Name: Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Lernen Sie die Cold Plantar Assay-Methode zur Messung von Kälteempfindlichkeit und -adaptation bei Mäusen. Dieses Verfahren ermöglicht Forschern die Bewertung von Überempfindlichkeit und Analgesie in der Neurowissenschaft.

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Die Autoren möchten sich bei den Beiträgen des gesamten Gereau Lab für die Bearbeitung von Manuskripten bedanken. Diese Arbeit wird durch die NINDS-Mittel 1F31NS078852 für DSB und NINDS-Fonds NS42595 für RWG unterstützt.

Alle Mausprotokolle wurden in Übereinstimmung mit National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Tierstudien Ausschuss der Washington University School of Medicine (St. Louis, MO) zugelassen. 1. Vorbereitung der Testplatte und Gehäuse <ol><li> Reinigen Sie die Glasoberfläche. </li><li> Fixierung des T-Typ Faser Thermoelementsonde an der Oberfläche in der Mitte der Glasplatte mit Labor Band. </li><li> Legen Sie die Tiergehege auf der Glasplatte in einer Linie entlang der Mitte der Platte. </li><li> Schrauben Sie die Thermoelementsonde durch das Zentrum Tiergehege und stecken Sie in den Datenlogger. Drehen Sie den Datenlogger an, während Deaktivierung des Auto-Shutdown-Funktion, und befestigen Sie den Datenlogger an den Computer mit dem mitgelieferten Kabel. <ol><li> Wenn die Aufzeichnung der Plattentemperatur während des Experiments, öffnen Sie die Datenlogger-Software Aufnahme Plattentemperaturen zu beginnen. </li><li> Falls erforderlich, stellen Sie die Software neuKabel die Plattentemperatur einmal pro Sekunde. </li><li> Starten Sie die Aufnahme Temperaturen mit Hilfe der Software mit dem Thermodatenlogger verpackt. </li></ol></li><li> Trennen Sie das Gehäuse mit schwarzen Einsätzen, um visuelle Interaktion zwischen Mäusen verhindern. </li><li> Position unterhalb des Glasspiegel, so dass die Unterseite der Gehäuse aus einer bequemen Sitzposition sichtbar ist. </li></ol> 2. Erwärmung / Abkühlung der Glasplatte <ol><li> Füllen Aluboxen mit erwärmtem Wasser, nassem Eis oder Trockeneis und positionieren Sie sie angemessen auf die Glasplatte (Aluminiumfolie Pakete mit Trockeneis gefüllt können auch, um das Glas zu kühlen verwendet werden; Abbildung 1) 2. <ol><li> Für die Prüfung bei 30 ° C, positionieren Sie die Aluboxen etwa 0,25 &#39;&#39; von den Tiergehegen (2B) 2. <ol><li> Legen Sie einen beheizten Wasser Zirkulator auf beiden Seiten der Glasplatte. Stellen Sie den Thermostat auf 45 - 60 ° C, und unsE ist die Alu-Boxen mit einem stetigen Strom von heißem Wasser (1C) 2 zu füllen. </li><li> Positionieren Sie die Umwälzpumpen, dass das heiße Wasser aus den Aluboxen entwässert direkt zurück in das Reservoir des Thermostaten auf jeder Seite (Abbildung 1 C) 2. </li></ol></li><li> Für die Prüfung bei RT, lassen Sie die Felder leer (Abbildung 2) 2. </li><li> Für die Prüfung bei 17 ° C, stellen Sie die Boxen etwa 0,25 &#39;&#39; von den Tiergehegen auf beiden Seiten füllen und mit nassem Eis (Abbildung 2) 2. </li><li> Für die Prüfung bei 12 ° C, stellen Sie die Boxen etwa 1,25 &#39;&#39; von den Gehäusen zu beiden Seiten und füllen mit Trockeneis (Abbildung 2) 2. </li><li> Für die Prüfung bei 5 ° C, stellen Sie die Boxen etwa 0,25 &#39;&#39; von den Gehäusen zu beiden Seiten und füllen mit Trockeneis (Abbildung 2) 2.