Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von mikrovernetzten, gewebeengineerten neuronalen Netzwerken oder Mikro-TENNs, die winzige dreidimensionale Konstrukte darstellen, bestehend aus langen, ausgerichteten axonalen Trakten, die diskrete neuronale Populationen innerhalb des Lumens eines tubulären Hydrogels verbinden. Mikro-TENNs bilden die allgemeine Systemebenen-Anatomie des Hirn-Connectoms nach, insbesondere funktionell ähnliche Gruppen von Neuronen, die durch lange axonale Trakte verbunden sind. Da sie vorab gezüchtet werden, um die Zytoarchitektur von Hirnbahnen nachzuahmen, können Mikro-TENNs zur gezielten Rekonstruktion neuronaler Schaltkreise eingesetzt werden, die durch Traumata oder neurodegenerative Erkrankungen verloren gegangen sind, sowie als biofidele Modelle für neurobiologische Untersuchungen.

Einer der anspruchsvollsten Aspekte dieses Protokolls ist das Arbeiten mit der mikronskalierten Form, die letztendlich erforderlich ist, um eine minimalinvasive Applikation ins Gehirn zu ermöglichen. Beginnen Sie damit, Glas-Kapillarrohre manuell in Fragmente von 2 bis 2,5 Zentimeter Länge zu zerbrechen, und führen Sie jeweils eine Akupunkturnadel in jedes Fragment ein. Übertragen Sie ein Milliliter dreiprozentiges Agarose in DPBS auf die Oberfläche einer leeren Petrischale.

Halten Sie die Kapillare in der eingebrachten Nadel und bringen Sie ein Ende der Kapillare mit dem flüssigen Agarosebad in Kontakt, um sie durch Kapillarwirkung zu füllen. Wenn die Flüssigkeit aufhört, weiter aufzusteigen, nehmen Sie die Kapillare aus dem Bad und legen Sie sie horizontal auf die Oberfläche einer Petrischale. Legen Sie danach Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten der Kapillare an und greifen Sie fest zu.

Verwenden Sie die andere Hand, um die Nadel schnell herauszuziehen, während Daumen und Zeigefinger verhindern, dass die Mikrosäule selbst aus dem Röhrchen gleitet. Stecken Sie dann eine 30-Gauge-Nadel in das Kapillarröhrchen, um die Mikrosäule langsam in eine Schale mit DPBS herauszudrücken. Übertragen Sie vorsichtig eine Mikrosäule von DPBS mit feinen Pinzetten in eine leere Schale.

Geben Sie 10 Mikroliter DPBS mit einer Mikropipette auf die Oberseite der Mikrosäule, um Austrocknung zu verhindern. Kürzen Sie unter einem Stereomikroskop die Mikrosäule mit einem mikrochirurgischen Skalpell auf die gewünschte Länge. Übertragen Sie die gekürzte Mikrosäule anschließend mit feinen Pinzetten in eine andere Petrischale, die DBPS enthält.

Die Mikrosäulen in den mit DPBS gefüllten Petrischalen 30 Minuten lang unter UV-Licht sterilisieren. Mit einem Bohrer 16 Löcher in einem 4 cm großen 4-mal-4-Array mit einem Abstand von 1 cm in den Deckel einer 10 cm großen Petrischale bohren. Im chemischen Abzug das Bodenteil einer Petrischale verwenden, um 27 Gramm PDMS und 3 Gramm Härter abzuwiegen.

Unterrühren mit einem Mikrospatel, um den Wirkstoff gleichmäßig zu verteilen. Danach die PDMS-Härtungskomponente mit dem durchstochenen Deckel abdecken. Eines der Enden eines Schlauchs mit dem Vakuumanschluss der Abzugshaube verbinden und das andere Ende in den Stiel eines passenden Trichters einführen.

Setzen Sie eine 1-Milliliter-Pipettenspritze mit einer 1-Milliliter-Spitze in den Schlauch ein und ziehen Sie den Schlauch nach oben, bis die Spritze den Schlauch im Stiel des Trichters abdichtet. Stellen Sie anschließend den Trichter auf den durchstochenen Schalenboden und sichern Sie den Schlauch mit einer geeigneten stabilen Halterung. Öffnen Sie das Vakuumventil für fünf Minuten, um durch Absaugen die Luftblasen an die Oberfläche zu bringen.

Nach fünf Minuten das Ventil schließen, den Trichter entfernen und die Petrischale einige Male gegen die Oberfläche des Abzugs schlagen, um verbliebene Luftblasen zu zerstören. Einen pyramidenförmigen, 3D-gedruckten Formkern in jedes der Gefäße einer 12-Loch-Kulturplatte einsetzen, wobei die Pyramiden nach oben zeigen. Anschließend das PDMS-Härtemittel auf die Formkerne gießen, bis jedes Gefäß der Platte gefüllt ist.

Überführen Sie die abgedeckte Platte für eine Stunde bei 60 Grad Celsius in einen Ofen, um sie zu trocknen. Nach der Sterilisation der PDMS-Arrays durch Autoklavieren und unter Arbeit in einem Biosicherheitswerkbank, setzen Sie ein Mikro-Loch-Array in jedes Loch einer sterilen 12-Loch-Platte ein. Um die neuronalen Aggregate zu bilden, geben Sie mit einer Mikropipette 12 µL Zellsuspension in jedes Mikroloch des PDMS-Arrays.

