Name: Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Erfahren Sie eine standardisierte Methode zur Analyse von Lebersinus-Endothelzellen und deren Fenestrationen mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Messungen von Durchmesser, Dichte und Porosität.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

HINWEIS: Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren werden entsprechend der lokalen Gesetzgebung erfolgen. Unsere Arbeit wird von der Sydney Lokale Gesundheit Bezirk Animal Welfare Committee genehmigt. Die zulässigen Verfahren werden in dem Projekt-Lizenz Dokumentation beschrieben und folgen Richtlinien, die das Wohlbefinden des Tieres jederzeit zu gewährleisten. Achten Sie darauf, die Einhaltung der Rechtsvorschriften über Tierversuche des Landes, in dem die Arbeit ausgeführt wird. 1. Protokoll zur Herstellung von EM Fixative <ol><li> Für 100 ml Fixiermittel, bereiten Para durch Zugabe von 2 g Paraformaldehyd Pulver zu 25 ml destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben, Hitze bis 65 ° C unter ständigem Rühren mit einem Magnetrührer. HINWEIS: Glutaraldehyd, Para und Natriumcacodylatpuffer sind alle gefährlichen Substanzen und müssen immer in Abzug, behandelt werden. </li><li> Wärme bei 65 ° C für 2 Minuten, dann abkühlen lassen. Falls erforderlich, fügen Sie Natronlauge dropwise unter Rühren zu Lösung vollständig zu löschen. HINWEIS: Natriumhydroxid ist gefährlich, mit Vorsicht handhaben. </li><li> 10 ml EM Sonderschaft Glutaraldehyd, 50 ml von 0,2 M Natriumcacodylatpuffer und 2 g Saccharose und rühren mit Magnetrührer. 2 ml von 1,0 M CaCl 2. </li><li> Auf pH 7,4 vor der Herstellung Lösung auf 100 ml mit destilliertem Wasser. Die endgültige Fixiermittel enthält 2,5% Glutaraldehyd, 2% Paraformaldehyd, 2 mmol CaCl 2, 2% Saccharose in 0,1 M Cacodylatpuffer. Stellen Sie sicher, dass die Gesamt Osmolalität 440 mOsmol / L. Verwenden Sie innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung. </li></ol> 2. Perfusionsfixierung der Leber <ol><li> Warm Perfusionspuffer und Fixiermittel zu 35 bis 37 ºC. Die richtige Temperatur des Puffer Ausbluten und Fixiermittel hilft Gewebeintegrität zu gewährleisten. </li><li> Betäuben des Tieres mit einer einzelnen intraperitonealen Injektion von 50 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin. </li><li> Sobald das Tier untertiefe Narkose, von der hinteren Gliedmaßen und Schwanz Rückzug Prise beurteilt wird ein Y Schnitt mit stumpfen Enden Schere im Tierleib, die Leber und Pfortader freizulegen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Ausrüstung sauber, um eine Kontamination von Proben mit Mikroorganismen und allgemeinen Schmutz, die sich leicht auf SEM zu sehen sein wird zu vermeiden. </li><li> Binden zwei sehr lose Fäden um die Pfortader einer proximal der Leber, der andere weiter distal in die Leber. </li><li> Kanülieren die Pfortader mit einer entsprechend dimensionierten IV Kanüle (18 G für Ratten, 22 G für Mäuse) .Tighten Nähte Kanüle zu sichern. </li><li> Beginnen Perfusion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf 37 ºC und bei einem Druck von 10 cm H 2 0. Zwischen 5 und 20 ml PBS ist in der Regel erforderlich, um die Leber exsanguinate. HINWEIS: Nicht, damit Luftblasen, um die Leber durch die an der Kanüle, wie sie veran Artefakte sekundär zu Embolisation und Druck verbunden Rohre geben; Schäden an den Hepatozyten sinusoids und LSEC fenestrations tritt auf, wenn die Perfusion Druck zu hoch ist. </li><li> Trennen die Bauch- und Brust Hohlvene, damit der Puffer frei von der Leber zu verlassen. Dies verhindert, dass hohe Gegendruck Schäden an LSECs. </li><li> Sobald die Leber ist frei von Blut, ersetzen PBS mit EM Fixiermittel und perfundieren ca. 5 Minuten, bis die Leber ist gehärtet und sehr blass. </li><li> Unterbrechen Sie die Perfusion und schneiden Sie die feste Leber