Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von mikrogewebetechnischen neuronalen Netzen oder Mikro-TENNs, bei denen es sich um dreidimensionale Miniaturkonstrukte handelt, die aus lang ausgerichteten axonalen Bahnen bestehen, die diskrete neuronale Populationen innerhalb des Lumens eines röhrenförmigen Hydrogels überspannen. Mikro-TENNs replizieren die allgemeine Anatomie des Konnektoms des Gehirns, insbesondere funktionell ähnliche Gruppen von Neuronen, die durch lange axonale Bahnen verbunden sind. Da sie vorgezüchtet sind, um die Zytoarchitektur von Gehirnbahnen nachzuahmen, können Mikro-TENNs für die gezielte Rekonstruktion von neuronalen Schaltkreisen eingesetzt werden, die aufgrund von Traumata oder neurodegenerativen Erkrankungen verloren gegangen sind, und als biofidele Modelle für neurobiologische Studien.

Einer der herausforderndsten Aspekte dieses Protokolls ist die Arbeit mit dem Formfaktor im Mikrometerbereich, der letztendlich notwendig ist, um eine minimalinvasive Verabreichung in das Gehirn zu ermöglichen. Beginnen Sie damit, die Glaskapillarröhrchen manuell in 2 bis 2,5 Zentimeter große Fragmente zu brechen, und führen Sie eine Akupunkturnadel in jedes Fragment ein. Übertragen Sie einen Milliliter mit drei Prozent Agarose in DPBS auf die Oberfläche einer leeren Petrischale.

Halten Sie das Kapillarrohr in der eingeführten Nadel und bringen Sie ein Ende des Röhrchens in Kontakt mit dem flüssigen Agarosepool, um es durch Kapillarwirkung zu füllen. Wenn die Flüssigkeit nicht mehr aufsteigt, nehmen Sie das Kapillarrohr aus dem Becken und legen Sie es waagerecht auf die Oberfläche einer Petrischale. Legen Sie dann Daumen und Zeigefinger auf beide Seiten des Schlauchs und fassen Sie ihn fest.

Ziehen Sie die Nadel mit der anderen Hand schnell heraus, während Daumen und Zeigefinger verhindern, dass die Mikrosäule selbst aus der Röhre rutscht. Führen Sie dann eine 30-Gauge-Nadel in das Kapillarrohr ein, um die Mikrosäule langsam in eine Schale mit DPBS zu drücken. Übertragen Sie eine Mikrosäule vorsichtig mit einer feinen Pinzette aus dem DPBS in eine leere Schale.

Geben Sie 10 Mikroliter DPBS mit einer Mikropipette auf die Oberseite der Mikrosäule, um ein Austrocknen zu verhindern. Während Sie unter einem Stereomikroskop arbeiten, lösen Sie die Mikrosäule mit einem Mikroskalpell aus, um sie auf die gewünschte Länge zu kürzen. Übertragen Sie dann die getrimmte Mikrosäule mit einer feinen Pinzette in eine andere Petrischale, die DBPS enthält.

Sterilisieren Sie die Mikrosäulen in den DPBS-haltigen Petrischalen 30 Minuten lang unter ultraviolettem Licht. Verwenden Sie einen Bohrer, um 16 Löcher als 4 Zentimeter großes 4 x 4 Array mit einem Abstand von 1 Zentimeter in den Deckel einer 10 Zentimeter großen Petrischale zu stechen. In einem chemischen Abzug können Sie mit dem unteren Teil einer Petrischale 27 Gramm PDMS und drei Gramm Härter

Mit einem Mikrospatel umrühren, um das Mittel gleichmäßig zu verteilen. Decken Sie dann das PDMS-Härtungsmittel mit dem durchstochenen Deckel ab. Schließen Sie ein Ende eines Schlauchs an den Vakuumanschluss des Abzugs an und stecken Sie das andere Ende in den Schaft eines Trichters geeigneter Größe.

Setzen Sie eine 1-Milliliter-Pipettenbirne auf einer 1-Milliliter-Spitze in den Schlauch ein und ziehen Sie den Schlauch nach oben, bis die Glühbirne den Schlauch im Stiel des Trichters abdichtet. Setzen Sie anschließend den Trichter auf den durchstochenen Schalendeckel und befestigen Sie den Schlauch mit einer vorhandenen stabilen Halterung. Öffnen Sie das Vakuumventil fünf Minuten lang, um die Luftblasen abzusaugen und an die Oberfläche zu bringen.

Schließen Sie nach fünf Minuten das Ventil, entfernen Sie den Trichter und schlagen Sie die Petrischale einige Male gegen die Oberfläche des Abzugs, um alle verbleibenden Luftblasen zum Platzen zu bringen. Platzieren Sie eine pyramidenförmige, 3D-gedruckte Form in jeder Vertiefung in einer 12-Well-Kulturplatte, wobei die Pyramiden nach oben zeigen. Gießen Sie dann das PDMS-Härtungsmittel auf die Formen, bis jede Vertiefung der Platte gefüllt ist.

Den abgedeckten Teller für eine Stunde bei 60 Grad Celsius zum Trocknen in einen Ofen geben. Nachdem Sie die PDMS-Arrays durch Autoklavieren sterilisiert und in einer Biosicherheitswerkbank gearbeitet haben, setzen Sie in jeder Vertiefung einer sterilen 12-Well-Platte ein Mikro-Well-Array ein. Um die neuronalen Aggregate zu bilden, verwenden Sie ein Mikropipettiert, um 12 Mikroliter Zellsuspension in jede Mikrovertiefung des PDMS-Arrays zu geben.

