Name: Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie die mikrofluidische Einzelzellanordnung von Neuronen für verbundene Co-Kulturen mit minimalem Zellaufwand. Diese Methode ermöglicht präzise Biomaterialbeschichtung und Studien neuronaler Interaktionen.

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Die Autoren sind dankbar, dass Ulrich Marggraf (ISAS) für SU-8-Herstellung und Maria Becker (ISAS) für SEM-Bildgebung. Die Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), ein Bundesministerium für Bildung und Forschung Zuschuss (BMBF 0101-31P6541) und vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen unterstützt. Heike Hardelauf dank der Internationale Leibniz Graduate School &quot;Systems Biology Lab-on-a-Chip&quot; für finanzielle Unterstützung.

Die Protokolle werden für Neurowissenschaftler bestimmt, und sind in Abbildung 2 zusammengefasst. Als solche ist sie empfehlen, die Mikro der SU-8-Master für PDMS-Replikation verwendet wird, um gewerbliche oder institutionelle Einrichtungen ausgelagert. Die beiden Ebenenmaske Entwürfe sind als ergänzende Information (ZIP) auf der Royal Society of Chemistry 12 Website frei verfügbar. Wichtig ist, dass die erste SU-8-Schicht bis zu einer Tiefe von 2,5-3,0 um hergestellt, und die zweite zu einer Tiefe von 25-30 &amp;mgr; m. Dies sind wichtige Dimensionen für eine effektive Neuron Anordnungs erforderlich. Das 3 Mikron Höhenbegrenzung ist auch notwendig, um zu verhindern Neuronen transportiert oder Migration zwischen den beiden Kammern 12. 1. Mikrofluidikvorrichtung Replikation in PDMS <ol><li> Mischen die PDMS-Präpolymer gründlich mit dem Härtungsmittel (184) in einem Verhältnis von 10:1 und entgast die Mischung in einem Vakuum-Exsikkator für typischerweise 20 min. Alternativ dazu können Sie den Mixtur in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und benutzen niedrigen g Zentrifugation zur Entgasung. </li><li> Platzieren Sie die 2-Schicht mikrostrukturiert SU-8-Wafer auf einer 80 ° C Kochplatte und richten Polymerrahmen auf jeder Vorrichtung auf dem Wafer. Gießen PDMS in die Rahmen bis zu einer Tiefe von ≥ 5 mm und ermöglichen&gt; 1 h, um eine vollständige thermische Aushärtung zu gewährleisten. </li><li> Einmal ausgehärtet, entfernen Sie die Wafer von der Kochplatte und lassen Sie auf einer flachen Oberfläche zu kühlen. </li><li> Schutzbrille tragen und die Arbeit von einer Ecke (weg von der SU-8-Mikrostrukturen) mit einem starren Skalpell vorsichtig Preis des Rahmens und PDMS aus dem Wafer. </li><li> Entfernen Sie die PDMS-Form aus dem Rahmen und verwenden Sie eine Schere, um das Gerät von überschüssigem PDMS trimmen. Diese so genannte Blinken wird oft erzeugt werden, wenn ein dünner Film aus PDMS erstreckt sich von der Polymer-Rahmen und der Waferoberfläche. </li><li> Rest PDMS kann auf den gesamten Wafer aufgebracht und gehärtet, um den Wafer während der Lagerung zu schützen. Entfernen Sie diese vor der nachfolgenden Geräteformen, und damit entfernen Sie alle partikulieren Verunreinigungen von der Oberfläche. </li></ol> 2. Geräte-Aufbau-und Verbindungs <ol><li> Bereiten Sie die 6-Schnittstellenanschlüsse mit einem Durchmesser von 3 mm Biopsie Punch. Arbeiten auf einer dunklen Oberfläche, bei guten Lichtverhältnissen und mit den mikrostrukturierten Merkmale nach oben, um die Ausrichtung der Häfen mit den mikrofluidischen Kanälen unterstützen. </li><li> Überprüfen Sie das Gerät Partikel. Mit umkehrbarer Klebeband entfernen diese. </li><li> Mikrofluidschaltung unter Verwendung eines Dünn PDMS-Schicht auf einem Deckglas montiert eingekapselt: Diese werden durch Gießen einer kleinen Volumen (~ 0,5 ml) der PDMS-Härter-Gemisch (10:1, 601) auf der Basis eines flexiblen hergestellt, bakteriologische Klasse Petrischale. Drücken Sie vorsichtig ein Deckglas auf die PDMS-Schicht, legen Sie auf der Herdplatte und thermisch Heilung für ein paar Minuten. Schnell nach dem Abkühlen mit einem Skalpell aus der Petrischale ausgeschnitten und das Deckglas Preis-PDMS-Doppelschicht. Schneiden mit der Schere, wenn nötig. </li><li> Plasma Bindung der PDMS-Gerätund Trägerschicht, eine gute Abdichtung zu produzieren: Optimale Bedingungen sind gerätespezifischen. Beispielsweise ein Plasmaofen, der bei 70 W und 40 kHz in einer Sauerstoffatmosphäre 0,2 mbar für 40 Sekunden erzeugt eine ausgezeichnete PDMS PDMS-Bindung. Sobald Plasma behandelt, drücken Sie beide Teile zusammen und lassen für eine Minute, um vollständig Bindung. </li><li> Verwenden Sie Silikonschlauch (1,6 mm ID, 3,2 mm AD), um mit Pumpen und Spritzen-Schnittstelle. </li></ol> 3. Biomaterial Strukturierung und Mikrofluidik-Operationen Die Protokolle für die In-situ-Biomaterial Strukturierung Neuronenkultur und fluidischen Behandlungen sind in Fig. 2 dargestellt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Illustrated mikrofluidischen Protokolle. A) PL und PLL-g-PEG