Name: Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Erfahren Sie Plasma-Lithographie zur Erzeugung stabiler Oberflächenmuster für Zellnetzwerke. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Zellmikroumgebungen zur Untersuchung von Zellverhalten und Interaktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Wir danken DD Zhang für aufschlussreiche Diskussionen und großzügig bietet Reagenzien. MJ wird durch die NIH Herz-Kreislauf-Training Grant, die Arizona Technology Research Initiative Fund, und Achievement Rewards for Hochschule Wissenschaftler unterstützt. Diese Arbeit wird von New Innovator des NIH Director Award (1DP2OD007161-01), der National Science Foundation (0855890) und die James S. McDonnell Foundation unterstützt.</p

1. Herstellung von Formen zur Strukturierung eingesetzt <ol><li> Konzeption von Mustern. Patterns sind geschaffen, die dazu dienen, Zell-Netzwerke zu bilden, Steuer-Zell-Kontakt, zu isolieren Zellen, ahmen natürliche Strukturen, oder auf andere Weise führen die Zelladhäsion und Platzierung. </li><li> Computer-Aided Design oder CAD-basierte Erstellung von Muster und Erstellung von Photomasken. Das gewünschte Muster wird in CAD-Software wie AutoCAD konzipiert und wird dann an ein externes Unternehmen zur Herstellung einer Photomaske geschickt. </li><li> Photolithographie zu meistern Muster zu erzeugen. Glasträger sind entweder mit einem dünnen positive widerstehen oder einen dicken Negativ-Resist abhängig von der Größe der Struktur geschaffen gemustert. Glasträger sind für ihre Vorteile als kostengünstige, stärker als Silizium-Wafern und nicht produzieren so viel Staub, wenn sie gebrochen werden. Alternativ können auch andere praktische Strukturen wie Beugungsgitter als Urmodell verwendet werden. </li><li> Die strukturierte Folie ist mit einem Stapel von Dias, die nicht gewesen sein gemusterten befestigt. Alle Schritte werden in einem sauberen Werkbank durchgeführt, um die Staubentwicklung zu minimieren. </li><li> Erstellung von Master-Formen. Ein Behälter aus Alufolie etwas größer als die Stapel von Dias erstellt, um die 30 g Polydimethylsiloxan (PDMS), die dann über die photolithographisch strukturierte Oberfläche gegossen wird, um eine erste Form erstellen zu halten. Das PDMS wird entgast und dürfen für 1-2 Tage aushärten. </li><li> Nach dem Aushärten des PDMS ist aus der Master-Muster geschält und bildet eine Form für den nächsten Schritt. </li><li> 6 g der 2 Teil Epoxy (Devcon # 14310 (6 g) wird für 1 Minute gemischt und anschließend in die Master-Form, entgast und aushärten gelassen. Entgasung der Epoxid schnell getan werden muss (&lt;8 min) mit vielen Blasen brechen Zyklen und nur mit einer dünnen Schicht, bevor es die Epoxy-Sets und Blase Entfernung unmöglich wird, um die Luftblasen zu entfernen. Die 6 g verwendet erzeugt eine dünne Schicht, die schnelle Blase Entfernung erleichtert. </li><li> Nach einer Stunde wird die 2-teilige Epoxy teilweise geheilt werden und Epoxidharz können auf der Oberseite ohne Entgasung, um eine dickere Struktur, die Orientierung im späteren Schritten Griff zu produzieren hinzugefügt werden. Das Epoxidharz wird dann für 1-2 Tage aushärten. </li><li> Nach dem Aushärten wird das Epoxidharz aus der PDMS Master-Form entfernt und Band ist rund um die Epoxy-Form verpackt, um einen Container zu bilden. Eine Arbeitsgruppe Form wird dann durch Gießen PDMS auf die Epoxid-Schimmel, Entgasung des PDMS und Aushärtung für 1-2 Tage erstellt. </li><li> Nach dem Aushärten wird die Arbeitsform aus der Epoxid-geschält und gespeichert werden, um sauber zu halten. </li></ol> 2. Strukturierung von Oberflächen mit Formen für die Zell-Führung <ol><li> Kleine Teile der Arbeiterklasse Schimmel sind ausgeschnitten und auf einen Polystyrol-Petrischale. Die