Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives In-vitro- Experimental Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein neuartiges Modell von in vitro dreidimensionalen neuronalen Netzwerken zu präsentieren, die an Mikroelektrodenarrays gekoppelt sind. Dies wird erreicht, indem zunächst der zentrale Teil des MEA mit einer gemischten Lösung aus Poly-de-Lysin und Laminin konditioniert wird, dann die Mikrokügelchen mit Adhäsionsproteinen, Laminin und Polylysin überzogen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Suspension der behandelten Mikrokügelchen auf eine Multi-Well-Platte zu verteilen, wo sie sich selbst zusammensetzen und eine gleichmäßige Schicht bilden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen pro Quadratmillimeter auf die aktive Fläche des MEA aufzuplättieren, um neuronale 2D-Netzwerke zu erzeugen. Sechs bis acht Stunden nach der Beschichtung wird die Suspension von den Multi-Well-Platten auf die MEA übertragen und die Mikrokügelchen können sich in einer hexagonalen, kompakten Struktur selbst zusammensetzen. Letztendlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die 3D-Netzwerke zu visualisieren, die mit den herkömmlichen neuronalen 2D-Netzwerken verglichen werden, die über MEA gewachsen sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. in vitro BDI-dimensionalen Zellkulturen, besteht darin, dass in einem BDI-dimensionalen Modell Somata und Wachstumskegel abgeflacht sind, Andon und Rise sich nicht in alle Richtungen ausbreiten können. Darüber hinaus dominiert die Bursting-Aktivität die elektrophysiologische Dynamik von BDI-dimensionalen Netzwerken, während in einem dreidimensionalen Netzwerk auch eine zufällige Specking-Aktivität nebeneinander existiert. Die Idee zu dieser Methode kam uns zum ersten Mal, als wir die Forschungsarbeit von Sophie Potto lasen, die sie 2008 in Nature Method veröffentlichte, in der sie MICROBITS als Gerüst verwendete, um dreidimensionale NE-Netzwerke aufzubauen.

Diese Methode haben wir dann bei mir angepasst, um die ersten dreidimensionalen in vitro Aufnahmen zu machen. Zur Herstellung des PDMS-Elastomers mischen Sie das Härter und ein Polymer in einem Volumenverhältnis von eins zu neun in einer Petrischale. Schütteln Sie dann die Mischung und legen Sie sie für 10 Minuten in die Vakuumkammer, um Luftblasen zu entfernen.

Um die PDMS-Randbedingung zu konstruieren, legen Sie das PDMS-Material in die ältere Formmaschine und stellen Sie es für 30 Minuten bei 120 Grad Celsius in den Ofen. Die PDMS-Randbedingung sollte am Tag vor der Beschichtung die Form eines Zylinders mit einem Außen- und Innendurchmesser von 22,0 bzw. 3,0 Millimetern und einer Höhe von 650 Mikrometern haben. Koppeln Sie die Maske unter einem Stereomikroskop an den aktiven Bereich der MEA und sterilisieren Sie die PDMS-Maske dann im Ofen bei 120 Grad Celsius.

Sterilisieren Sie anschließend die Glasmikrokügelchen in einem konischen Fläschchen mit 70 % Ethanol für zwei Stunden und drehen Sie sie alle 30 Minuten, um anschließend alle Mikrokügelchen freizulegen. Nehmen Sie die Ethanollösung aus der Durchstechflasche und spülen Sie die Mikrokügelchen zweimal mit sterilisiertem Wasser ab. Konditionieren Sie dann den zentralen Teil des MEA-Bereichs, der durch die PDMS-Maske begrenzt ist, mit 24 Mikrolitern gemischter Lösung aus Polylysin und Laminin bei 0,05 Mikrogramm pro Milliliter.

Beschichten Sie die Mikrokügelchen mit Adhäsionsproteinen, Laminat und Polylysin in einer Dosierung von 0,05 Mikrogramm pro Milliliter. Legen Sie sie anschließend über Nacht bei 37 Grad Celsius in den Inkubator, um ein stabiles und langlebiges neuronales Netzwerk zu erhalten. Verteilen Sie anschließend die Suspension der behandelten Mikrokügelchen auf der Multi-Well-Platte mit einem Membraneinsatz, wo sie sich selbst zusammensetzen und eine einheitliche Schicht bilden.

Füllen Sie dann jede Vertiefung der Membran mit 0,5 Millilitern Medium. Legen Sie es bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator, bis die Neuronen bereit sind, in diesem Schritt plattiert zu werden. Nachdem Sie eine trächtige weibliche Ratte E 18 geopfert haben, entnehmen Sie die Rattenembryonen und entfernen Sie dann die Nilpferd-Campi von jedem Rattenembryo.

Legen Sie sie in eiskalte Stränge. Balance Salzlösung ohne Calcium und Magnesium. Als nächstes dissoziieren Sie das Gewebe 18 bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 0,125 % Tryin-Hanks-Lösung, die 0,05 % DNA enthält.