Strukturierung; Zugabe des Zellhaftschicht (z. B.PL, grün), mit der Verdampfung ausgerichtet Herstellung der Wasser Maske B) Atmosphärische Luft Plasmabehandlung der PL ausgesetzt. zwei Antennenstifte verwendet werden, mit der mit einem rosa Stern. C) PBS (blau) Waschen durch Aspiration wird verwendet, um eine Kontaminierung des plasmabehandelten Region mit PL. D) Lieferung von PLL-g-PEG (rot dargestellt Plasma Einführung Antenne ) durch Aspiration zum Beschichten der plasmabehandelten Bereiche E) für Zellen. gleichzeitige mikrofluidischen Anordnungs von Neuronen zu beiden flankierenden Fächer durch Aspiration, F) Medien (pink) Perfusion mit der hydrostatischen getriebenen Strömung G) Isolierte fluidischen Behandlungen. Behandlung von peripheren einem Testmittel (schwarz) von der Unterseite flankierenden Einlass geliefert durch Aspiration und H) zentrale Behandlung von unten zentralen Einlass durch Aspiration ausgeliefert. Abbildung und Legende wiedergegeben mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Unmittelbar nach der Plasma Verbinden der PDMS mikrofluidischen Kanälen stark hydrophil sind (Kontaktwinkel ≤ 5 °). Solche Oberflächen sind für die Adhäsion und die Kultur von Zelllinien, wie differenziert menschlichen SH-SY5Y-Neuronen-ähnliche Zellen. Für die ex vivo-Kultur von primären Neuronen und die Kultur von neuronalen Vorläuferzelllinien, wie der menschliche Lund Mesencephalon-Zelllinie (LUHMES) einem Polyamin Beschichtung entweder Polylysin (PL) oder Polyornithin (PO), wird als eine elektrostatische Anker erforderlich. Neben Haftproteine ​​wie Laminin oder Fibronectin werden oft als Integrin-Schnittstelle Beschichtung erforderlich. Allerdings sind die PL-und PO-Beschichtungen binden leicht Neuronen behindern die mikrofluidischen Lieferung an den Array-Sites und auch imposante unerwünschte Scherspannungen. Um dieses Problem zu lösen, in dem Chip BiomaterialStrukturierung erforderlich ist, um die Haftung Materialien an den Fangstellen und den Auswuchs Mikrokanäle zu lokalisieren. Dies fördert auch die Entwicklung von inter-Fach-Verbindungen und reduziert die lokale Verschränkung. Das Protokoll schließt auch die Zugabe von PEG-Materialien zu benachbarten Bereichen zu gewährleisten, Proteine ​​und Neuronen während längerer Kultur zu den gewünschten Stellen beschränkt. Das folgende Protokoll ist in Fig. 3 dokumentiert: <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Wasser Maskierung für Biomaterial Strukturierung durch Plasma Schablonieren. A) Illustration des Wasser Maskierung mit den PDMS Mikrosäulen Pinning die Wassermeniskus im Ort für Plasma-Schablonieren. Krümmung des Meniskus in der vertikalen Ebene vernachlässigt wurde. B) Wasser Maske mit einem roten Farbstoff sichtbar gemacht und durch Meniskus p positioniertInning. C) Die strukturierte PL-FITC Beschichtung nach der Plasma Schablonieren. D abgebildet) Zugabe von Protein-und Zell Ablehnung abweisend PLL-g-PEG-TRITC einem Plasma-gemusterten PL-FITC-Beschichtung. Dies wurde für die Registrierung von SH-SY5Y-Zellen und auch zur Strukturierung eine zusätzliche Schicht für Fibronektin LUHMES Zellen verwendet. Abbildung und Legende mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry (RSC) wiedergegeben 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <ol><li> Wasser Maskierung für In-situ-Biomaterial Strukturierung von Plasma Stenciling <ol><li> Kurz nach der Plasmabindungs ​​Pipette eine 0,5 ul Volumen von PL oder PO (100 ug / ml in 1x PBS) in der unteren Mitte-Port. Innerhalb weniger Sekunden die gesamte Mikrofluid-Kreislauf wird durch Kapillarwirkung gefüllt. Lassen für ein paar Minuten vollhydrophile Beschichtung der Oberflächen mit dem PDMS polyAMinen. </li><li> Entfernen ungebundenen Polyaminmoleküle durch Aspiration getriebenen Waschen mit 1x PBS (siehe Abbildung 2C) für 1 min. </li><li> Entfernen Sie alle PBS von den Häfen und erhitzen Sie das Gerät durch die Beleuchtung mit einem Mikroskop. Dies erhöht die Verdunstung aus den Ports für schnelle Wassermaskenbildung. Das Wasser-Maske (in 3A dargestellt und dokumentiert in 3B) in ca. 5 Min. etabliert. </li><li> Überprüfen Sie das Gerät durch Mikroskopie, um sicherzustellen, Wasser Maskierung abgeschlossen ist. Bitte beachten Sie, Reservoir-Strukturen vor der Array-Website werden in der Masken-Design enthalten, um die Stabilität des Wasser Maske (~ 15 min) zu verlängern. </li><li> Edelstahlstifte in den Häfen (2B). Diese werden von einem Paar der Atmosphärendruck-Handkoronaentladung oder Tesla-Generator erzeugte Plasma (zB, die bei 2 MHz, 30-kV-Signal) 19,20 in die leeren mikrofluidischen Kanälen. Richten Sie die Spitze von Ter Plasma-Quelle in der Nähe der Spitze der ein Stift-und Plasma-Behandlung für den Mikrokanal ≤ 1 sek. Verwenden schlechten Lichtverhältnissen an Plasma Strukturierung beobachten. </li><li> Entfernen Sie den Wasser Maske mit einem