Standorte dieser Formabschnitte gekennzeichnet sind. </li><li> Ein Stativ ist aus dem kleinen Abschnitten und gewichtet, um konformen Kontakt zwischen der Arbeiterklasse Schimmel und der Petrischale Oberfläche zu gewährleisten gebildet. Gute Platzierung können, indem Sie am unteren Rand der Schale beobachtet werden. </li><li> Die Montage ist in die Plasmakammer gelegt. Plasma-Behandlung eingeleitet wird und bei 150 Pa weiterhin bei 29,6 W (max. Leistung) für 10 Minuten mit Luft-Plasma. </li><li> Nach der Plasmabehandlung sind die Form und das Gewicht Anklage entfernt. </li><li> Die Petrischale wird unter UV-Licht für 10 Minuten der Sterilisation in der Biosicherheit Schrank gestellt und dort bis und mit Zellen besiedelt gespeichert. </li></ol> 3. Seeding Oberflächen mit Zellen <ol><li> SH-SY5Y CRL-2266 humanen Neuroblastom oder andere Zellen kultiviert werden über Standard-Protokolle für den Zelltyp. </li><li> Der Zusammenfluss von SH-SY5Y CRL-2266 humanen Neuroblastom-Zellen ist optisch vor der Aussaat auf die gemusterte Oberfläche gemessen. </li><li> Standard-Zell-Splitting wird durchgeführt, um die Zellen von der Oberfläche der Petrischale zu entfernen. </li><li> Die Zellen, einmal frei schwebend, auf die Oberfläche der gemusterten Petrischale, nachdem sie verdünnt, um die gewünschte Zusammenfluss erreichen, wenn auf der strukturierten Oberfläche platziert ausgesät. </li><li> Die Zellen werden absitzen und heften sich an die Oberfläche. </li><li> Die strukturierte Petrischale wird für mehrere Stunden bis mehrere Tage inkubiert, während die Zellen auf das Muster durch das Plasma erzeugt montieren. </li><li> Wenn die Kultivierung der Neuroblastom-Zellen, Retinsäure (10 pM) wird täglich um die Zellen zu induzieren, um in einem Neuron-ähnliche Zustände zu unterscheiden aufgenommen. Die Zugabe der Retinsäure im Dunkeln durchgeführt. </li><li> Retinsäure ist täglich für mehrere Tage aufgenommen, nach der Differenzierung zu beobachten sein wird. </li><li> Medien ersetzt wird alle 3-4 Tage. </li></ol> 4. Beobachtung und Analyse <ol><li> Regelmäßige Aufnahmen der lebenden Zellen oder Videos getroffen werden, um die das Verhalten der Zelle im Laufe der Zeit zu beobachten. Für Live-Bilder werden die Zellen in einem Mikroskoptisch top Inkubator, die die Zellen hält bei 37 ° C, 100% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 platziert. Es können auch Zellen fixiert und für die Beobachtung unter Fluoreszenz angefärbt werden </li><li die bilder oder videos von den zellen gefangen genommen wurden sind um ein bild-analyse-system importiert und messungen werden auch wachstum zellgr migrations-geschwindigkeit differenzierung ausrichtung anordnung spezifischen proteinen anderen durchgef></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Eine typische Folge der Durchführung der Plasma-Lithographie ist die Bildung eines Musters von Zellen, die eine willkürliche oder natürliche Struktur ähnelt. Dies ist in Abbildung 1a-b, wo Leitungen und Netze von Neuronen geschaffen gesehen haben. Andere Zelltypen können ebenso wie in Abbildung 1c-d, die menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) und C2C12 Skelettmuskelzellen bilden Netze Ausstellungen zu sehen. Materialien wie Poly-L-Lysin können auch gemustert werden, Bild 1e, um die Befestigung von bestimmten Zelltypen und für andere Zwecke zu erleichtern. Im Falle der Neuronen gezeigt, was geschaffen werden Netzwerke von Zellen, die Verbindungen zwischen ihnen. Dieser repliziert, was kommt in der Natur im Gehirn, wo Neuronen haben diskrete Verbindungen zwischen benachbarten Zellen, die die Arbeitsweise des Gehirns beeinflusst. Mit der Schaffung einer solchen Struktur im Labor kann die Anzahl, Position, Frequenz und andere Faktoren, die Verbindungen systematisch