<ol><li> Beim Abkühlen des Glases mit Trockeneis, stellen Sie sicher, für eine ausreichende Belüftung, um CO 2 Aufbau im Raum zu verhindern. </li></ol></li></ol></li><li> Warten Sie, bis das Glas, um den gewünschten Temperaturbereich zu erreichen. </li><li> Fügen Sie die Maus, um die Gehäuse auf der Platte. ANMERKUNG: Eine Rauschgenerator verwendet werden, um Lärmbelästigungen zu verringern. </li><li> Warten Sie, bis die Mäuse zu akklimatisieren. HINWEIS: In unserer Einrichtung das dauert etwa 2,5 Stunden, aber das kann deutlich auf Basis von Tierhaltung und Umgangsbedingungen variieren. </li><li> Halten Sie das Glas auf dem gewünschten Temperaturbereich, indem sichergestellt wird, dass die Boxen voll von erwärmtem Wasser, nassem Eis oder Trockeneis gehalten. HINWEIS: Mit unserem Gerät müssen die Kisten mit Eis etwa jede 90 Minuten wieder aufgefüllt werden. HINWEIS: Für die 17 ° C Bedingung, ist es hilfreich, das meiste Wasser aus den Aluminium-Boxen durch die Ablauflöcher vor dem Nachfüllen mit Eis zu leeren. Dadurch wird die Temperatur besser, und pr stabilisierenVeranstaltungsüberlauf HINWEIS: Die genaue Höhe der Trockeneis wird saisonal variieren, aber in der Regel halten die Boxen mehr als ¼ voll über die gesamte Länge der Box wird die Temperatur konstant zu halten. </li></ol> 3. Prüfung der Mäuse bei Fest Temperaturen <ol><li> Außerhalb des Verhaltensraum, füllen einen Eiskübel etwa zur Hälfte mit Trockeneis. </li><li> Mit einem Hammer oder Gummihammer, quetschen Sie das Trockeneis zu einem feinen Pulver. HINWEIS: Durch Überladen des Eimer wird es schwierig, vollständig das Trockeneis zu Pulver zermalmen. </li><li> Mit einem geraden Rasierklinge oder einer Schere, schneiden Sie die Spitze einer 3-ml-Spritze. </li><li> Unter Verwendung einer 21 G Nadel, stoßen 3 Löcher auf gegenüberliegenden Seiten der Spritze (insgesamt 6 Löcher). HINWEIS: Diese Löcher werden den Druck durch Sublimation erzeugt verringern, während Zusammendrücken des Trockeneis. Der Cut-off-Spritze für mehrere Versuche wieder verwendet werden. </li><li> Nehmen Sie die Spritze, Trockeneis-Pulver und ein Hand Stoppuhr in die Verhaltensraum. </li><li> Füllen Sie die Spritze Kammer zur Hälfte mit Trockeneispulver. Halten Sie das Schnittende der Spritze vor einem flachen Gegenstand, und fest komprimieren das Pulver mit dem Kolben. Achtung; die Kunststoff-Kolben kann sich verbiegen oder brechen aus dem Druck. Wenn dies geschieht, ersetzen Sie den Kolben aus einer neuen Spritze. </li><li> Verlängern Sie die Spitze des Druck Trockeneis-Pellets über den Rand der