Waschschritt. Verwenden Sie parallel Aspiration von den oberen drei Ports. Verwenden Sie 4 gleich langen Silikonschlauch mit einer 4-Wege-Adapter an eine Absaugpumpe angeschlossen, um parallel Aspiration zu erreichen. Starten Anspruch und verzichten PBS in die unteren 3 Ports zu PBS durch den mikrofluidischen Schaltkreis zu ziehen. Auf diese Weise ein PDMS-Polyamin Materialkontrast erzeugt wird (siehe Abbildung 3C). Evacuate PBS von mikrofluidischen Kreis und für mehrere Stunden, um die native, hydrophoben Zustand wiederherzustellen. Dies macht die PDMS vollständig nicht-permissiven Zellhaftung. </li><li> Sollten zusätzliche Haftmaterialien, wie Laminin oder Fibronectin, benötigt die folgenden Schritte erforderlich sind und unmittelbar nach der Entfernung des Wassers Maske sollte getan werden: Pipette 10 ul Volumen der Pfropfcopolymer Poly-L- Lysin-poly (ethylenglykol) (PLL-g-PEG, 100 ug / ml in PBS) in die beiden unteren flankierenden Kanäle und anschließend durch Absaugen von der oberen flankierenden Kanäle für 2 min. </li><li> Ohne Unterbrechung des Flow, überschüssige PLL-g-PEG durch Austausch mit einem PBS-Puffer. Diese Schichten selektiv die nicht-Polyamin-beschichteten Bereiche mit der PEG-Einheit wirkt, um die Proteinadsorption und Zelladhäsion 17,21 verhindern. </li><li> Haftproteine ​​wie Laminin oder Fibronectin kann dann co-lokalisiert mit dem Poly-Amin-Beschichtung werden: Je 10 ul-Volumina dieser ECM-Proteine ​​(typischerweise 10 ug / ml) in allen drei unteren Ports. Absaugen aus den Top drei Ports, bis das Gerät mit der Proteinlösung gefüllt und Inkubation für 1 Stunde, um eine gute Qualität Beschichtung herzustellen. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Proteine ​​durch Absaugen PBS von den unteren 3 Ports. </li></ol></li><li> Mikrofluidik-Einzel Neuron Arraying <ol><li> Prime die Geräte mit entspreaß Medien. In 20 ul-Volumina zu den unteren 3 Ports und durch parallele Streben von den oberen drei Ports schnell füllen die Mikrofluidik-Schaltung mit Medien. Mit einem 4-Wege-Rohrverbinder zum Koppeln der oberen Ports über 3 gleich langen Silikonschlauch mit einer Saugpumpe. </li><li> Mit 20 &amp;mgr; l einer Zellsuspension aufgeschlüsselte (1 x 10 6 Zellen / ml) in jede der flankierenden Einlassöffnungen (0, in Fig. 1). </li><li> Anlegen einer Absaugpumpe mit einem Durchflussregler oder verwenden Sie eine Spritze für leichtes Ansaugen von den oberen drei Ports. Komplette Neuron Anordnungs erfordert in der Regel 1 min. </li><li> Ernten Sie überschüssige Neurone in den vier flankierenden Ports mit einer Pipette zum Ordnen in nachfolgenden mikrofluidischen Systemen bleiben. </li><li> Entfernen Sie die Schläuche. Füllen Sie alle Häfen mit Medien und stellen Sie das Gerät in den Inkubator. Innerhalb weniger Stunden werden die Zellen voll haft auf dem Biomaterial-Muster. </li></ol></li><li> Neuron Kultur, Selective Treatment Fluidic und Immunostaining <ol><li> Tauschen Sie die Medien durch regelmäßige Durchblutung mit hydrostatischen Versorgungs (a 2 mm Säulenhöhe Unterschied ist entsprechend langsam). </li><li> Alternativ tauchen die Mikrofluidik-Vorrichtung in Medien, periodisch Austausch der Medien (2-3 Tage) wie bei Standard-Zellkulturen. </li><li> Selektive Fluid Behandlungen entweder Neuron Kulturabteil oder der zentralen Neuritenwachstum Raum werden wie folgt erreicht: Dosiernadel 20 &amp;mgr; l der Testsubstanz in die untere Öffnung des Kanals von Interesse und Aspirat vom Port direkt über. Für langwierige Behandlungen reduzieren die Durchflussrate mit einem Durchflussregler und füllt die Testsubstanz als erforderlich. </li><li> Immunfärbung Protokolle sind für jeden molekulare Ziel und zugehörigen Reagenzien. Um die potentielle Gefahr der scherinduzierten Schädigung der Neuronen eine langsame Strömungsgeschwindigkeit verwendet entgegenzuwirken. Dies führt zu erhöhten Verarbeitungszeiten vollständig durchströmen die Anlage, die sich normal Protokoll Zeiten. Hystatischen Perfusion über Ports mit unterschiedlichen Höhen Spalte (z. B. von 2 mm) wurde verwendet, um Reagenzien zu liefern. Mehr schnelle Zugabe von Reagenzien und Entfernung mit Hilfe einer Pumpe kann zur experimentellen Zeitskalen zu reduzieren. Schließen Sie eine Saugpumpe zu den oberen 3 Ports Reagenzien von den unteren 3 Ports zu ziehen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die mikrofluidische Anordnungs Technik ist die erste ihrer Art, die Präzision einzelnen Neurons Handhabung für die Einrichtung minimalistisch Kulturen ermöglicht. Mit der in-situ-Biomaterial-Strukturierungsverfahren, einem leistungsfähigen Ansatz zur Zellmuster mit mikrofluidischen Strukturen auszurichten Gekoppelt sind diese minimalistischen Kulturen Hoch intercompartment Connectivity-Level mit eingeschränkter lokale Verschränkung. Diese Merkmale können für die effiziente Untersuchung von interFach Übertragung...