kontrolliert werden. Das Ergebnis dieser Anklagen visuell gemessen werden und zusätzliche Eingaben wie chemische oder elektrische Stimulation kann implementiert, um die Netzwerk-Verhalten Sonde werden. Ein negatives Ergebnis wäre ein überwuchert oder unvollständige Muster oder eine verunreinigte Probe. Eine unvollständige oder überwachsen Muster würde von der Aussaat des Substrats mit entweder zu wenige oder zu viele Zellen, die nicht liefern das Muster mit einem idealen Menge an Zellen zur Folge hätte. Außerdem, wenn das Muster nicht vorgesehen ist korrekt (z. B. Linien zu schmal) die Zellen nicht in der Lage zu befestigen und erfolgreich zu wachsen auf ihr. Im Fall einer verunreinigten Probe würde eine sorgfältige Reinlichkeit nicht während einer der Schritte beibehalten haben, obwohl dies selten ist, wenn nach einer ordnungsgemäßen Zellkultur-Protokoll aufgrund der Tatsache, dass die Plasma-Strukturierung auch sterilisiert das Substrat. <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Strukturierung von Zellen und Protein.

<ol><li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li>
<li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li>
<li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li>
<li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+%28%CE%BCPIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microscale Plasma-Initiated Patterning (μPIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li>
<li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li>
<li>Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma%3A+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li>
<li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrobel%2C+M+%22Plasma+surface+modification+of+polymers%3A+Relevance+to+adhesion%22">Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion</a>. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates%2C+Lengths%2C+and+Orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li>
<li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li>
<li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Coatings+Technology%22%5BJournal%5D)">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li>
<li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-treated+polystyrene+surfaces%3A+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li>
<li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li>
</ol>

Die Zelle Untersuchung hier vorgestellte Methode ermöglicht die Erstellung von komplexen Mustern von mehrzelligen Netzwerken, die biologischen Strukturen imitieren sowie eine Methode, um Reize, die subzelluläre in der Natur, die dann erleichtert Untersuchungen beider gruppiert das Verhalten der Zelle und Single-Zell-Reaktionen auf Umwelteinflüsse sind zu produzieren. Die Anwendung dieser Methode ist einfach, aber robust, wie es schnell mit geringen Kosten Geräte im selben Labor wie der Zellkultur durchgeführt werden. Es ist auch stark Zelle empfindlich, ermöglicht eine einfache Beobachtung der resultierenden Verhalten und ist von Natur aus stabil über lange Zeiträume, die Untersuchung der langfristigen Verhalten der Zelle ermöglicht. Es ermöglicht zudem ein breites Spektrum von Experimenten durchgeführt, wie es mit vielen Zelltypen und können beliebige Muster zu erstellen. Die langfristige Stabilität der Technik ergibt sich aus der Tatsache, dass die Funktionalisierung der Oberfläche durch das Plasma vermittelt ein Teil der Oberfläche ist und nicht eine Beschichtung oder andere Schicht, die entfernt oder abgebaut werden kann. Wenn unter flüssigem gehalten wird, kann diese Art der Modifikation behält seine Zelle führen Fähigkeit für Monate. Der wichtigste Teil des Experiments notwendig, um aussagekräftige Ergebnisse zu gewährleisten, ist die Erstellung der