Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Zellmikroumgebungen zu schaffen, um biologische Fragen in Bezug auf das Verhalten von Einzel- und Gruppenzellen zu untersuchen, die auf mikro- und nanoskaliger Ebene stattfinden. Dies wird erreicht, indem zunächst Vorlagen entworfen werden, die letztendlich die Zellplatzierung steuern. Anschließend werden diese Designs per Photolithographie in Musteroberflächen übersetzt, was die Herstellung von Plasma-Abschirmformen mittels Softlithographie ermöglicht.

Schließlich sind diese Abschirmformen wie ein Stativ in einer Petrischale angeordnet, um eine selektive Exposition der darunter liegenden Oberflächen mit Plasma zu ermöglichen, das ein zellempfindliches chemisches Muster auf den Bereichen unter jeder Form hinterlässt. Es können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie das Verhalten einer Zelle von ihrer Mikroumgebung und ihrer Interaktion mit benachbarten Zellen abhängt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Auswirkungen von Mikroumgebungen auf das Zellverhalten zu beantworten, z. B. wie sich Wechselwirkungen zwischen Zellgruppen auf Phänomene höherer Ordnung auswirken.

Und wie beeinflussen subzelluläre nanoskalige Signale Funktionen wie Gesundheitsmigration und Differenzierung? Befestigen Sie zunächst mit Sekundenkleber eine Musterfolie an einem Stapel leerer Folien. Erstellen Sie als Nächstes einen Behälter aus Aluminiumfolie, der etwas größer ist als der Stapel der Objektträger und groß genug, um 30 Gramm Polydimethylsuboxan oder PDMS aufzunehmen.

Legen Sie den Stapel der Objektträger in den Behälter und bohren Sie dann PDMS über den Stapel der Objektträger, um eine erste Form zu erstellen. Entgasen Sie dann PDMS, indem Sie den Behälter in eine Vakuumkammer stellen. Brechen Sie alle im PDMS vorhandenen Blasen, indem Sie einen Finger über den Einlassventilschlauch mehrmals schnell entfernen und wieder einsetzen, damit Luft kurz in die Kammer strömen kann.

Das Ventil wird für fünf Minuten ununterbrochene Entgasung geschlossen. Lassen Sie das PDMS dann ein bis zwei Tage in der Reinfließhaube bei Raumtemperatur aushärten. Nach dem Aushärten wird das PDMS vom Urmodell abgezogen und bildet eine Form.

Gießen Sie als Nächstes eine dünne Schicht von sechs Gramm zweiteiligem Epoxidharz, das gerade eine Minute lang gemischt wurde, in die Urform. Entgasen Sie das Epoxidharz sofort mit vielen Blasenbrechzyklen, bevor das Epoxidharz aushärtet. Nachdem das Degas-Epoxidharz eine Stunde lang ungestört einwirken konnte, wird es teilweise ausgehärtet.

Geben Sie mehr Epoxidharz in die Form, ohne zu entgasen, um eine dickere Struktur zu erzeugen, die in späteren Schritten leichter zu handhaben ist. Lassen Sie das Epoxidharz dann ein bis zwei Tage aushärten. Sobald die Epoxidform ausgehärtet ist, entfernen Sie das Epoxidharz aus der PDMS-Urform und wickeln Sie dann Klebeband um die Epoxidform, um einen Behälter zu bilden.

Eine Arbeitsform kann dann erstellt werden, indem PDMS auf die Epoxidform gegossen, das PDMS entgast und die neue Form ein bis zwei Tage lang ausgehärtet wird. Nachdem die Arbeitsform ausgehärtet ist, ziehen Sie die Form vom Epoxidharz ab und bewahren Sie beide in Petrischalen in einem versiegelten Plastikbehälter in der Durchflusshaube auf, um die Sauberkeit zu erhalten. Um eine Form für die Oberflächenmusterung vorzubereiten, schneiden Sie mit einer Rasierklinge kleine Abschnitte der Arbeitsform ab und legen Sie die Abschnitte in eine Petrischale.

Die Positionen dieser Formabschnitte werden auf der Rückseite der Petrischale mit einem Permanentmarker beschriftet, indem ein Umriss um die Stelle, an der die Formabschnitte sitzen, ein Stativ aus den Abschnitten gebildet wird und das Stativ darauf wartet, einen konformen Kontakt zwischen der Arbeitsform und der Petrischaleoberfläche zu gewährleisten. Schauen Sie auf den Boden der Schale, um eine gute Platzierung zu bestätigen, was durch das Vorhandensein von Kanälen belegt wird, die mit bloßem Auge oder mit einer kleinen Lupe gesehen werden können. Platzieren Sie die Baugruppe in einer Plasmakammer.

Starten Sie die Plasmabehandlung nach der Plasmabehandlung. Entfernen Sie die Form und die Gewichtsanordnung und stellen Sie die Petrischale zur Sterilisation 10 Minuten lang unter UV-Licht in eine Biosicherheitswerkbank. Lagern Sie die Schale dort, bis sie mit Zellen besiedelt ist.

Verdünnen Sie die Versuchszellen Ihrer Wahl in ihren Standard-Nährmedien, um die gewünschte Konfluenz zu erreichen. Wenn Sie es auf die gemusterte Petrischale-Oberfläche legen, gießen Sie drei Milliliter der Zelllösung in die Petrischale. Inkubieren Sie die gemusterte Petrischale bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit für mehrere Stunden bis mehrere Tage, damit sich die Zellen zu dem von der Plasmazelle erzeugten Muster zusammensetzen können.

Die Strukturierung wird mit der Phasenkontrastmikroskopie überprüft. Bei der Kultivierung von Neuroblastomzellen fügen Sie täglich 10 Mikromolare Retinsäure hinzu, bis die Zelldifferenzierung in einen neuronenähnlichen Zustand beobachtet wird. Tauschen Sie das Standard-Zellkulturmedium alle drei bis vier Tage aus.

Ein typisches Ergebnis der Implementierung der Plasmalithographie-Technik ist die Bildung eines Zellmusters, das einer beliebigen oder natürlichen Struktur ähnelt. Ein Beispiel dafür ist hier in dieser Abbildung mit Neuronen zu sehen, die mit Retinsäure auf einem Linienmuster unterschieden wurden. Und hier in dieser Abbildung, wo Linien und Netzwerke von Neuronen geschaffen wurden, können auch andere Zelltypen als Neuronen verwendet werden, wie in den nächsten beiden Abbildungen zu sehen ist, diese Abbildung zeigt menschliche Nabelvenen-Endothelzellen, und diese Abbildung zeigt C zwei C 12 Skelettmuskelzellen, die Gitter bilden, wie zu sehen. Hier.

Materialien wie Polylysin können auch strukturiert werden, um die Anheftung bestimmter Zelltypen und für andere Anwendungen zu erleichtern. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Inputs wie Mikrofluidik, Zellsondierung oder genetische Manipulation eines bestimmten Proteins eingebaut werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie Kombinationen von Reizen das Verhalten höherer Ordnung und des individuellen Zellverhaltens beeinflussen.