<html> Nervengewebe ist sehr komplex; eine heterogene Zellmischung, die räumlich in definierten Schichten und Fächer und mit Kunststoff-Konnektivität über Zell-Kontakte und vor allem über Axon und Dendriten Auswüchse bestellt wird. Neue Techniken sind erforderlich, um mehr experimentelle Freiheit, tiefere Einblicke und entwirren zentralen Mechanismen der Krankheit, Entwicklung und gesunde Funktion gewinnen verleihen. Die Campenot Kammer 1,2 und kürzlich mikroAusführungs 3,4 kann für die ex vivo Herstellung von vernetzten neuronalen Co-Kulturen mit der Fähigkeit, ihre Neuriten Auswüchse selektiv stören die verschiedenen somatischen Populationen und auch verwendet werden. Diese mikrofluidischen Bauteilen haben beispielsweise verwendet, um Axon-Degeneration und Regeneration zu studieren folgenden chemischen 5,6 oder Laser-Axotomie 6-8, Tauopathie 9, virale Verbreitung 10,11, und mRNA-Lokalisierung in Axone 4. ent &quot;&gt; Um die Reichweite der Neurobiologen erstrecken, sind technologische Entwicklungen erforderlich, um minimalistische neuronalen Co-Kulturen vorzubereiten. Dies ermöglicht die Herauslösung des neuronalen Netzes für die Ermittlung des Systems mit einzelnen Zelle und subzellulären Präzision. Die Anforderung für eine minimale Zellzahlen eröffnet die Möglichkeit, seltenen Zelltypen, einschließlich dopaminergen Substantia nigra-Zellen relevant Parkinson, Spiralganglien aus dem Ohr, peripheren Neuronen zu analysieren, und Stammzellen. Darüber hinaus ist Mobilwirtschaft, die für die 3R-Initiative. Mit Hilfe dieser Mikrofluidik-Plattformen, große Bildschirme Toxizität oder andere Hochdurchsatz, können die Daten reichen Versuchsreihen, die Tier Neuronen betrachtet. In diesem Papier Protokolle für die Herstellung und Verwendung einer Mikrofluid-Vorrichtung beschrieben. Mikrofluidik-Anordnungs in Kombination mit einem in situ Biomaterialienal Musterungsverfahren können für die Registrierung von hochvernetzten neuronalen Co-Kulturen mit minimalem Zellzahlen verwendet werden. Mikrofluidik-Anordnungs auf einem Differenzstrom-Ansatz 12-15, wobei mikro Traps in einem Fluidkreis (mit REM-Bildern in Fig. 1 dargestellt) auf der Basis positioniert. Der Pfad 0 → 1 die untere fluidische Widerstand (R 2&gt; R 1) zum Transportieren Neuronen zu einer linearen Anordnung von mikrostrukturierten Öffnungen - die Einlässe zu den Neuriten-Auswuchs-Kanälen. Belegung der Falle durch eine einzelne Zelle lokal behindert den Durchfluss auf die Stromlinien zum Einfangen nachfolgenden Zellen in benachbarten Fallen abzulenken. Vollständige Belegung der Fallen in der Anordnung schaltet das fluidische Verhältnis (R 1&gt; R 2), um die Stromlinien in den Serpentinenpfad (0 → 2) umzuleiten, um eine Bypass-Betriebsmodus für die Entfernung von überschüssigem Neuronen zu erzeugen. Abbildung 1. Mikrofluidik-Circuit. A) Die differentielle Widerstand Fluidkreis für einzelnes Neuron Anordnungs, mit flankierenden Kulturkammern von Neuritenwachstum Kanäle miteinander verbunden. B, C) ​​SEM-Bilder der Doppelschicht compartmentalized Neuron Co-Kultur-Array mit Meniskus Pinning Mikrosäulen. Mit diesem Entwurf wurden Dreizack-förmigen Neuron Fangstrukturen verwendet, um Faszikulation der Neuriten Auswüchse zu fördern. Abbildung und Legende mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry (RSC) wiedergegeben 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Die Herstellung von mikro neuronaler Netzwerke auf ebenen Substraten kann leicht erreicht werden (exampl<html> es aus unserer Gruppe finden Frimat et al. 16 und Heike et al. 17). Allerdings Verkapselung bioaktiven Material Muster in PDMS-Geräten und mit der Anforderung des Mikrometer-Skala Ausrichtung der diese den mikrofluidischen Kanälen stellt eine große technische Herausforderung. In Abschnitt 3.1 wird ein Protokoll für die in dem Chip oder in situ Herstellung von Biomaterial-Muster dargestellt. Diese Muster ermöglichen Neuron Anmeldung bei längeren Zeitskalen und Kultur zu fördern Auswüchse zwischen Fächern. Meniskus-Pinning Mikrostrukturen verwendet werden, um eine so genannte Wasser-Maske mit dem Neuron Anordnen Sites und Neuritenwachstum Kanälen auszurichten. Das Wasser Maske schützt Adhäsionsmolekül Beschichtungen während der Plasmabehandlung, während exponierten Flächen werden aufgelöst, das Biomaterial Muster definieren. Zusätzlich sind Protokolle für die Zellkultur und für die fluidische Trennung für die selektive Behandlung der verschiedenen Co-Kultur Kammern notwendig ist. ve_content &quot;&gt; Die Protokolle sind auf die benutzerfreundliche Prinzipien der Softlithographie für die Replikation von Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen 18 zu nutzen. Auch in situ Biomaterial Musterung ist einfach, die Nutzung Verdunstung und Oberflächenspannung Phänomene und nur erfordern eine preiswerte Hand-Plasmaquelle. Mikrofluidik-Schaltung effektiv Programme Zelle Laderaum und spezielle Behandlungen machen diese Operationen nur eine Frage der Abgabe von Materialien in die richtige unteren Anschluss und Absaugen von oben. Auf diese Weise beabsichtigt ist, die Neurobiologen geben die Freiheit, in den eigenen Labors herzustellen und zu verwenden mikrofluidischen Bauteilen.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm dick</td></tr><tr><td>3 mm Biopsiestempel</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Vorsichtig handhaben - extrem scharf</td></tr><tr><td>Tygon Schlauch</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1,65 mm ID; 3,35 mm OD</td></tr><tr><td>1 ml Spritze ( Inkjekt und Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>4-Wege-Schlauchverbinder</td><td>VWR oder Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflussregler</td><td>Harvard Gerät</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Stifte</td><td>Schneiderei Abteilungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3,5]-PEG(5)</td><td>Stabilität bei der Lagerung kann ein Problem sein</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Polylysin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>Polyornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beispiel Aspirationspumpe</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>Tragbares Korona-Entladegerät</td><td>Leybold-Heraeus, USA</td><td>VP23</td><td>Entspricht möglicherweise nicht den Sicherheitsstandards Ihres Landes</td></tr><tr><td>Femto-Plasma-Ofen</td><td>Diener Elektronischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator oder Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der neuronalen co-kulturen mit single cell precision