Master-Muster, die letztlich für die Zell-Führung genutzt werden. Wenn dieses Muster ist nicht richtig entwickelt, werden die Zellen nicht angemessen, um das Muster zu reagieren und können keine brauchbaren Verhalten. Parameter wie Linienbreite, Muster Abstand, und andere können einen großen Einfluss auf die Zelle Kompatibilität mit einem bestimmten Muster, und in der Regel eine Reihe solcher Parameter kann über die erste Photomaske Bildschirm für die am besten geeignete Design erstellt werden. Andere wichtige Parameter in Bezug auf out Strukturierung Durchführung gehören Formenbau, die Aufrechterhaltung einer staubfreien Umgebung, Zell-Aussaat und allgemeine Sterilität der Zellkultur. Mold Schöpfung kann durch die verschiedenen Schritte, die Übertragung verpflichtet, für die wiederholte PDMS Ablegen einer Epoxy Form erlauben, sind erfolgen. Die Epoxy-Form entsteht, weil es nicht auf die gleiche Weise abgebaut wird als widerstehen Form mit kleinen, Strukturen mit großem Seitenverhältnis unter wiederholter Gießen. Wenn der Transfer Moulding korrekt erfolgt ist, werden die Abmessungen und die Ausbeute nicht betroffen, aber wenn sie falsch wie durch schlecht Entgasung, unvollständige Härtung, oder übermäßige Erwärmung getan, Blasen, Unebenheiten und Verformungen eines Musters kann auftreten, wirkt sich das Endergebnis. In Bezug auf die Aufrechterhaltung einer staubfreien Umgebung, müssen die Formen so sauber wie möglich gehalten werden, wie Staub mit den richtigen Kontakt zwischen der Arbeiterklasse PDMS Form und die Oberfläche und damit richtigen Plasma-Abschirmung und chemische Strukturierung stören können. Die Aussaat Dichte der Zellen muss auch optimiert, um sicherzustellen, dass weder zu wenige oder zu viele Zellen das Muster Gebiet bewohnen und Sterilität muss beibehalten werden, um Bakterien und andere Verunreinigungen der Zellen verwendet zu vermeiden. Die Technik kann auch mit anderen Elementen wie Mikrofluidik, Mikroelektroden und mechanische Sonden eingebaut werden. Dies sorgt für zusätzliche Reize zu den Zellen, um besser zu replizieren verschiedenen physiologischen Bedingungen während der Experimente und die zukünftige Arbeit basiert auf der Untersuchung der Auswirkungen dieser Kombinationen konzentriert

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Plasma-Reiniger und Vakuumkammer </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-001 </td><td></td></tr><tr><td> Inverted Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> TE2000-U </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskoptisch top Inkubator </td><td> AmScope </td><td> Modell TCS-100 </td><td> Modifiziert, um ein Gehäuse, das eine entsprechende Atmosphäre Lieferungen umfassen </td></tr><tr><td> Polystyrol-Petrischale </td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td> Polydimethylsiloxan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Epoxy </td><td> Devcon </td><td> 2 ton klar, Epoxy # 14310 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturmedien </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Medien folgt Standard-Formulierungen für Zelltyp </td></tr><tr><td> Retinsäure </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography oberflächenstrukturierung für die erzeugung von cell networks