in 1-2 mm 3 Blocks mit einem scharfen Skalpell. </li><li> Post-fix Gewebe in EM Fixiermittel für 24-72 h bei 4 ºC. HINWEIS: In der Regel verursacht underfixation mehr Artefakte als overfixation. </li><li> Ändern Sie folgende Fixierungs post-fix Zeitraum auf 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für Lagerung bei 4 ºC. HINWEIS: Proben auf diese Weise gespeichert werden für einen längeren Zeitraum (bis zu 12 Monate), aber rechtzeitige sekundäre Fixierung erhalten bleiben und Prüfung für die besten Ergebnisse empfohlen. </li></ol> 3. Nadel Perfusion HINWEIS: Needle Fixierung ist eine Variante der Perfusionsfixierung die Injektion direkt in Fixativ biopsiert Lebergewebe handelt. Ziel ist es, für Fixiermittel, um durch die Blutgefäße, um sie exsanguinate und setzen alle der Gewebeblock zu Fixativ gespült werden. Ist darauf zu achten, um den Einspritzdruck niedrig, um den Druck zu vermeiden Verletzungen 18,19 zu halten. <ol><li> Nehmen Sie ein kleines Stück Leber aus dem Tier oder Gegenstand und spülen in Kochsalzlösung, Blut und Schmutz zu entfernen. </li><li> Zeichnen Sie die physiologische Kochsalzlösung in die Spritze mit einer feinen Nadel (typischerweise eine Insulinspritze) ausgestattet. </li><li> Spritzen Sie die Kochsalzlösung sehr langsam in die Leber, bis Blut aus dem Gewebe gespült. Mehrfachinjektionen erforderlich. </li><li> Zeichnen Sie die EM Fixiermittel in eine andere Spritze mit einer feinen Nadel (typischerweise eine Insulinspritze) ausgestattet. </li><li> Spritzen Sie die Fixiermittel sehr langsam in die Leber, bis es hart und tan in Farbe wird. Mehrfacheinspritzungs erforderlich sein. </li><li> Schneiden Sie die festen Leber in 1-2 mm 3 Blocks mit einem scharfen Skalpell. Inkubieren EM Fixativ für 24 bis 72 h 4 ° C. Vor Beginn der Sekundärfixation 3 mal in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer waschen. </li></ol> 4. Vorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Waschprobe 3 mal in 0,1 M Natriumkakodylat-Puffer. Um Lipide zu beheben, senden Sie fixieren die Probe in 2% Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 2 Stunden. HINWEIS: Gründliches Waschen ist sehr wichtig, wie Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid Quer reagieren und Artefakte auf SEM. </li><li> Spülen der Proben in zunehmenden Konzentrationen von Ethanol zur Dehydratisierung begonnen. Erste Spülung in 50% Ethanol für 5 Minuten; dann 3-mal für 5 min mit 70% Ethanol; Spülen 3 mal für 5 min mit 90% Ethanol; Spülen 2 mal für 5 Minuten in 100% Ethanol; und schließlich 2 mal Spülen für 10 Minuten in 100% Ethanol (Molekularsieb). </li><li> Entfernen Sie das gesamte Ethanol aus den Proben<html> und ersetzen Sie mit Hexamethyldisilazan (HMDS) in Abzug, und lassen für 10 Minuten. HMDS Entfernen von Gewebeproben und verdampfen lassen. HINWEIS: HMDS ist stark hygroskopisch, wenn kalt daher erlauben, RT, bevor Sie zur abschließenden Entwässerungsschritt zu erreichen. </li><li> Optional montieren Sie die Proben sofort oder legen Sie sie in einem Exsikkator, bis bereit, für SEM montieren. </li></ol> 5. Montage Hinweis: Die korrekte Probenmontage wird die Anzahl der klar abgegrenzten Sinuskurven für die Analyse unter SEM zur Verfügung zu maximieren. <ol><li> Beschriften Sie die Basis der Metall SEM Stubs und gelten doppelseitigen leitfähigen Kohlenstoff-Band an der Spitze der Stichleitungen. </li><li> Visualisieren Proben unter Verwendung eines Binokular, die Oberfläche mit den besten Sinusoide zur nachfolgenden SEM identifizieren. Ort, der Oberfläche nach oben auf dem Kohlenstoffbandoberfläche der Stichleitung. </li><li> Stick Exemplare fest mit dem Stummel, sind nun bereit für die Proben Sputterbeschichtung. