auf beschichteten Bereiche Gründung spontane Verbindungen und elektrophysiologische Aktivität zeigen.

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Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

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