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematische Manipulation einer Zelle Mikroumgebung mit mikro-und nanoskaliger Auflösung wird häufig für die Entschlüsselung verschiedener zellulärer und molekularer Phänomene erforderlich. Um dieser Anforderung haben wir einen Plasma-Lithographie, die zellulären Mikroumgebung durch die Schaffung einer strukturierten Oberfläche mit Strukturgrößen im Bereich von 100 nm bis in den Millimeterbereich zu manipulieren entwickelt. Das Ziel dieser Technik ist in der Lage sein zu lernen, in einer kontrollierten Art und Weise, das Verhalten einzelner Zellen als auch für Gruppen von Zellen und ihrer Wechselwirkungen. Dieses Plasma-Lithographie-Verfahren basiert auf selektiven Modifizierung der Oberflächenchemie auf einem Substrat durch Abschirmung der Kontakt der Niedertemperatur-Plasma mit einer physischen Form basiert. Diese selektive Abschirmung hinterlässt eine chemische Muster, Zelladhäsion und Bewegung führen kann. Dieses Muster oder Oberflächen-Templates können dann verwendet, um Netzwerke von Zellen, deren Struktur, die in der Natur nachzuahmen und erzeugt einen kontrollierbaren Umfeld für experimentelle Untersuchungen zu erstellen. Die Technik ist gut für das Studium biologisches Phänomen geeignet, da sie stabile Oberfläche Muster produziert auf transparente polymere Substrate in eine biokompatible Weise. Die Oberfläche Muster letzten Wochen und Monate und kann somit Guide Interaktion mit Zellen über lange Zeiträume, die das Studium der langfristigen zelluläre Prozesse, wie die Differenzierung und Anpassung erleichtert. Die Modifizierung der Oberfläche ist in erster Linie chemischer Natur und somit nicht vorstellen topografischen oder physische Störungen für die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus beinhaltet keine aggressiven oder giftigen Substanzen zu Strukturierung zu erreichen und ist für die Zellkultur kompatibel. Darüber hinaus kann es angewandt, um verschiedene Arten von polymeren Substraten, die durch die Fähigkeit, ihre Eigenschaften stimmen ideal für sich und werden häufig in biologischen Anwendungen zu ändern. Die erzielbare Auflösung ist auch von Vorteil, als Isolierung spezifischer Prozesse wie Migration, Adhäsion oder Bindung kann für diskrete, klar Beobachtungen an den einzelnen zu mehrzelligen Ebene. Diese Methode wurde verwendet, um unterschiedliche Netzwerke verschiedener Zelltypen für Untersuchungen mit Migrations-, Signal-, Gewebe-Bildung und das Verhalten und die Interaktionen von Neuronen angeklagt in einem Netzwerk zu bilden.

Ein vielseitiges Plasma Lithographie wurde entwickelt, um stabile Oberfläche Muster zur Führung Anheftung der Zellen zu generieren. Diese Technik kann angewendet Cell Networks einschließlich derer, die natürlichen Geweben zu imitieren und hat für das Studium mehrere, unterschiedliche Zelltypen verwendet worden zu erstellen.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Die systematische Manipulation einer zellulären Mikroumgebung mit Mikro- und Nanoskalliger Auflösung ist häufig erforderlich, um verschiedene zelluläre und molekulare ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zelluläre Mikroumgebungen zu schaffen, um biologische Fragestellungen im Zusammenhang mit individuellem und kollektivem Zellverhalten zu untersuchen, das auf mikro- und nanoskaligen Dimensionen stattfindet. Dies wird erreicht, indem zunächst Vorlagen entworfen werden, die letztendlich die Platzierung der Zellen lenken. Anschließend werden diese Entwürfe mittels Photolithographie in strukturierte Oberflächen umgesetzt, wodurch die Herstellung von Plasmablockierungsformen über die weiche Lithographie ermöglicht wird.Schließlich werden diese Abschirmformen als Dreibein in einer Petrischale angeordnet, um eine selektive Exposition der darunterliegenden Oberflächen gegenüber Plasma zu ermöglichen, wodurch ein zellensensitives chemisches Muster in den Bereichen unter jeder Form entsteht. So können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie das Verhalten einer Zelle von ihrer Mikroumgebung und ihrer Wechselwirkung mit benachbarten Zellen abhängt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bezüglich der Auswirkungen von Mikroumgebungen auf das Zellverhalten zu beantworten, beispielsweise wie