Spritze. </li><li> Versuchsmäuse, die vollständig in Ruhe. <ol><li> Bei 30 ° C, 23 ° C und 17 ° C, Testmäuse, die alle 4 Pfoten auf dem Glas und nicht bewegen, aber nicht vollständig eingeschlafen 19. </li><li> Bei 12 ° C und 5 ° C, Testmäuse, die auf 2 oder 4 Pfoten Pfoten und nicht bewegen oder springen werden. </li></ol></li><li> Mit den Spiegel für Targeting, vorsichtig, aber fest drücken Sie die Flach Pellet bündig an der Glasoberfläche unter dem Maushinterpfote (1A) 2. Starten Sie den Handauslöser. </li><li> Stoppen Sie den Timer und nehmen Sie die Tablette, wenn die Maus bewegt sich weg von der gekühlten Glas. HINWEIS: Diese Rücklaufbewegung kann vertikal oder horizontal sein. <ol><li> Wenn die Maus bewegt sich nur kurz die Pfote und dann gibt es an der Kühlfläche, weiterhin Timing und anregend, bis die Maus macht eine dauerhafte Abkehr. Hinweis: Unser Labor verwendet eine maximale Anregung Zeit von 20 sec für Mäuse in der Mehrzahl der Fälle. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diesen Testverfahren bis mindestens 3 Werte auf jeder Pfote jedes Tieres gesammelt werden. Separate Studien testen gegen Pfoten auf der gleichen Maus um mindestens 7 min, und einen separaten aufeinanderfolgenden Studien auf eine einzelne Pfote um mindestens 15 min. </li><li> Falls erforderlich, mit verschiedenen Dicken von Glas an verschiedene Abkühlungsgeschwindigkeiten (Figur 3) 1 zu erzeugen. HINWEIS: Die Kühlrate ist umgekehrt proportional mit der Dicke des Glases korreliert. </li></ol> 4. Prüfung der Mäuse während der kalten Anpassung Hinweis: Dies ist ein alternatives Protokoll, das Testen als Glas plat erlaubtE abkühlt, anstatt einmal die Platte stabilisiert hat und die Mäuse wurden vollständig an die kalte Umgebung angepasst. <ol><li> Folgen Sie den in Abschnitt 1 Einrichten des Geräts aufgeführten Hinweise. </li><li> Folgen Sie den in Kapitel 3 werden auf Baseline-Messungen bei Raumtemperatur (7A) 2 nehmen Anweisungen. </li><li> Pre-Kühlung der Aluminiumboxen mit Trockeneis. </li><li> Sobald Ausgangsrückzugslatenzen gemessen wurden, positionieren Sie die vorgekühlte Boxen auf der Platte etwa 1,25 &#39;&#39; von den Gehäusen zu beiden Seiten (7A, Pfeil mit der Aufschrift &quot;Trockeneis hinzugefügt&quot;) 2. </li><li> Befolgen Sie die in Abschnitt 3, Maß zu nehmen, wie die Glasplatte abkühlt, die Messungen so oft wie möglich Anweisungen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Der CPA kann verwendet werden, um die Kälteempfindlichkeit und Kälteadaptation bei Mäusen zu beurteilen. Es bietet eine erschwingliche und effiziente Möglichkeit, Kältereaktionen bei unkontrollierten, akklimatisierten Tieren in einer Vielzahl von Temperaturbereichen zu messen. Es bietet auch eine eindeutige Verhaltensreaktion mit einer leicht zu quantifizierenden und zu analysierenden Ausgangsvariablen. Es wurde bereits verwendet, um Veränderungen der Kälteempfindlichkeit zu beurteilen, die durch Entzündungen1</...