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Coating HINWEIS: Die Beschichtung der Probe mit einem feinen Film aus leitfähigem Metall (Gold oder Platin) in ein Zerstäubungsbeschichter Gründen der Probe und schützt sie vor Schäden durch den Elektronenstrahl. Wenn die Beschichtung zu dick Strukturen von Interesse können verdeckt werden. <ol><li> Platz Stummel in die Vakuumkammer der automatischen Fein Zerstäubungsbeschichter, Set-Modus, um die Drehung und automatische Sputterbeschichtung für 45 sec. Verwenden Platinbeschichtung für feinere Details, aber Gold ist ebenfalls geeignet. </li><li> Eine dünne Schicht aus Kohlenstofffarbe auf die Außenflächen der Leberproben angebracht, dabei nicht zur Beschichtung der sinusförmigen Oberflächen. </li><li> Sobald die Proben mit Platin beschichtet und Kohlenstoff Farbe getrocknet sind sie bereit für die Beobachtung auf der SEM. Proben können in einem Exsikkator gelagert werden. </li></ol> 7. Mit dem Rasterelektronenmikroskop <ol><li> Platz Exemplaren in Rasterelektronenmikroskop und Rück Mikroskop Vakuum. &lt;/ Li&gt; <li> Mit Standard-Mikroskop Betriebsverfahren zur Visualisierung von Proben durch, beginnend bei geringer Vergrößerung, die schrittweise Erhöhung Vergrößerung. </li><li> Stellen Sie sicher, das Mikroskop in geeigneter Weise für die Arbeitsabstand, Punktgröße und Astigmatismus angepasst. </li><li> Überprüfen Sie zur Fixierung Integrität. Wenn der LSEC ist meist frei von Lücken und enthält fenestrations Mess 30-250 nm Durchmesser dies in der Regel darauf hin, dass die Probenvorbereitung erfolgreich war. </li><li> Wenn die Sinuskurven sind voll von Lücken oder ohne Fensteranordnungen der Probenvorbereitung nicht erfolgreich war oder eine signifikante Pathologie. In diesem Fall schneiden die Probe mit einer sehr feinen Rasierklinge, und die Schnittflächen neu beschichtet und für die erfolgreiche Festsinuskurven analysiert. </li><li> Bei ca. 15.000-20.000 facher Vergrößerung wählen Flach LSEC Oberflächen, die frei von Schmutz mit guter Fixierung und wo die Fensteranordnungen deutlich sichtbar sind (in der Regel, die mindestens 10 Fensteranordnungen sind). </li><li> Bilder von mindestens 10 Sinuskurven zu speichern pro Leber, aus verschiedenen Bereichen der Blöcke unter Verwendung von mindestens zwei Blöcken pro Leber. Probenahme 10 Mikroaufnahmen bei 15.000 - 20.000-facher Vergrößerung pro Tier ist in der Regel ausreichend für die Quantifizierung der Fensteranordnungen, um stellvertretend für die gesamte Leber. </li></ol> 8. Analyse HINWEIS: ImageJ-Software, die von der NIH kostenlos heruntergeladen werden kann wird verwendet, um Fensterdurchmesser und Frequenz (Quantifizierung <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Bild öffnen J und stellen Sie die Waage mit der Maßstabsleiste im Bild (Screen shot 1) eingebettet ist. </li><li> Unter Verwendung der Polygon-Werkzeug in ImageJ, Spur um den gesamten flachen Bereich der LSEC einschließlich gefenstert und defenestrated Bereichen. Nicht nur verfolgen Sie die Siebplatten da dies fälschlich aufzublasen Porosität. Schließen alle großen Trümmerstücke, die auf der Zelloberfläche, die obscuri werden können, sindng Fensteranordnungen. </li><li> Zur Messung der Fensterdurchmesser, Spuren eine Linie durch den längsten Durchmesser jedes Fenster indem Sie das Linienwerkzeug aus und drücken Sie &quot;m&quot;, um die Linie zu messen, und &quot;d&quot; (zu ziehen), um die Linie auf das Bild dauerhaft zu ziehen. Diese Linie wird als die Fensterdurchmesser. Die Länge der Leitung wird nun zur Verfügung stehen im Ergebnisfeld von ImageJ (Screen shot 2). </li><li> Messen alle Lücken, die größeren Löcher im LSEC Zytoplasma als 250 nm sowie fenestrations sind. Lücken sind oft Artefakte reflektierenden schlechter Durchblutung oder Fixierung jedoch Lücken können auch als Folge von Krankheit und Toxizität auftreten. Die Daten für die Lücken aus Berechnung der Fensterparameter später in der Analyse ausgeschlossen werden. </li><li> Der Bereich der