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Mikrofluidik-Ausführungsformen der Campenot Kammer haben großes Interesse aus der Neurowissenschaften angezogen. Diese miteinander verbundenen Co-Kultur-Plattformen verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen zu untersuchen, Spanning Entwicklungs-und Funktions Neurobiologie, um Infektionen und Krankheiten Ausbreitungs werden. Herkömmliche Systeme benötigen jedoch erheblichen Zell Eingänge (viele Tausende pro Fach), für das Studium geringer Menge Zellen unzureichend, wie primäre dopaminergen Substantia nigra, Spiralganglien und Drosophila melanogaster Neuronen und unpraktisch für die Hochdurchsatz-Experimente. Die dichten Kulturen sind auch sehr lokal verstrickt, mit wenigen Auswüchse (&lt;10%), die die beiden Kulturen. In diesem Papier einfach mikro-und Musterprotokolle beschrieben, die diese Herausforderungen anzugehen: (i) eine mikrofluidische einzelnen Neurons Anordnungsverfahren, und (ii) eine Wassermaskierungsverfahren für Plasma-Strukturierung Biomaterial Beschichtungen auf register Neuronen und fördern Auswuchs zwischen den Abteilen. Minimalistische neuronalen Co-Kulturen wurden mit High-Level (&gt; 85%) intercompartment Konnektivität bereit und kann für hohe Durchsatz Neurobiologie Experimente mit einzelnen Zelle Präzision verwendet werden.