Mess kalten Reaktionsfähigkeit bei Nagern ist wichtig für ein besseres Verständnis der möglichen Mechanismen der kalten Empfindlichkeit beim Menschen unter normalen und pathologischen Bedingungen. Der Kalte Plantar Assay (CPA), ursprünglich entwickelt, einige Jahre vor 1, wurde entwickelt, um reproduzierbare und eindeutig murine Verhaltensreaktionen auf einen Kältereiz bei RT ausgeliefert zu generieren. Neuere Verbesserungen dieses Tests wurden auf einem großen Temperaturbereich 2 die reproduzierbare Messung der kalten Empfindlichkeit erlaubt. Beide Varianten sind auch entworfen, um mit relativ hohem Durchsatz und kostengünstig zu handhaben sein. Ein Großteil der Fortschritte im Verständnis der Mechanismen der kalten Empfindlichkeit mit anderen Verhaltensmethoden vorgenommen. Eine Methode ist die Acetonverdampfungstest, der Tupfen beinhaltet oder Sprühen Aceton auf der Maus Pfote und Messung der Menge an Zeit, die der Maus verbringt schnippte die Pfote 3,4. Leiderdie Antworten auf die Acetonverdampfung werden durch den nassen Gefühl und den Geruch des Aceton verwechselt. Auch kann die Kältereiz, die in der Acetonverdampfungstest angewendet wird auf die Menge an Aceton aufgetragen variieren, und ist schwierig zu quantifizieren. Schließlich müssen unverletzten Mäusen minimal antwortet Aceton als Ausgangswert, so dass es unmöglich ist, Analgesie in Abwesenheit von Überempfindlichkeit bei dieser Methode zu messen. Eine weitere klassische Test für Kälte Reaktionen ist die Tail-Flick-Test, in dem die Latenz zum Rücktritt wird gemessen, nachdem der Schwanz ist in kaltem Wasser 5,6 eingetaucht. Während die Verhaltensreaktionen in diesem Test eindeutig sind, und der Assay misst Antworten auf eine bestimmte Temperatur, müssen die Tiere während der Prüfung zurückgehalten werden, die kalte Reaktionsfähigkeit durch gut beschriebene spannungsinduzierte analgetische Mechanismen 7 verändern kann. Ein weiteres häufig verwendetes Werkzeug ist die kalte Platte Test, der die VerhaltensmaßeReaktionen von Mäusen, nachdem sie auf einem Peltier-Kühlplatte 8-10 platziert werden. Während dieses Tool liefert Informationen über Tier Reaktionen bei bestimmten Temperaturen, wurde auch uneinheitlich verwendet; verschiedenen Gruppen haben verschiedene Arten von Reaktionen einschließlich Anzahl der Sprünge 8,11, die Latenz bis zum ersten Ansprechen 8,11- 13 gemessen wird, und die Anzahl der Pfote hebt 11,13,14 mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Die Kaltplattentest ist auch relativ geringen Durchsatz, da nur ein Tier zu einem Zeitpunkt getestet werden, und es ist eine teure und zerbrechliche Peltier-Vorrichtung erfordert. Das 2-Plattentemperatur Präferenztest ist eine häufig verwendete Derivat der Kaltplattentest, das die relative Zeitdauer, die Tiere ausgeben 2 verbundenen Platten mit unterschiedlichen Temperaturen 9,15- 17 misst. Ein weiteres ähnliches häufig verwendete Test ist der Wärmegradient Assay, in dem die Zeitdauer, die Mäuse zu verbringen in unterschiedlichen Temperaturzonenim Bereich zwischen 5 ° C und 45 ° C auf einer langen Metallplatte gemessen 16. Obwohl diese Assays erlauben den Vergleich von Temperaturen, ist es unklar, ob das Verhalten darstellt Temperatur Abneigung oder Temperatur bevorzugt. Schließlich ist die dynamische Kaltplattenassay wurde verwendet, um zu messen, wie Mäusen, auf sich ändernde Umgebungstemperatur 18 reagieren. Diese Methode geht darum, Mäuse auf einem RT Peltier-Vorrichtung und Rampen es bis zu 1 ° C während der Messung, wie viel die Mäuse springen oder lecken ihre Pfoten auf verschiedenen Plattentemperaturen. Während dieses Tests, wie Mäusen Anpassung an eine Kühlumgebung, es keine Möglichkeit zu testen, wie Mäusen, die Kältereiz zu reagieren in der Einstellung eines kühleren Umgebungstemperatur. Zusätzlich erfordert es eine teure Ausrüstung durchzuführen und bietet keine Möglichkeit, Mäuse zu Prüfeinrichtungen vor der Messung ihrer kalten Empfindlichkeit akklimatisieren. Um diese Tests zu ergänzen, überprüft der CPA die ACCLIMAted Antworten auf eine gut definierte Kältereiz bei einer Vielzahl von Temperaturbereichen, oder während des Prozesses der Anpassung an kalten Umgebungstemperaturen. Es kann bis zu 14 Mäuse in einer Zeit mit unseren aktuellen Gerät zu testen, mit dem Potenzial, für High-Throughput-Tests kostengünstig skaliert werden.

