Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kälteempfindlichkeit von Mäusen zu messen. Dies wird erreicht, indem das Glas zunächst auf die gewünschte Temperatur abgekühlt oder erhitzt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Mäuse zu akklimatisieren, bis sie zur Ruhe kommen.

Der dritte Schritt besteht darin, Trockeneispulver in einer Spritze zu einem Pellet zu komprimieren. Der letzte Schritt besteht darin, die Mäuse mit dem Trockeneispellet und einer Stoppuhr zu testen, um die Entnahmelatenz zu messen. Letztendlich wird der Kaltpflanzer-Assay verwendet, um die Kältereaktion und -anpassung bei sich frei verhaltenden Mäusen zu messen.

Der Hauptvorteil unseres Assays gegenüber derzeit bestehenden Assays wie dem Aceton-Test und dem Cold-Plate-Test besteht darin, dass wir sowohl die Überempfindlichkeit als auch die Analgesie zu Studienbeginn unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen testen können. Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die Kälteempfindlichkeit der Mäuse geben. Es kann auch in anderen Systemen wie dem Affen, der Ratte und den Menschen verwendet werden. Das Verfahren wird von Daniel Brenner, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert.

Befestigen Sie nach dem Reinigen der Glasoberfläche die Filament-Thermoelementsonde vom Typ T mit Laborband an der Oberfläche in der Mitte der Glasplatte. Platzieren Sie die Tiergehege in einer einzigen Linie in der Mitte auf der Glasplatte. Fädeln Sie dann die Thermoelementsonde durch das zentrale Tiergehäuse und stecken Sie sie in den Datenlogger.

Schalten Sie den Datenlogger ein und deaktivieren Sie die automatische Abschaltfunktion. Schließen Sie den Datenlogger mit dem mitgelieferten Kabel an den Computer an. Trennen Sie die Tiergehege mit schwarzen Einsätzen, um visuelle Wechselwirkungen zwischen den Mäusen zu verhindern, und positionieren Sie Spiegel unter dem Glas, um den Blick auf die Unterseite der Gehege zu ermöglichen.

Um mit dem Testen zu beginnen, stellen Sie Aluminiumboxen auf die Glasplatte zu beiden Seiten des Tieres, Gehege in einem festen Abstand. Wenn Sie bei 30 Grad Celsius testen, schließen Sie beheizte Wasserumwälzpumpen an die Aluminiumboxen an, die 0,25 Zoll vom Tiergehege entfernt aufgestellt sind. Füllen Sie die Boxen zur Hälfte mit Wasser, während die Abflusslöcher verstopft sind.

Positionieren Sie die Umwälzpumpen so, dass das heiße Wasser aus den Aluminiumkästen auf jeder Seite direkt in den Vorratsbehälter der Umwälzpumpe zurückfließt. Sie müssen jedem Zirkulator Wasser hinzufügen. Sobald die Metallboxen befüllt sind, stellen Sie die Umwälzpumpen auf 45 bis 60 Grad Celsius ein und füllen Sie die Aluminiumboxen mit einem stetigen Strom von heißem Wasser.

Wenn die Gläser den gewünschten Temperaturbereich erreicht haben, legen Sie die Mäuse in die Gehäuse auf der Platte. Lassen Sie die Mäuse sich an das Gerät und die Temperatur gewöhnen. Diese Mäuse akklimatisieren sich 2,5 Stunden lang.

Wenn Sie sich dem Ende der Eingewöhnungsphase nähern, füllen Sie einen Eiskübel etwa zur Hälfte mit Trockeneis und zerkleinern Sie das Trockeneis mit einem Hammer oder Hammer zu Pulver. Tun Sie dies außerhalb des Verhaltensraums, um die Mäuse nicht zu stören. Schneiden Sie als Nächstes mit einer Rasierklinge oder einer Schere den oberen Teil einer Drei-Milliliter-Spritze ab.

Verwenden Sie dann eine 21-Gauge-Nadel, um zwei Sätze mit drei Löchern auf gegenüberliegenden Seiten der Spritze zu stechen, um den durch die Sublimation erzeugten Druck zu verringern, während das Trockeneis zurück in den Verhaltensraum gepresst wird, und füllen Sie die Spritzenkammer zur Hälfte mit Trockeneispulver. Halten Sie das abgeschnittene Ende der Spritze gegen einen flachen Gegenstand und drücken Sie das Pulver mit dem Kolben fest zusammen. Verlängern Sie die Spitze der komprimierten Trockeneispalette über den Rand der Spritze hinaus.

Testen Sie nun jene Mäuse, die alle vier Pfoten im Glas haben und sich nicht bewegen, aber nicht vollständig schlafen. Mit den Spiegeln zum Zielen drücken Sie das flache Kügelchen sanft, aber fest bündig gegen die Glasoberfläche unter der Hinterpfote der Maus. Drücken Sie gleichzeitig Start auf einem Timer.