Wasser Maskierung Exploits Oberflächenspannung. Die Drucktoleranz an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche skaliert invers mit dem Krümmungsradius [ <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , Herstellung hochstabiler Schnittstellen an mikrofluidischen Dimensionen. Die Mikrosäulen das Wasser effektiv zu verankern Maske an Ort und Stelle. Wassermaskenbildung wird durch Verdunstung aus den mikrofluidischen Häfen getrieben, mit der Rate erhöht durch Erhitzen. Mit der Wärme aus geringer...

Protokolle für die einzelnen Neurons mikrofluidischen Anordnungs und Wasser für die Maskierung in dem Chip Plasma Strukturierung der Biomaterial-Beschichtungen beschrieben. Sehr verbunden Co-Kulturen können mit minimalem Ein-Zelle hergestellt werden.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Neuronen in zwei mikrofluidischen Kammern anzuordnen, um eine verbundene neuronale Kokultur herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das mikrofluidische Gerät durch Abformung in PDMS hergestellt und durch Plasma-Bonding verkapselt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Polylysin innerhalb des mikrofluidischen Geräts zu strukturieren.Dies wird erreicht, indem das Gerät mit Polylysin gefüllt wird, wodurch durch Verdunstung eine Wasseransammlung entsteht, und anschließend eine Plasmabehandlung eingesetzt wird, um das exponierte Polylysin zu entfernen und so das Biomaterialmuster zu erzeugen. Danach saugt man mit einer Spritze die Neuronen durch die mikrofluidische Schaltung, um eine Anordnung einzelner Neuronen zu erzeugen. Das Gerät wird in den Zellkultur-Inkubator gestellt, damit sich die Neuriten ausbilden und die beiden Neuronenpopulationen miteinander verbinden können.Der letzte Schritt beinhaltet die Verwendung einer Aspirationspumpe, um ein Kompartiment gezielt zu behandeln und die Ausbreitung von Materialien und pathologischen Veränderungen innerhalb des neuronalen Netzwerks zu überwachen. Die Durchführung des Verfahrens wird Yayu Chang und Sarada aus dem ISIS-Labor demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise kommerziell erhältlichen PDMS-Kompartimentkammern, liegt darin, dass die neuronale Co-Kultur mit einzelnen Zellpositionen präpariert wird, um individuelle neuronale Algorithmen analysieren zu können.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten. Zum Beispiel: Welcher Mechanismus liegt der Ausbreitung hyperphosphorylierter Tau-Aggregate bei der Alzheimer-Krankheit zugrunde, oder wie breitet sich ein infizierender Organismus im Gehirn aus? Die Technik eignet sich ideal für Hochdurchsatzanwendungen, da für jede experimentelle Bedingung nur wenige hundert Neuronen benötigt werden.Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie das PDMS-Präpolymer gründlich mit dem Härter im Verhältnis 10 zu 1 mischen. Entgasen Sie die Mischung anschließend typischerweise 20 Minuten lang in einem Vakuum-Exsikkator. Danach platzieren Sie den zweilagigen, mikrostrukturierten SU-8-Wafer auf einer Heizplatte mit 80 Grad Celsius und richten die Polymerrahmen an jedem Bauteil auf dem Wafer aus.Geben Sie PDMS in den Rahmen und lassen Sie es eine Stunde lang zur vollständigen thermischen Aushärtung stehen. Entfernen Sie danach das Wafer von der Heizplatte und lassen Sie es auf einer flachen Oberfläche abkühlen. Anschließend hebeln Sie, unter Tragen von Schutzbrille, vorsichtig mit einem starren Skalpell den Rahmen und das PDMS von einer Ecke des Wafers ab.Entfernen Sie die PDMS-Form aus dem Rahmen und schneiden Sie das Gerät mit einer Schere zurecht. Tragen Sie das verbleibende PDMS auf die gesamte Wafer-Oberfläche auf, um diese während der Lagerung zu schützen. Beim Abziehen dieser PDMS-Schicht vom Wafer werden alle partikulären Verunreinigungen von der Oberfläche entfernt, sodass die Oberfläche für eine erneute PDMS-Formgebung vorbereitet ist.Bereiten Sie nun die sechs Schnittstellenanschlüsse mit einem dreimillimeterigen Biopsiestanzer vor, wobei die mikrostrukturierten Merkmale nach oben zeigen, um die Ausrichtung der Anschlüsse mit den mikrofluidischen Kanälen zu erleichtern. Untersuchen Sie das Gerät auf Partikel und entfernen Sie diese mit einem reversiblen Klebeband. Bereiten Sie anschließend eine dünne PDMS-Schicht vor, die auf einem Glasdeckel aufgebracht ist, indem Sie eine kleine Menge der PDMS-Härtungsmittelmischung auf die Petrischale gießen.Platzieren Sie einen Deckgläser auf der PDMS-Schicht. Stellen