<table><tbody><tr><td>Thermoelementsonde vom Typ T</td><td>Physitemp</td><td>IT-24p</td><td>Wird verwendet, um die Oberflächentemperatur des Glases zu messen (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)</td></tr><tr><td>Glasplatte</td><td>Lokale Glasfirma (in St. Louis, Stemmerich Inc)</td><td></td><td>Wir verwenden Pyrexglas (Borosilikatfloat). Unser Labor verwendet in der Regel 1/4'', aber auch 3/16'' und 1/8'' sind nützlich</td></tr><tr><td>Thermischer Datenlogger</td><td>Extech</td><td>EA15</td><td>Thermologger zur Verfolgung der Glastemperatur (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)</td></tr><tr><td>3 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Die Oberseite wird abgeschnitten und Trockeneis wird in der Spritze komprimiert, um eine kalte Sonde zu erzeugen</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Wenn Sie einen Extech-Logger verwenden, funktioniert jeder Pc. Aluminiumboxen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> der <td>Washington University in St. Louis</td><td></td><td>sind 3 Zoll lang, 4,5 Zoll breit und 3 Zoll hoch mit einem versiegelten Deckel. In einer kurzen Seite jeder Box befindet sich ein 1/2-Zoll-Loch, das in der Nähe des Bodens gebohrt ist. Diese Löcher werden mit Gummihahnen gefüllt, wenn die Boxen mit nassem Eis oder heißem Wasser gefüllt werden.</td></tr><tr><td>Beheizter Wasserzirkulator</td><td>VWR</td><td></td><td>Jedes Wasserzirkulatormodell mit Pumpe funktioniert</td></tr><tr><td>21 G Nadel</td><td>BD</td><td>305165</td><td>Die genaue Nadelstärke ist nicht wichtig</td></tr><tr><td>Handtimer Jeder Handtimer</td><td></td><td></td><td>funktioniert</td></tr><tr><td>Spiegel</td><td></td><td></td><td>Jeder flache Spiegel funktioniert</td></tr></tbody></table>

eine einfache und kostengünstige methode zur bestimmung der Überempfindlichkeit auf kälte und anpassung an der maus

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Kälteüberempfindlichkeit ist ein ernstes klinisches Problem, das eine breite Untergruppe von Patienten betrifft und zu einer signifikanten Verschlechterung der Lebensqualität führt. Der kalte Plantar-Assay ermöglicht die objektive und kostengünstige Beurteilung der Kälteempfindlichkeit bei Mäusen und kann sowohl Analgesie als auch Überempfindlichkeit quantifizieren. Die Mäuse werden auf einer Glasplatte akklimatisiert und ein komprimiertes Trockeneispellet gegen die Glasoberfläche unter der Hinterpfote gehalten. Die Latenz bis zur Entnahme aus dem Kühlglas wird als Maß für die Kälteempfindlichkeit verwendet.