Wechselwirkungen zwischen Zellgruppen höher geordnete Phänomene beeinflussen.Und wie wirken sich nanoskalige zelluläre Hinweise auf Funktionen wie Zellwanderung und Differenzierung aus? Befestigen Sie zunächst mithilfe von Sekundenkleber eine Musterschiebe an einem Stapel leerer Objektträger. Erstellen Sie danach einen Behälter aus Aluminiumfolie, der etwas größer als der Objektträgerstapel ist und groß genug, um 30 Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS aufzunehmen.Legen Sie den Objektträgerstapel in den Behälter und gießen Sie dann PDMS über den Stapel, um eine erste Form zu erstellen. Entgasen Sie das PDMS, indem Sie den Behälter in eine Vakuumkammer stellen. Lösen Sie eventuell vorhandene Blasen im PDMS auf, indem Sie mehrmals schnell einen Finger von der Ansaugventilschlauchleitung abnehmen und wieder daraufsetzen, um kurzzeitig einen Luftstrom in die Kammer zu ermöglichen.Das Ventil wird fünf Minuten lang zum kontinuierlichen Entgasen geschlossen gehalten. Anschließend lässt man das PDMS einen bis zwei Tage lang bei Raumtemperatur in der sauberen Flusshaube aushärten. Nach dem Aushärten wird das PDMS vom Mastermuster abgezogen und bildet so eine Form.Gießen Sie anschließend eine dünne Schicht aus sechs Gramm zweikomponentigem Epoxidharz, das gerade eine Minute lang gemischt wurde, in die Urform. Entgasen Sie das Epoxidharz unverzüglich durch mehrere Blasenzerstörungszyklen, bevor es aushärtet. Nachdem das entgasste Epoxidharz eine Stunde lang ungestört stehen gelassen wurde, ist es teilweise ausgehärtet.Fügen Sie mehr Epoxidharz zur Form hinzu, ohne es zu entgasen, um eine dickere Struktur zu erzeugen, die in späteren Schritten leichter zu handhaben ist. Lassen Sie das Epoxidharz anschließend ein bis zwei Tage aushärten. Sobald das Epoxidharz ausgehärtet ist, entfernen Sie es aus der PDMS-Gussform und wickeln anschließend Klebeband um die Epoxidform, um einen Behälter zu bilden.Eine Arbeitsschablone kann anschließend hergestellt werden, indem PDMS auf die Epoxidschablone gegossen, entgast und die neue Schablone ein bis zwei Tage lang ausgehärtet wird. Nachdem die Arbeitsschablone ausgehärtet ist, entfernen Sie diese vorsichtig von der Epoxidschablone und lagern Sie beide in Petrischalen, die in einem verschlossenen Plastikbehälter innerhalb der Flusshaube aufbewahrt werden, um die Sauberkeit zu gewährleisten. Um eine Schablone für die Oberflächenstrukturierung vorzubereiten, schneiden Sie kleine Abschnitte der Arbeitsschablone mit einer Rasierklinge ab und legen Sie diese Abschnitte in eine Petrischale.Die Positionen dieser Schimmelpilzabschnitte werden auf der Rückseite der Petrischale mit einem Permanentstift markiert, indem eine Umrisslinie um die Stellen gezogen wird, an denen die Schimmelpilzabschnitte sitzen, um ein Stativ aus den Abschnitten zu bilden, und das Stativ wird belassen, um einen formtreuen Kontakt zwischen der Arbeitsform und der Oberfläche der Petrischale sicherzustellen. Überprüfen Sie die Unterseite der Schale, um eine korrekte Platzierung zu bestätigen, erkennbar an der Anwesenheit von Kanälen, die mit bloßem Auge oder mithilfe einer kleinen Lupe sichtbar sind. Stellen Sie die Montage in eine Plasmakammer.Beginnen Sie die Plasmabehandlung nach der Plasmabehandlung. Entfernen Sie die Form und die Gewichtsanordnung und stellen Sie die Petrischale in einem Biosicherheitsschrank unter UV-Licht zur Sterilisation 10 Minuten lang ab. Bewahren Sie die Schale dort auf, bis sie mit Zellen beimpft wird.Verdünnen Sie die gewünschten experimentellen Zellen in ihrem standardmäßigen Kulturmedium, um die gewünschte Konfluenz zu erreichen. Geben Sie beim Platzieren auf die strukturierte Petrischalenoberfläche drei Milliliter der Zellsuspension in die Petrischale. Inkubieren Sie