Sie sie auf die Heizplatte und härten Sie sie thermisch für etwa 10 Minuten aus. Kurz nach dem Abkühlen und unter Tragen einer Schutzbrille lösen Sie das Deckglas vorsichtig mit einem Skalpell.PDMS-Bilayer von der Petrischale nehmen, um die Vorrichtung zu verkapseln. Eine gute P-D-M-S-P-D-M-S-Bindung ist erforderlich. PDMS-Bilayer und die mikrofluidische Vorrichtung für 40 Sekunden in den Plasmaofen stellen.Nach der Plasma-Behandlung beide Teile zusammenpressen und kurz nach der Plasmabehandlung 0,5 Mikroliter Polylysin in den unteren mittleren Port pipettieren. Innerhalb weniger Sekunden sollte das gesamte mikrofluidische System durch Kapillarwirkung gefüllt sein. Anschließend einige Minuten stehen lassen, damit die hydrophilen PDMS-Oberflächen vollständig mit Polylysin beschichtet werden können.Als Nächstes entfernen Sie das nicht gebundene Polylysin durch aspirationgetriebenes Waschen. Verwenden Sie eine Vier-Wege-Verbindung, um die Pumpe mit den oberen drei Anschlüssen über Schläuche gleicher Länge zu verbinden, und beginnen Sie die Aspiration. Geben Sie PBS zu den unteren drei Anschlüssen hinzu und waschen Sie eine Minute lang. Trennen Sie anschließend die Schläuche ab und entfernen Sie restliches PBS aus den Anschlüssen.Überführen Sie das Gerät unter dem Mikroskop und erhitzen Sie es mithilfe der Beleuchtung, um die Verdunstung aus den Öffnungen zur schnellen Bildung der Wasser-Maske zu fördern. Überprüfen Sie das Gerät mikroskopisch, um sicherzustellen, dass die Wasserabdeckung vollständig ist. Anschließend werden Edelstahlnadeln in die Öffnungen eingeführt, um das Plasma eines handgehaltenen Koronaentladungsgeräts in die freien mikrofluidischen Kanäle einzukoppeln.Richten Sie die Spitze der Plasmaquelle nahe an die Spitze eines Stifts und erzeugen Sie Plasma. Behandeln Sie den Mikrokanal eine Sekunde lang. Danach entfernen Sie die Stifte und verbinden die drei oberen Anschlüsse mit der Pumpe.Beginnen Sie mit der Aspiration und geben Sie PBS in die unteren drei Anschlüsse. Um PBS durch den mikrofluidischen Kreislauf zu ziehen. Entfernen Sie sämtliches PBS aus dem mikrofluidischen Kreislauf und lassen Sie ihn über Nacht, um die Biomaterialstrukturierung abzuschließen.Hier wird das Muster mithilfe von mit Fluorescein markiertem Polylysin sichtbar gemacht. In diesem Verfahren spülen Sie das Gerät zunächst mit geeignetem Medium, indem Sie 20 Mikroliter in jede der drei unteren Anschlüsse geben. Anschließend verwenden Sie eine parallele Aspiration über die drei oberen Anschlüsse, um den mikrofluidischen Kreislauf schnell mit Medium zu füllen.Geben Sie 20 Mikroliter einer disaggregierten Zellsuspension in jeden der seitlichen unteren Anschlüsse. Saugen Sie vorsichtig mit einer Spritze an den oberen drei Anschlüssen ab. Die vollständige Neuronenorientierung erfordert typischerweise eine Minute.Danach mit einer Pipette überschüssige Neuronen, die in den Anschlüssen für einen Ring in nachfolgenden mikrofluidischen Vorrichtungen verbleiben, gewinnen. Dieses Beispiel zeigt, wie Neuronen mit Einzelzellpräzision angeordnet werden. Anschließend die Vorrichtung in Medium eintauchen und in den Inkubator stellen, damit die Zellen innerhalb weniger Stunden vollständig an dem biomaterialbasierten Muster haften können.Wie bei normalen Kulturen sollte das Medium regelmäßig erneuert werden, um entweder das Neuronenkultur-Kompartiment oder das zentrale Neuro-Auswuchs-Kompartiment selektiv zu behandeln. Geben Sie 20 Mikroliter der Testsubstanz in den unteren Anschluss, der mit dem gewünschten Kanal verbunden ist, und aspirieren Sie aus dem direkt darüber liegenden Anschluss. In diesem Beispiel wurde eine selektive Behandlung des zentralen Kompartiments durchgeführt, und in diesem Beispiel wurde das angrenzende Kompartiment behandelt.Die Behandlungen wurden innerhalb einer Minute eingerichtet und 60 Minuten lang aufrechterhalten. Die neuronale Kokulturen können anschließend überwacht werden, um die Ausbreitung von Materialien oder Pathologien zu messen. Sobald die Technik beherrscht ist, können viele mikrofluidische Vorrichtungen an einem einzigen Vormittag hergestellt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie in Ihren eigenen Laboren minimalistische neuronale Kulturen herstellen und diese nutzen können, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Material- und Krankheitsausbreitung im Gehirn zugrunde liegen.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