Kälteempfinden ist auch wichtig für das Überleben in Regionen mit saisonalen Temperaturschwankungen, und um die Empfindlichkeit aufrechtzuerhalten, müssen die Tiere in der Lage sein, ihre thermischen Reaktionsschwellen an die Umgebungstemperatur anzupassen. Der Cold Plantar Assay (CPA) ermöglicht auch die Untersuchung der Anpassung an Änderungen der Umgebungstemperatur, indem die Kälteempfindlichkeit von Mäusen bei Temperaturen von 30 °C bis 5 °C getestet wird. Mäuse werden wie oben beschrieben akklimatisiert, aber die Glasplatte wird mit Aluminiumboxen (oder Aluminiumfolienpaketen), die mit heißem Wasser, Nasseis oder Trockeneis gefüllt sind, auf die gewünschte Ausgangstemperatur abgekühlt. Die Temperatur der Platte wird in der Mitte mit einer Filament-Thermoelementsonde vom Typ T gemessen. Sobald die Platte die gewünschte Starttemperatur erreicht hat, werden die Tiere wie oben beschrieben getestet.
Dieser Assay ermöglicht das Testen von Mäusen bei Temperaturen von harmlos bis schädlich. Der CPA führt zu eindeutigen und konsistenten Verhaltensreaktionen bei unverletzten Mäusen und kann zur Quantifizierung von Überempfindlichkeit und Analgesie verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie der CPA zur Messung von Kälteüberempfindlichkeit, Analgesie und Anpassung bei Mäusen verwendet wird.

Die Verhaltens-Antworten von Mäusen ausgelöst beginnend bei 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C und 12 ° C sind in hohem Maße reproduzierbar (4A) 20. Um die Kältereiz unter der Hinterpfote erzeugt messen, wurden Mäuse mit einer Ketamin / Xylazin / Acepromazin anästhesiert Cocktail und die Pfoten wurden auf dem Glas auf einem T-Typ-Thermoelement Filament (4B) 20 befestigt. Das Glas gekühlt, erwärmt, um die gewünschte Testbereich wurde. Obwohl die Platte gleichmäßig entlang der L...

Der kalte Plantar-Assay (CPA) misst die Kältereaktion zwischen 30 °C und 5 °C und kann auch die Kälteanpassung messen. Dieses Protokoll beschreibt, wie der CPA zur Messung von Kälteüberempfindlichkeit, Analgesie und Anpassung bei Mäusen verwendet wird.

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kälteempfindlichkeit von Mäusen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Glas auf die gewünschte Temperatur abgekühlt oder erwärmt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Mäuse zu akklimatisieren, bis sie in Ruhe sind.Der dritte Schritt besteht darin, Trockeneispulver in einer Spritze zu einem Pellet zu pressen. Der letzte Schritt ist, die Mäuse mithilfe des Trockeneispellets und einer Stoppuhr zu testen, um die Withdrawal-Latenz zu messen. Letztendlich dient der Cold-Plate-Test dazu, die Kälteempfindlichkeit und -anpassung bei frei beweglichen Mäusen zu messen.Der Hauptvorteil unseres Assays gegenüber derzeit verfügbaren Tests wie dem Aceton-Test und dem Kaltplatten-Test besteht darin, dass wir sowohl die Hyperempfindlichkeit als auch die Analgesie im Grundzustand unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen testen können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Kälteempfindlichkeit der Mäuse ermöglicht, kann sie auch in anderen Systemen wie dem Affen, der Ratte und beim Menschen angewendet werden. Die Demonstration des Verfahrens wird Daniel Brenner, ein Doktorand in meinem Labor, durchführen.Nach der Reinigung der Glasoberfläche befestigen Sie die T-förmige Faden-Thermoelementsonde mit Laborband in der Mitte der Glasplatte. Stellen Sie die Tiergehege in einer einzigen Reihe entlang der Mitte der Glasplatte auf. Führen Sie dann die Thermoelementsonde