Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zelluläre Mikroumgebungen zu schaffen, um biologische Fragestellungen im Zusammenhang mit individuellem und kollektivem Zellverhalten zu untersuchen, das auf mikro- und nanoskaligen Dimensionen stattfindet. Dies wird erreicht, indem zunächst Vorlagen entworfen werden, die letztendlich die Platzierung der Zellen lenken. Anschließend werden diese Entwürfe mittels Photolithographie in strukturierte Oberflächen umgewandelt, wodurch die Herstellung von Plasmablockierungsformen durch weiche Lithographie ermöglicht wird.

Schließlich werden diese Abschirmformen als Dreibein in einer Petrischale angeordnet, um eine selektive Exposition der darunterliegenden Oberflächen gegenüber Plasma zu ermöglichen, wodurch ein zellensensitives chemisches Muster in den Bereichen unter jeder Form entsteht. Die Ergebnisse können zeigen, wie das Verhalten einer Zelle von ihrem Mikroumfeld und ihrer Wechselwirkung mit benachbarten Zellen abhängt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Auswirkungen von Mikroumgebungen auf das Zellverhalten zu beantworten, beispielsweise wie Wechselwirkungen zwischen Zellgruppen höher geordnete Phänomene beeinflussen.

Und wie wirken sich nanoskalige, subzelluläre Signale auf Funktionen wie die Zellwanderung und Differenzierung aus? Befestigen Sie zunächst mithilfe von Sekundenkleber eine Musterschiebe an einem Stapel leerer Objektträger. Erstellen Sie danach einen Behälter aus Aluminiumfolie, der etwas größer als der Objektträgerstapel ist und groß genug, um 30 Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS aufzunehmen.

Legen Sie den Objektträgerstapel in den Behälter und gießen Sie dann PDMS über den Stapel, um eine erste Form zu erstellen. Entgasen Sie das PDMS, indem Sie den Behälter in eine Vakuumkammer stellen. Lösen Sie eventuell im PDMS vorhandene Blasen, indem Sie mehrmals schnell einen Finger von der Ansaugventilschlauchleitung abnehmen und wieder daraufsetzen, um kurzzeitig einen Luftstrom in die Kammer zuzulassen.

Das Ventil wird fünf Minuten lang zum ununterbrochenen Entgasen geschlossen gehalten. Anschließend lässt man das PDMS im sauberen Flussgehäuse bei Raumtemperatur ein bis zwei Tage aushärten. Nach dem Aushärten wird das PDMS vom Mastermuster abgezogen und bildet so eine Form.

Gießen Sie anschließend eine dünne Schicht aus sechs Gramm zweikomponentigem Epoxidharz, das gerade eine Minute lang gemischt wurde, in die Urform. Entgasen Sie das Epoxidharz unverzüglich durch mehrere Blasenzerstörungszyklen, bevor es aushärtet. Nachdem das entgasste Epoxidharz eine Stunde lang ungestört stehen gelassen wurde, ist es teilweise ausgehärtet.

Fügen Sie weiteres Epoxidharz zur Form hinzu, ohne es zu entgasen, um eine dickere Struktur zu erzeugen, die in späteren Schritten leichter zu handhaben ist. Lassen Sie das Epoxidharz anschließend ein bis zwei Tage aushärten. Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, entfernen Sie es aus der PDMS-Gussform und wickeln anschließend Klebeband um die Epoxidform, um einen Behälter zu bilden.

Eine Arbeitsschablone kann anschließend hergestellt werden, indem PDMS auf die Epoxidschablone gegossen, entgast und die neue Schablone ein bis zwei Tage lang ausgehärtet wird. Nachdem die Arbeitsschablone ausgehärtet ist, entfernen Sie diese vorsichtig von der Epoxidschablone und lagern Sie beide in Petrischalen, die in einem verschlossenen Plastikbehälter innerhalb der Flusshaube aufbewahrt werden, um die Sauberkeit zu gewährleisten. Um eine Schablone für die Oberflächenstrukturierung vorzubereiten, schneiden Sie mit einer Rasierklinge kleine Abschnitte der Arbeitsschablone ab und legen Sie diese Abschnitte in eine Petrischale.

Die Positionen dieser Formabschnitte werden auf der Rückseite der Petrischale mit einem Permanentstift markiert, indem eine Kontur um die Stellen gezogen wird, an denen die Formabschnitte sitzen, um ein Stativ aus den Abschnitten zu bilden, und das Stativ wird belassen, um einen formtreuen Kontakt zwischen der Arbeitsform und der Oberfläche der Petrischale sicherzustellen. Überprüfen Sie die Unterseite der Schale, um eine korrekte Platzierung zu bestätigen, erkennbar an der Sichtbarkeit von Kanälen, die mit bloßem Auge oder mithilfe einer kleinen Lupe zu sehen sind. Stellen Sie die Montage in eine Plasmakammer.

Beginnen Sie die Plasmabehandlung nach der Plasmabehandlung. Entfernen Sie die Form und die Gewichtsanordnung und stellen Sie die Petrischale in einem Biosicherheitsschrank unter UV-Licht zur Sterilisation 10 Minuten lang ab. Bewahren Sie die Schale dort auf, bis sie mit Zellen besiedelt wird.

Verdünnen Sie die gewählten experimentellen Zellen in ihrem standardmäßigen Kulturmedium, um die gewünschte Konfluenz zu erreichen. Geben Sie beim Platzieren auf die strukturierte Petrischalenoberfläche drei Milliliter der Zellsuspension in die Petrischale. Inkubieren Sie die strukturierte Petrischale bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit über mehrere Stunden bis hin zu mehreren Tagen, damit sich die Zellen auf dem durch die Plasmastruktur erzeugten Muster anordnen können.

Die Musterung wird mittels Phasenkontrastmikroskopie überprüft. Bei der Kultivierung von Neuroblastomzellen täglich 10 Mikromolar Retinsäure hinzufügen, bis eine Differenzierung der Zellen in einen neuronenähnlichen Zustand beobachtet wird. Das standardmäßige Zellkulturmedium alle drei bis vier Tage erneuern.

Ein typisches Ergebnis der Anwendung der Plasma-Lithographie-Technik ist die Bildung eines Zellmusters, das einer beliebigen oder natürlichen Struktur ähnelt. Ein Beispiel hierfür ist in dieser Abbildung mit Neuronen zu sehen, die auf einem Linienmuster mit Retinsäure differenziert wurden. Und hier in dieser Abbildung, in der Linien und Netzwerke von Neuronen erzeugt wurden. Auch andere Zelltypen als Neuronen können verwendet werden, wie in den folgenden beiden Abbildungen gezeigt. Diese Abbildung zeigt humane Nabelvenenendothelzellen, und diese Abbildung zeigt C2C12-Skelettmuskelzellen, die Gitter bilden, wie hier zu sehen.

Materialien wie Polylysin können ebenfalls strukturiert werden, um die Anheftung bestimmter Zelltypen zu erleichtern und für andere Anwendungen genutzt zu werden. Nach diesem Verfahren kann die Einbindung zusätzlicher Komponenten wie Mikrofluidik, Zellprobenahme oder genetische Manipulation spezifischer Proteine durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie Kombinationen von Stimuli das Verhalten einzelner Zellen und höher geordnete Zellverhalten beeinflussen.