Zentrifugieren Sie die Platte mit 200 × g für fünf Minuten, um die Aggregation der Zellen am Boden der Mikrovertiefungen zu bewirken. Geben Sie anschließend vorsichtig etwa zwei Milliliter Kulturmedium auf jede PDMS-Anordnung, um alle besiedelten Mikrovertiefungen zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte 12 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Um die Herstellung des CEM-Kerns zu beginnen, mischen Sie Typ-1-Kollagen, Laminin und Kulturmedium in einem Mikrozentrifugenröhrchen und stellen den pH-Wert auf 7,2 bis 7,4 ein. Anschließend stellen Sie das Röhrchen mit dem CEM auf Eis. Übertragen Sie mit sterilen Pinzetten die Mikrosäulen in leere Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 oder 60 Millimetern.

Danach unter einem Stereomikroskop mit einer an einen 1000-Mikroliter-Tipp angeschlossenen 10-Mikroliter-Spitze restliches DPBS und Luftblasen aus dem Lumen entnehmen. Schnell vier bis fünf Mikroliter CEM mit einer Mikropipette aufziehen, dann die Spitze der Mikropipette an einem Ende einer Mikrosäule platzieren und so viel CEM abgeben, dass das Lumen gefüllt ist. Um Austrocknung zu verhindern, jeweils zwei Mikroliter CEM um jede Mikrosäule herum hinzufügen.

Inkubieren Sie die Hydrogel-CEM-Mikrosäulen in Petrischalen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 15 Minuten. Fahren Sie unmittelbar nach der Inkubation mit der Zellseeding fort. Übertragen Sie etwa 10 bis 20 Mikroliter Kulturmedium auf zwei freie Bereiche in den Petrischalen, die die Mikrosäulen enthalten.

Verwenden Sie eine Mikropipette, um die neuronalen Aggregate einzeln aufzusammeln, und überführen Sie sie in die Petrischale mit den Konstrukten. Bewegen Sie die Aggregate mit einer Pinzette auf einen der kleinen Tropfen Kulturmedium, um die Zellgesundheit zu erhalten. Beobachten Sie unter einem Stereomikroskop und verwenden Sie die Pinzette, um ein Aggregat an einem Ende der Mikrosäulen für unidirektionale micro-TENNs oder an beiden Enden für eine bidirektionale Architektur einzufügen.

Bringen Sie dann die besiedelte Mikrosäule in einen anderen kleinen Tropfen Kulturmedium, um Austrocknung zu vermeiden und die Gesundheit der Aggregate zu erhalten. Sobald alle Mikrosäulen beladen sind, inkubieren Sie sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, damit die Aggregate an der CEM haften können. Überprüfen Sie nach der Inkubation mithilfe des Stereomikroskops, ob die Aggregate an den Enden der Mikrosäulen verblieben sind.

Zuletzt überschwemmen Sie die Petrischalen, die die mikro-TENNs enthalten, vorsichtig mit Kulturmedium unter Verwendung einer Pipette. Stellen Sie die Schalen für die Langzeitkultur in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Diese Phasenkontrastbilder zeigen unidirektionale, 2 Milliliter lange mikro-TENNs bis zu acht Tage lang in vitro.

Beachten Sie in diesen Bildern die neuronalen Aggregate an den Enden der Mikrosäule, während die ausgerichteten axonalen Bahnen sich über das Lumen erstrecken. Wie hier zu sehen, erstrecken sich die axonalen Bahnen innerhalb von fünf Tagen in-vitro nahezu über die gesamte Länge der Mikrosäule. Bei 5-Millimeter-Bidirektionalen Mikro-TENNs besiedeln axonale Bahnen die gesamte Länge der Mikrosäule nach 5 Tagen in-vitro, und diese Architektur bleibt mindestens bis zu 10 Tagen in-vitro erhalten.

Die folgenden beiden Bilder können bei der Fehlersuche im Verfahren hilfreich sein. Dieses Bild zeigt eine vollständig ausgetrocknete, dehydrierte Hydrogel-Mikrosäule infolge der vollständigen Entfernung und/oder Verdunstung von DPBS, CEM oder Kulturmedium während der Herstellung. Dieses Bild zeigt eine Mikrosäule mit einem Lumen, das entlang der Außenwand verläuft, bedingt durch die fehlende konzentrische Ausrichtung der Akupaknadel zur Kapillarröhre.

Schließlich zeigt dieses konfokale Bild einen bidirektionalen micro-TENN nach 28 Tagen in vitro, angefärbt für Zellkerne mit Hoechst in Blau, Axone markiert mit Tuj1 in Rot und präsynaptische Boutons markiert mit Synapsin 1 in Grün. Die Zellmigration aus den Aggregaten entlang der axonalen Bahnen ist in Gegenwart präsynaptischer Endigungen sichtbar, wie vorgeschlagen. Micro-TENNs sind autarke, anatomisch inspirierte Konstrukte, die zentrale Aspekte der zytoarchitektonischen Organisation des Connectoms nachahmen; daher könnten micro-TENNs eine Möglichkeit bieten, verlorene neuronale Verbindungswege durch Implantation ins Gehirn zu ersetzen.

Wesentliche Bestandteile dieser Methode sind das röhrenförmige Biomaterial-Ummantelungskonzept, das ein longitudinales axonalen Wachstum ermöglicht, sowie die Aggregatmethode, die sicherstellt, dass die richtige Zytoarchitektur der Zellkörper erzielt wird, die entlang des Innenraums auf die Enden der axonalen Trakte beschränkt sind. Nach Beherrschung dieser Methoden können die Prinzipien dieser Technik angewendet werden, um mikroskalige TENNs mit anderen Zellphänotypen und Biomaterialkomponenten je nach spezifischer Anwendung herzustellen.