Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Neurowissenschaften zu beantworten, wie die interzelluläre Kommunikation zwischen mehreren menschlichen neuronalen Zelltypen zur Bildung und Funktion synaptischer Schaltkreise beiträgt. Diese Technik erzeugt schnell und systematisch dreidimensionale Kokulturkugeln von funktionell reifen Astrozyten und Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Diese können für rigorose experimentelle Untersuchungen verwendet werden.

Die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit dieses Protokolls ist eine definierte Alternative zu den aufkommenden Organoid-Technologien. Diese sind vielversprechend für die Entwicklung neuartiger Medikamente und zellulärer Transplantationstherapien zur Förderung der Neuroregeneration nach Verletzungen oder Krankheiten. Beginnen Sie damit, Cluster von HPSCs in zwei Millilitern HPSC-Medium, das den Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 enthält, in jede Vertiefung einer EZM-beschichteten Sechs-Well-Platte zu setzen.

Pflegen Sie die Stammzellen, bis sie zu etwa 50 % konfluent sind, und wechseln Sie dann das Medium zu einem neuronalen Medium, das SB431542 und DMH1 enthält, um die neuronale Induktion zu fördern. Wenn die Zellen zu etwa 95 % konfluent sind, teilen Sie jede Vertiefung eins bis sechs in neue EZM-beschichtete Vertiefungen auf. Am Tag 14 werden die Zellen mit einer Ablöselösung dissoziiert und der Inhalt jeder Vertiefung in einen unbeschichteten T25-Kolben mit Y-27632 enthaltendem Medium überführt, um die Bildung von Aggregaten zu fördern.

Um Astrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten in spontan gebildeten 3D-Aggregaten zu erzeugen, wechseln Sie zu einem neuronalen Medium, das EGF und FGF2 enthält, und füttern Sie alle drei bis vier Tage, bis die Astrozytenidentität nach vier bis sechs Monaten bestätigt ist. Standardmäßig erzeugt dieses Protokoll dorsale kortikale Astrozyten. Astrozyten-Subtypen können jedoch regional durch Zugabe von Mustermorphogenen spezifiziert werden, falls gewünscht.

Einmal pro Woche, wenn dunkle Zentren auftreten, sammeln Sie die Kugeln durch Zentrifugation und dissoziieren Sie dann die H-Astro-Aggregate vorsichtig mit einer Ablösung. Plattieren Sie nur die Kugeln neu, die sich nicht spontan anheften, um ein Passieren von Nicht-ZNS- und Nicht-Nervenzellen zu vermeiden. Nach vier bis sechs Monaten der Expansion bestätigen Sie die Zellidentität entweder in einem Gefrier- und Kryokonservierungsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers oder verwenden Sie es sofort für Experimente.

Für die Erzeugung von nicht-transgenen neuronalen Vorläuferzellen in Neuronen oder H-Neuronen seeden day-14 HPSC-abgeleitete neurale Vorläuferzellen in EZM-beschichtete Sechs-Well-Platten mit zwei Millilitern neuronalem Medium und Y-27632 pro Well. Wenn Sie mit Doxycyclin-induzierbaren iNeuronen arbeiten, fügen Sie doxycyclinhaltiges neuronales Medium hinzu, wenn die Zellen zu etwa 35 % konfluent sind, um die Differenzierung zu induzieren und die Genexpression zu aktivieren. Nach zwei Tagen füttern Sie transgene und nicht-transgene Linien mit zwei Millilitern neuronalen Medien pro Vertiefung und Tag.

Fahren Sie fort, bis die Zellen bereit sind, sich bei 70 % Konfluenz zu heben. Für Kokulturen trennen Sie zunächst H-Astros vorsichtig von 3D-Aggregaten mit Ablösung. Fahren Sie dann fort, H-Neuronen oder iNeuronen von einer 2D-Monoschicht zu dissoziieren.

Entfernen Sie zunächst das Medium von der Sechs-Well-Platte und geben Sie 500 Mikroliter Ablöselösung in jede Vertiefung, die Monolayer-Kulturen enthält. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fügen Sie vorsichtig zwei bis drei Milliliter DMEM-F12-Medium hinzu, um die anhaftenden Zellen zu entfernen.

Sammeln Sie dann die Zellen in Medium in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 300-fachem G. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie einen Milliliter frisches Medium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Mikropipette auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie jeden Zelltyp mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.