Entfernen Sie danach den Überstand mit einer Peorpipette. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie fünf Minuten lang Medium mit 10 % FBS hinzufügen. Entfernen Sie dann das Medium mit FBS und waschen Sie es einmal mit dem Wachstumsmedium, seinem Zusatz 1%L-Glutamin und Gentamycin bei 10 Mikrogramm pro Milliliter.

Entfernen Sie anschließend das Medium. Füllen Sie es wieder mit 500 Mikrolitern Wachstum auf. Mittel. Seine Ergänzung besteht aus 1%L-Glutamin und Gentamycin mit 10 Mikrogramm pro Milliliter.

Dissoziieren Sie das Gewebepellet mechanisch mit einer schmalen PE-Pipette, bis eine milchige Suspension der Zellen erkennbar ist. Danach wird ein kleines Volumen der Zellsuspension mit dem Wachstumsmedium verdünnt, um ein Endvolumen von 2,0 Millilitern zu erhalten. Zählen Sie die erhaltene Zellkonzentration mit der Hämozytometerkammer.

Verdünnen Sie dann diese Konzentration im Verhältnis eins zu fünf, um die gewünschte Zellkonzentration von 600 bis 700 Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Plattieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 2000 Zellen pro Quadratmillimeter auf den aktiven Bereich der MEA, der durch die PDMS-Einschränkung definiert ist, um ein neuronales 2D-Netzwerk zu erstellen. Legen Sie anschließend das MEA-Gerät in den Inkubator mit 5 % befeuchteter Kohlendioxidatmosphäre bei 37 Grad Celsius.

Um den vorbereitenden Schritt für den Aufbau der 3D-Kultur abzuschließen, verteilen Sie 160 Mikroliter der Suspension mit einer Zellkonzentration von 600 bis 700 Zellen pro Mikroliter auf die Oberfläche der Mikrokügelchen-Monoschicht, die sich in den Multi-Well-Platten befindet. Legen Sie dann die Multiwell-Platten in den Inkubator mit 5 % befeuchteter Kohlendioxidatmosphäre bei 37 Grad Celsius, sechs bis acht Stunden nach dem Plattieren übertragen Sie 30 bis 40 Mikroliter der Suspension mit Mikrokügelchen und Neuronen in den durch die PDMS-Einschränkung begrenzten Bereich der MEA. Warten Sie nach jedem Transfer etwa eine halbe Minute, damit sich die Mikrokügelchen in einer sechseckigen Struktur selbst zusammensetzen können.

Sobald alle Schichten abgeschieden und spontan bei 300 Mikrolitern Medium auf der Oberseite des durch die PDMS-Einschränkung begrenzten Bereichs zusammengesetzt sind. Legen Sie die 3D-Struktur, die an das MEA gekoppelt ist, 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator. Danach fügen Sie nach drei Wochen in vitro einen Milliliter Wachstumsmedium mit seinem Präparat hinzu, die 3D-Struktur ist auch ohne die gezeigte PDMS-Einschränkung stabil.

Hier ist ein DIC-Bild einer einzelnen Schicht von Kügelchen, die an die MEA-Oberfläche gekoppelt sind. Die Position der schwarzen Punkte stellt die räumliche Anordnung der Elektroden dar. Die Immunfluoreszenzfärbung für Karte zwei, die durch das rote Signal reflektiert wird, zeigt die Verteilung der dendritischen Arborisation und ADA der Neuronen um die Mikrokügelchen, die direkt an die Elektrodenebene der MEA gekoppelt sind.

Dieses Bild zeigt die maximale Projektion einer Zack-Sequenz einer 3D-Kultur, die ein hochgradig vernetztes Netzwerk zeigt, in dem Neuronen für neues N markiert sind, das in reifen postmitotischen Neuronen exprimiert wird. Und für Gaba hier die repräsentative elektrophysiologische Aufzeichnung der Hippocampus-Netzwerke in 3D-Konfiguration. Und hier ist die repräsentative elektrophysiologische Aufzeichnung der Hippocampus-Netzwerke in 2D-Konfiguration.

Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in sieben Stunden durchgeführt werden. Es ist jedoch erwähnenswert, dass, da das Verfahren aus mehreren Schritten besteht, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, die Zeitschätzung für die Durchführung des gesamten Verfahrens nur ein Anhaltspunkt ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zuerst eine 2D-Schicht Neuronendiuretikum auf die Elektrode der Mea zu plattieren und dann die Suspension der Mikrobits und des Neurons sehr sorgfältig von der Multi-Well-Platte auf die Mea zu übertragen, um die 3D-Struktur nach ihrer Entwicklung zu realisieren.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Computational Neuroscience, um zu untersuchen, wie Netzwerkkonnektivität die entstehende Netzwerkdynamik beeinflussen kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein dreidimensionales neuronales In-vitro-Netzwerk aufbaut, das mit Mikroelektrodenarrays gekoppelt ist.