Wir entwickelten eine neuartige Multi-Kompartiment-Neuron Co-Kultur Mikrosystem-Plattform für in-vitro-ZNS-Axon-Glia-Interaktionen Forschung. Die Plattform ist in der Lage die Durchführung von bis zu sechs unabhängigen Experimenten parallel und wurde unter Verwendung eines neu entwickelten Makro / micro hybrid Herstellungsverfahren.

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Hier bieten wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung von Ratten kortikalen Neuronen in der Gegenwart eines Glia-Feeder-Schicht. Die kultivierten Neuronen zu etablieren Polarität und erstellen Synapsen, und kann von der Glia für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen, wie zB Elektrophysiologie, Kalzium-Imaging, das Überleben der Zelle Assays, Immunzytochemie und RNA / DNA / Protein-Isolierung getrennt werden.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Unterscheidung von menschlichen neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in Neuronen. Die NPCs werden in eine etablierte Astrozyten-Ratten-Kortikalneuronen-Kokultur der Maus eingeführt, wodurch die NPC-Differenzierung in Neuronen gefördert wird. Die Differenzierung wird durch die Visualisierung der Zellen unter einem konfokalen Mikroskop bestätigt.

Eine Co-Kulturtechnik zur Differenzierung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen in Neuronen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung einer indirekten Neuron-Astrozyten-Co-Kultur unter Verwendung eines kompartimentierten Ansatzes. In diesem Aufbau sind Neuronen und Astrozyten räumlich getrennt, teilen sich aber ein konditioniertes Medium. Neurotrophe Faktoren, die von Astrozyten freigesetzt werden, fördern die Differenzierung von Neuronen und die Bildung synaptischer Verbindungen, was auf Neuron-Glia-Interaktionen hindeutet.

Eine indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kulturtechnik zur Untersuchung von Neuron-Glia-Interaktionen

Menschen neuroprogenitor Zellen (NPCs) wurden unter proliferierenden Bedingungen erweitert. NSC wurden in Neuron-reiche Kulturen in der Gegenwart einer Kombination von Neurotrophinen unterscheiden. Neuronale Marker wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Um eine reine Population von Nervenzellen zu isolieren, wurden NPCs auf PEN-Membran-Folien differenziert und Laser-Mikrodissektion durchgeführt wurde.

Laser Capture Mikrodissektion von Neuronen aus Differenzierte Menschen Neuroprogenitor Zellen in Kultur

Ein Protokoll zur Generierung eines Co-Kultursystems, bestehend aus Neuronen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abstammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten wird beschrieben. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht den Nachweis der Bildung von synaptischen Kontakten und Schaltkreisen zwischen neuen, iPSC-abgeleiteten Neuronen und bereits vorhandenen kortikalen Neuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung "Aktivität" Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.

Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry

Erfahren Sie die mikrofluidische Einzelzellanordnung von Neuronen für verbundene Co-Kulturen mit minimalem Zellaufwand. Diese Methode ermöglicht präzise Biomaterialbeschichtung und Studien neuronaler Interaktionen.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

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