Die Platte wird fünf Minuten lang bei 200 g Celsius zentrifugiert, um die Aggregation der Zellen am Boden der Mikrovertiefungen zu erzwingen. Geben Sie dann vorsichtig etwa zwei Milliliter Kulturmedium auf die Oberseite jedes PDMS-Arrays, um alle ausgesäten Mikrowells zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte 12 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Um mit der Herstellung des CEM-Kerns zu beginnen, mischen Sie Typ-1-Kollagen, Laminin und Kulturmedium in einem Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 bis 7,4 ein. Legen Sie dann das Röhrchen mit CEM auf Eis. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Mikrosäulen in leere 35- oder 60-Millimeter-Petrischalen zu überführen.

Verwenden Sie dann bei der Arbeit unter einem Stereomikroskop eine 10-Mikroliter-Spitze, die an einer 1000-Mikroliter-Spitze befestigt ist, um verbleibende DPBS und Luftblasen aus dem Lumen zu entfernen. Ziehen Sie schnell vier bis fünf Mikroliter CEM in eine Mikropipettierung, platzieren Sie dann die Spitze des Mikropipettierten an einem Ende einer Mikrosäule und geben Sie genügend CEM ab, um das Lumen zu füllen. Um eine Austrocknung zu verhindern, fügen Sie zwei Mikroliter CEM um jede Mikrosäule hinzu.

Inkubieren Sie die Hydrogel-CEM-Mikrosäulen in Petrischalen bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid für 15 Minuten. Fahren Sie unmittelbar nach der Inkubation mit der Zellaussaat fort. Etwa 10 bis 20 Mikroliter Nährmedium werden in zwei freie Bereiche in den Petrischalen gegeben, in denen sich die Mikrosäulen befinden.

Sammeln Sie mit einer Mikropipette die neuronalen Aggregate einzeln und übertragen Sie sie in die Petrischale, in der sich die Konstrukte befinden. Bewegen Sie die Aggregate mit einer Pinzette in einen der kleinen Pools mit Kulturmedium, um die Zellgesundheit zu erhalten. Verwenden Sie bei der Beobachtung unter einem Stereomikroskop eine Pinzette, um ein Aggregat an einem Ende der Mikrosäulen für unidirektionale Mikro-TENNs oder an jedem Ende für bidirektionale Architektur einzuführen.

Bringen Sie dann die ausgesäte Mikrosäule in den anderen kleinen Pool mit Kulturmedium, um eine Austrocknung zu vermeiden und die Gesamtgesundheit zu erhalten. Wenn alle Mikrosäulen geladen sind, inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, damit die Aggregate am CEM haften können. Nach der Inkubation ist mit dem Stereomikroskop zu überprüfen, ob die Aggregate an den Enden der Mikrosäulen verbleiben.

Zum Schluss werden die Petrischalen mit den Mikro-TENNs vorsichtig mit einer Pipette mit Nährmedium geflutet. Stellen Sie die Schalen in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid für die Langzeitkultur. Diese Phasenkontrastbilder zeigen unidirektionale 2 Milliliter lange Mikro-TENNs bis zu acht Tage in vitro.

In diesen Bildern sind die neuronalen Aggregate an den Enden der Mikrosäule zu sehen, während die ausgerichteten axonalen Bahnen über das Lumen projizieren. Wie hier zu sehen, erstrecken sich die Axonbahnen in vitro fast über die gesamte Länge der Mikrosäule um fünf Tage. Bei bidirektionalen 5-Millimeter-Mikro-TENNs bevölkern axonale Bahnen die Länge der Mikrosäule nach 5 Tagen in vitro, und diese Architektur wird mindestens bis 10 Tage in vitro beibehalten.

Die folgenden beiden Abbildungen können bei der Behebung von Problemen mit dem Verfahren helfen. Dieses Bild zeigt eine vollständig dehydrierte getrocknete Hydrogel-Mikrosäule als Ergebnis der vollständigen Entfernung und/oder Verdampfung von DPBS, CEM oder Kulturmedium während der Herstellung. Dieses Bild zeigt eine Mikrosäule, bei der das Lumen die Außenwand auskleidet, da die Akupunkturnadel nicht konzentrisch mit dem Kapillarrohr

Schließlich zeigt dieses konfokale Bild ein bidirektionales Mikro-TENN nach 28 Tagen in vitro, gefärbt für Zellkerne mit Hoechst in blau, mit Axonen, die mit tudge eins in rot markiert sind, und präsynaptischen Boutons, die mit Synapsin 1 in grün markiert sind. Die Zellmigration von den Aggregaten entlang der axonalen Bahnen wird in Gegenwart von präsynaptischen Terminalien beobachtet, wie vermutet. Mikro-TENNs sind in sich geschlossene, anatomisch inspirierte Konstrukte, die Schlüsselaspekte der Konnektom-Zytoarchitektur nachahmen; daher könnten Mikro-TENNs ein Mittel sein, um verlorene neuronale Bahnen bei der Implantation in das Gehirn zu ersetzen.

Zu den entscheidenden Komponenten dieser Methode gehören das tubuläre Biomaterial-Encasement-Schema, das ein longitudinales axonales Wachstum ermöglicht, und die Aggregatmethode, die sicherstellt, dass die richtige Zytoarchitektur von Zellkörpern erreicht wird, die auf die Enden der axonalen Bahnen entlang des Innenraums beschränkt ist. Nach der Beherrschung dieser Methoden können die Prinzipien dieser Technik angewendet werden, um Mikro-TENNs mit anderen Zellphänotypen und Biomaterialkomponenten zu bilden, je nach spezifischer Anwendung.