durch das zentrale Tiergehege und stecken Sie sie in den Datenlogger ein.Schalten Sie den Datenlogger ein und deaktivieren Sie die automatische Abschaltfunktion. Verbinden Sie den Datenlogger mit dem Computer über das beigefügte Kabel. Trennen Sie die Tiergehege mit schwarzen Einschüben, um visuelle Interaktionen zwischen den Mäusen zu verhindern, und platzieren Sie Spiegel unter dem Glas, um die Sicht auf die Unterseite der Gehege zu ermöglichen.Um mit den Tests zu beginnen, stellen Sie Aluminiumboxen auf die Glasplatte auf beiden Seiten des Tieres, wobei die Boxen in einem festen Abstand angeordnet sind. Wenn bei 30 Grad Celsius getestet wird, schließen Sie beheizte Wasserkreisläufe an die Aluminiumboxen an, die 0,25 Zoll vom Tiergehege entfernt platziert sind. Füllen Sie die Boxen mit Wasser bis zur Hälfte, während die Abflusslöcher verstopft sind.Platzieren Sie die Umlaufthermostaten so, dass das heiße Wasser aus den Aluminiumboxen direkt zurück in den Vorratsbehälter des Thermostaten auf jeder Seite abfließt. Sie müssen jedem Thermostaten Wasser hinzufügen. Sobald die Metallboxen gefüllt sind, stellen Sie die Thermostaten auf 45 bis 60 Grad Celsius ein und füllen Sie die Aluminiumboxen mit einem gleichmäßigen Strom heißen Wassers.Wenn die Platte den gewünschten Temperaturbereich erreicht hat, stellen Sie die Mäuse in die Käfige auf der Platte. Lassen Sie die Mäuse sich an die Apparatur und die Temperatur gewöhnen. Diese Mäuse werden sich 2,5 Stunden lang akklimatisieren.Wenn die Akklimatisierungsphase dem Ende zugeht, füllen Sie einen Eisbehälter etwa zur Hälfte mit Trockeneis und zerkleinern Sie das Trockeneis mithilfe eines Hammers oder einer Holzkeule zu Pulver. Führen Sie diesen Schritt außerhalb des Verhaltensraums durch, um die Mäuse nicht zu stören. Schneiden Sie anschließend mit einer Rasierklinge oder einer Schere die Oberseite einer Dreimilliliterspritze ab.Verwenden Sie dann eine 21-Gauge-Nadel, um zwei Sätze mit jeweils drei Löchern auf gegenüberliegenden Seiten der Spritze anzubringen, um den durch die Sublimation entstehenden Druck zu verringern, während das Trockeneis im Verhaltensraum zusammengedrückt wird. Füllen Sie die Spritzenkammer zur Hälfte mit Trockeneispulver. Halten Sie das abgeschnittene Ende der Spritze gegen einen flachen Gegenstand und verdichten Sie das Pulver fest mit dem Kolben. Führen Sie die Spitze der verdichteten Trockeneisportion über die Kante der Spritze hinaus.Testen Sie nun jene Mäuse, die alle vier Pfoten im Glas haben und sich nicht bewegen, aber nicht vollständig eingeschlafen sind. Zielen Sie mit Hilfe der Spiegel und drücken Sie den flachen Pellet vorsichtig, aber fest, bündig gegen die Glasoberfläche unter der Hinterpfote der Maus. Gleichzeitig starten Sie eine Stoppuhr.Wenn sich die Maus vertikal oder horizontal von dem gekühlten Glas entfernt, stoppen Sie die Stoppuhr und entfernen Sie das Trockeneis-Präparat. Wenn die Maus jedoch kurz die Pfote bewegt und diese anschließend wieder auf die Kühlfläche zurücklegt, setzen Sie die Zeitnahme und Stimulation fort, bis die Maus sich dauerhaft entfernt. Falls die Maus sich nicht vom gekühlten Glas wegbewegt, beenden Sie die Stimulation nach 20 Sekunden.Wiederholen Sie dieses Testverfahren, bis mindestens drei Werte an jeder Pfote des Tieres erhoben wurden, um Mäuse bei 17 Grad Celsius zu testen. Wiederholen Sie das Experiment wie gerade gezeigt, verwenden Sie jedoch statt erwärmten Wassers nasses Eis und platzieren Sie die Aluminiumboxen etwa 0,25 Zoll von den Behausungen entfernt, um