Wenn sich die Maus vertikal oder horizontal vom abgekühlten Glas entfernt, stoppen Sie den Timer und entfernen Sie das Trockeneispellet. Wenn die Maus die Pfote jedoch nur sehr kurz bewegt und sie dann wieder auf die Kühlfläche zurückbringt, fahren Sie mit dem Timing und der Stimulation fort, bis sich die Maus dauerhaft entfernt. Wenn sich die Maus nicht vom abgekühlten Glas entfernt, stoppen Sie den Reiz nach 20 Sekunden.

Wiederholen Sie diesen Testvorgang, bis mindestens drei Werte an jeder Pfote des Tieres gesammelt wurden, um Mäuse bei 17 Grad Celsius zu testen. Wiederholen Sie das Experiment wie gerade gezeigt, aber anstatt die Aluminiumboxen mit erhitztem Wasser zu füllen, verwenden Sie nasses Eis und positionieren Sie die Boxen etwa 0,25 Zoll von den Gehegen entfernt, um Mäuse zu testen. Bei 12 Grad Celsius wird Trockeneis verwendet, aber die Boxen werden 1,25 Zoll von den Gehäusen entfernt platziert.

Dieses alternative Protokoll testet die Mäuse, wenn die Temperatur der Platte sinkt, und nicht, nachdem sie stabilisiert wurde. Dies ermöglicht es uns, die Anpassung der Mäuse zu testen, während sie nach dem Aufbau des Geräts geschieht. Führen Sie das Experiment wie zuvor beschrieben durch, um Messungen bei Raumtemperatur durchzuführen.

Einmal wurden die Latenzen bei Raumtemperatur gemessen. Füllen Sie die leeren Aluminiumboxen mit dem zuvor gezeigten Verfahren mit Trockeneis und platzieren Sie sie auf beiden Seiten 1,25 Zoll von den Gehäusen entfernt. Wiederholen Sie abschließend das Experiment, um Latenzmessungen durchzuführen, während die Glasplatte abkühlt.

So oft wie möglich Messungen durchführen. Dieses Diagramm zeigt die durchschnittliche Entzugslatenz für Mäuse ab 12 Grad Celsius, 17 Grad Celsius, 23 Grad Celsius oder 30 Grad Celsius. Die Entnahmelatenzen sind über alle Temperaturen hinweg konstant.

Die analgetische Wirkung kann mit dem Kaltpflanzer-Assay gemessen werden, wie hier gezeigt. Die subkutane Injektion von 1,5 Milligramm pro Kilogramm Morphin erhöht die Entzugslatenz von Mäusen 30 Minuten nach der Injektion, gemessen durch einen Zwei-Wege-Innova-Post-hoc-Test mit Bonferroni 60 Minuten nach der Injektion. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen injiziertem Morphin und injizierter Kochsalzlösung.

Auch eine Überempfindlichkeit von Mäusen kann hier gemessen werden. Die Intra-Planter-Injektion von 10 Mikrolitern des vollständigen fros-Adjuvans verringert die Entzugslatenz von Mäusen zwei und drei Stunden nach der Injektion signifikant, gemessen durch einen Zwei-Wege-Innova-with-Bonferroni-Post-hoc-Test. Dieselben Mäuse erhielten nach vier Stunden subkutane Injektionen von Morphin, und alle Entzugslatenzen nach 4,5 Stunden waren signifikant höher als nach drei Stunden, gemessen mit einer Einweg-Innova, die nach dem Post-hoc-Test durchgeführt wurde.

Nachdem das Morphin 5,5 Stunden nach der Injektion metabolisiert wurde, wiesen Mäuse, denen CFA injiziert wurde, immer noch niedrigere Entzugslatenzen auf als Mäuse, die mit Kochsalzlösung injiziert wurden, gemessen durch einen Zwei-Wege-Inova-with-Bonferroni-Post-hoc-Test. Die Anpassung an kühlende Umweltveränderungen kann mit diesem Assay in Echtzeit gemessen werden. Wildtyp-Mäuse haben die gleiche Entzugslatenz, wenn die Glasplatte abkühlt, was darauf hindeutet, dass sie sich schneller an die Abkühltemperaturen anpassen, als dies mit dem CPA gemessen werden kann, der keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen aufwies.

Wenn den Mäusen jedoch U 7 3 1 2 2 injiziert wurde, um die PIP 2-Hydrolyse zu blockieren, nimmt ihre Latenzzeit ab, wenn die Platte der Temperatur abnimmt, was auf eine beeinträchtigte Anpassung hindeutet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden einschließlich Akklimatisierungszeit durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Kälteempfinden und die Anpassung bei wachen, sich frei verhaltenden Mäusen messen kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Trockeneis außergewöhnlich gefährlich sein kann und dass Sie bei dieser Methode auf eine ausreichende Belüftung und Luftfreiheit achten müssen.