die strukturierte Petrischale bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 100 % Luftfeuchtigkeit über mehrere Stunden bis mehrere Tage, damit sich die Zellen auf dem durch die Plasmastruktur erzeugten Muster anordnen können.Die Musterung wird mittels Phasenkontrastmikroskopie überprüft. Bei der Kultivierung von Neuroblastomzellen täglich 10 Mikromolar Retinsäure hinzufügen, bis eine Differenzierung der Zellen in einen neuronenähnlichen Zustand beobachtet wird. Ersetzen Sie das Standardzellkulturmedium alle drei bis vier Tage.Ein typisches Ergebnis der Anwendung der Plasma-Lithographie-Technik ist die Bildung eines Zellmusters, das einer beliebigen oder natürlichen Struktur ähnelt. Ein Beispiel hierfür ist in dieser Abbildung mit Neuronen zu sehen, die auf einem Linienmuster mit Retinsäure differenziert wurden. Und hier in dieser Abbildung, in der Linien und Netzwerke von Neuronen erzeugt wurden. Auch andere Zelltypen als Neuronen können verwendet werden, wie in den folgenden beiden Abbildungen gezeigt. Diese Abbildung zeigt humane Nabelvenenendothelzellen, und diese Abbildung zeigt C2C12-Skelettmuskelzellen, die Gitterstrukturen bilden, wie hier zu sehen.Materialien wie Polylysin können ebenfalls strukturiert werden, um die Anheftung bestimmter Zelltypen zu erleichtern und für andere Anwendungen genutzt zu werden. Mit dieser Methode kann die Einbindung zusätzlicher Komponenten wie Mikrofluidik, Zellprobenahme oder genetische Modifikation spezifischer Proteine durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie Kombinationen von Stimuli das Verhalten einzelner Zellen und höher geordnete Zellverhalten beeinflussen.

plasma-lithography-surface-patterning-for-creation-of-cell-networks

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Mikrokontaktdruck ausgiebig in die Muster von Proteinen und anderen Molekülen auf Materialoberflächen eingesetzt. Wir zeigen die wichtigsten Schritte dieses Prozesses, Stanz-Muster von Fibronektin auf Glas.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden.  Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Protokolle für die einzelnen Neurons mikrofluidischen Anordnungs und Wasser für die Maskierung in dem Chip Plasma Strukturierung der Biomaterial-Beschichtungen beschrieben. Sehr verbunden Co-Kulturen können mit minimalem Ein-Zelle hergestellt werden.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Dieses Protokoll beschreibt eine Bioprinting-Methodik, die ein automatisiertes robotergestütztes Abscheidesystem verwendet, das geätzte topographische Leitfäden mit der präzisen Abscheidung einer Zelle mit Hydrogel-Biotinte verbindet. Die gedruckten Zellen werden direkt auf die geätzten Merkmale aufgebracht und sind in der Lage, diese zu erfassen und sich daran zu orientieren.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

Es wird ein Protokoll zur Herstellung einer großen Fläche von nanostrukturiertem Substrat aus kleinen nanostrukturierten Formen zur Untersuchung der nanotopographischen Modulation des Zellverhaltens vorgestellt.

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Herstellung von Mikromustern, die die Zellform standardisieren, um Zytoskelettstrukturen in Säugetierzellen zu untersuchen. Diese benutzerfreundliche Technik kann mit handelsüblichen Bildgebungssystemen eingerichtet werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die für Standard-Zellbiologielabore unzugänglich ist.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Erfahren Sie Plasma-Lithographie zur Erzeugung stabiler Oberflächenmuster für Zellnetzwerke. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Zellmikroumgebungen zur Untersuchung von Zellverhalten und Interaktionen.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Weitere Videos entdecken