Geben Sie das gewünschte Verhältnis von dissoziierten H-Astros und H-Neuronen oder iNeuronen in einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 100 mal G und kehren Sie für zwei Tage in den Inkubator zurück. Nach einem Tag sollten sich dicht gepackte Mikrokügelchen in der Platte gebildet haben.

Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Mikropipette, um die Kugeln vorsichtig aus den Mikrovertiefungen zu entfernen. Üben Sie mit Medium leicht Kraft auf den Boden der Mikrovertiefungen aus, um zusätzlich anhaftende Kugeln zu entfernen. Nachdem Sie alle Kugeln in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt haben, lassen Sie es absetzen.

Waschen Sie dann die Kugeln, indem Sie zuerst das alte Medium ansaugen und dann mindestens zwei Milliliter frisches Medium hinzufügen. Die Kugeln werden in einen Spinnerkolben mit 50 bis 60 Millilitern Medium gegeben. Stellen Sie den Kolben in den Inkubator auf eine magnetische Rührplatte, die auf 60 U/min eingestellt ist.

Für die Synapsenbildung sind mindestens drei Wochen in Kultur erforderlich. Beginnen Sie damit, die Oberfläche jedes Multielektrodenarrays (MEA) mit einem Milliliter Polyornithin zu beschichten, um die Oberfläche hydrophil zu machen, und inkubieren Sie mindestens vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation das Polyornithin und waschen Sie die Oberfläche jedes MEA mit deionisiertem Wasser.

Fügen Sie dann einen Milliliter extrazelluläre Matrix hinzu und kehren Sie für mindestens vier Stunden in den Inkubator zurück. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die extrazelluläre Matrix und tragen Sie dann die Kugeln in 1,5 Millilitern Medium auf die MEA-Oberfläche auf, wobei Sie sicherstellen, dass die Kugeln auf dem Elektrodenarray positioniert sind. Zwei Tage einwirken lassen.

Um die elektrische Aktivität neuronaler Kugeln zu messen, platzieren Sie den MEA auf einem temperaturgesteuerten Kopftisch. Verwenden Sie einen Fünf-Hertz-Hochpassfilter und einen 200-Hertz-Tiefpassfilter mit einer Spike-Schwelle von fünffacher Standardabweichung, um spontane elektrische Aktivität aufzuzeichnen. Speichern Sie Rohdaten, einschließlich Spike-Frequenz und Amplitude für statistische Analysen.

Eingeschränkte Proteinmarker des neuralen Zelltyps, wie MAP2 für Neuronen und GFAP für Astrozyten, zeigen visuell die gleichmäßig verteilte Anordnung und Reife von Astrozyten in Neuronen innerhalb von 3D-Sphären. Eine maximale Projektion der Astrozytenmorphologie und -verzweigung ist in einer repräsentativen 3D-Kugel mit H-Astros dargestellt, die spärlich mit membrangebundenem GFP markiert sind. Ausgereifte H-Astros exprimieren Marker einschließlich GFAP.

Obwohl iNeurone prä- und postsynaptische Proteine exprimieren, wie im Bild links gezeigt, wird die synaptische Dichte durch das Vorhandensein von H-Astros und Kokultur signifikant erhöht. Während der Aufnahmen lösen gesunde Kugeln von iNeurons, die auf MEAs platziert werden, spontan Spannungsspitzen von mehr als 40 Mikrovolt bei gleichbleibenden Zündfrequenzen aus. Kokultur-Sphären weisen eine größere Netzwerkkonnektivität durch das Vorhandensein von H-Astros auf, was zu einer Zunahme von synchronen Netzwerk-Bursts von Spikes führt.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie z.B. die Kalzium-Bildgebung durchgeführt werden, um die physiologische Reaktion der Astrozyten auf synaptische Aktivität zu messen. Darüber hinaus kann eine Transplantation in Tiermodelle durchgeführt werden, um die Konnektivität mit bereits bestehenden synaptischen Schaltkreisen zu untersuchen. Durch die Verfolgung dieses Bioengineering-Ansatzes kann man extrazelluläre Biomaterialien und zusätzliche Zelltypen wie Oligodendrozyten, Mikroglia- und Ethelzellen in spezifischen Verhältnissen einbeziehen, um die komplexe Signalübertragung im Gehirn zu modellieren.