die Mäuse zu testen. Bei 12 Grad Celsius wird Trockeneis verwendet, die Boxen werden jedoch 1,25 Zoll von den Behausungen entfernt platziert.Dieses alternative Protokoll testet die Mäuse, während die Temperatur der Platte sinkt, anstatt nachdem sie stabilisiert wurde. Dies ermöglicht es uns, die Anpassung der Mäuse während ihres Ablaufs zu testen. Nach dem Aufbau der Apparatur führen Sie das Experiment wie zuvor beschrieben durch, um Messungen bei Raumtemperatur vorzunehmen.Nachdem die Basislatenzen bei Raumtemperatur gemessen wurden, die leeren Aluminiumboxen mit Trockeneis füllen und sie gemäß dem zuvor gezeigten Verfahren 1,25 Zoll von den Gehäusen auf beiden Seiten entfernt platzieren. Schließlich das Experiment wiederholen, um Latenzmessungen vorzunehmen, während die Glasplatte abkühlt.So oft wie möglich Messungen durchführen. Dieses Diagramm zeigt die durchschnittliche Withdrawal-Latenz von Mäusen, beginnend bei 12 Grad Celsius, 17 Grad Celsius, 23 Grad Celsius oder 30 Grad Celsius. Die Withdrawal-Latenzen sind über alle Temperaturen hinweg konsistent.Analgetische Wirkungen können mithilfe des Cold-Planter-Assays wie hier gezeigt gemessen werden. Die subkutane Injektion von 1,5 Milligramm pro Kilogramm Morphin erhöht die Withdrawal-Latenz von Mäusen 30 Minuten nach der Injektion, gemessen mittels einer zweifaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test 60 Minuten nach der Injektion. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen morphin- und salzinjizierten Tieren.Die Überempfindlichkeit von Mäusen kann hier ebenfalls gemessen werden. Die intraplantare Injektion von 10 Mikrolitern komplettem Freund-Adjuvans vermindert die Withdrawal-Latenz von Mäusen signifikant zwei und drei Stunden nach der Injektion, wie mittels einer zweifaktoriellen ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test festgestellt wurde. Dieselben Mäuse erhielten vier Stunden später subkutane Injektionen von Morphin, und alle Withdrawal-Latencen um 4,5 Stunden waren signifikant höher im Vergleich zu drei Stunden, gemessen mittels einer einfaktoriellen ANOVA mit Dunnett's Post-hoc-Test.Nachdem das Morphin nach 5,5 Stunden metabolisiert war, wiesen Mäuse, die mit CFA injiziert worden waren, im Vergleich zu mit Kochsalzlösung injizierten Mäusen weiterhin kürzere Entzugs-Latenzzeiten auf, gemessen mittels einer zweifaktoriellen ANOVA mit Bonferroni post-hoc Test. Die Anpassung an abkühlende Umweltveränderungen kann mit diesem Assay in Echtzeit gemessen werden. Wildtyp-Mäuse weisen dieselbe Entzugs-Latenzzeit auf, während die Glasplatte abkühlt, was darauf hindeutet, dass sie sich schneller an abnehmende Temperaturen anpassen, als mit dem CPA messbar ist, bei dem keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt wurden.Jedoch wenn die Mäuse mit U 7 3 1 2 2 injiziert wurden, um die PIP-Zwei-Hydrolyse zu blockieren, nimmt ihre Latenz ab, während die Platte mit sinkender Temperatur abkühlt, was auf eine beeinträchtigte Anpassung hindeutet. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden, einschließlich der Akklimatisierungszeit. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kälteempfinden und Anpassung bei wachen, frei beweglichen Mäusen messen kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Trockeneis außerordentlich gefährlich sein kann und dass Sie für ausreichende Belüftung und Luftzirkulation während dieser Methode sorgen müssen.

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Research

Forschung

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