Lücken, die nicht kreisförmig sind, sollten von Tracing um die Lücken und die Berechnung ihrer Fläche auf ImageJ berechnet werden. </li><li> Fügen Sie die Daten aus der Box in ImageJ Ergebnisse in eine Excel-Tabelle für further Analyse. </li></ol> 9. Berechnungen <ol><li> Durchschnittliche Fensterdurchmesser = Durchschnitt aller Fenster Durchmesser (ohne Lücken, wo Lücken ≥ 250 nm). </li><li> Fläche = Fenestration pgr; r 2, wobei r der Radius, von dem einzelne fenestrations Durchmesser (r = d / 2), ohne Lücken berechnet. </li><li> Porosität (%) = (Σ (&amp; pgr; r 2) / Gesamtfläche analysiert - Σ (Bereich der Lücken =)) (&amp; mgr; m 2)) × 100. </li><li> Fenestration Frequenz = Gesamtzahl der fenestrations / (Gesamtfläche analysierten-Σ (Bereich der Lücken) (&amp; mgr; m 2). </li></ol> 10. Präsentation der Fenestration Daten Hinweis: Wann immer möglich, Publikationen, darunter die Quantifizierung von Fenster Daten sollten folgende Informationen enthalten <ol><li> Fenestration Durchmesser, mit einer Erklärung bestätigt, was Grenzdurchmesser verwendet werden, um in dem Fensteranordnungen in der Regel zu definieren (zwischen 50 bis 250 nm), Fenestration Frequenz (Zahl / &amp; mgr; m 2) und die Porosität (%). </li><li> Eine Erklärung zur Bestätigung, ob Lücken in der Analyse, Frequenzverteilung Graph der Fensterdurchmesser und die Anzahl der Leber, die Blöcke, Bildern und Fensteranordnungen sollten in die Analyse einbezogen werden einbezogen. </li></ol>

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<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li>
<li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Fähigkeit, den Status der Lebersinus Endothel genau und reproduzierbar zu messen, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Biologie dieser hochspezialisierten Zellen. Neuere Techniken wie strukturierte Beleuchtung Mikroskopie 32, Rasterkraftmikroskopie 33 und d-STORM (direkte Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) 34 wichtige Informationen vermitteln über die Morphologie dieser Zellen in vitro, aber SEM bleibt die primäre Methode zur Visualisierung und Messung ihr...

Die Lebersinus Endothelzellen (LSECs) sind sehr differenzierte Endothelzellen, die die Wand des hepatischen Sinusoid auszukleiden. LSECs mit Fensteranordnungen, die nicht-blendete perforiert Poren trans 50-250 nm Durchmesser. Bis zu 20% der Oberfläche des LSECs durch Fensterungen, die üblicherweise hunderte genannten Siebböden 1-3 (Figur 1) werden in Gruppen von zehn bedeckt. Fensteranordnungen ermöglichen die Übertragung von Plasma und nanosubstrates zwischen Blut und Hepatozyten, die Schaffung eines hocheffiziente Ultrafiltrationssystem. Fensteranordnungen sind dynamische Strukturen - sowohl ihrer Größe und / oder Anzahl kann als Reaktion auf verschiedene physiologische Zustände, Drogen und Krankheit verändert werden. Zum Beispiel sind Fensterungen im nüchternen größer als im gesättigten Zustand 4; 2-Di-iodoamphetamine erhöht Fensternummer; 5,6 und eine Reduktion der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen pro Zelle in Alterung und viele Krankheitszustände 7-13 auftritt </sup&gt;. Genaue Messung der Größe und Anzahl von Fensteranordnungen ist wichtig für das Verständnis, wie LSEC Morphologie wird durch verschiedene Krankheiten, toxische und physiologischen Zuständen beeinflusst; ihre Auswirkungen auf die Leberfunktion; und für die Entwicklung von Fenster modulierenden therapeutischen Interventionen 1. Das Studium der fenestrations ist schwierig. Der Durchmesser der Fensteranordnungen unterhalb der Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie, so bisher nur Beobachtung mittels Elektronenmikroskopie sowohl in intakten Lebergewebe oder Zucht LSECs möglich war. Das Rasterelektronenmikroskop (SEM) wurde am häufigsten verwendet, um Fenstergröße, die Frequenz und die Porosität (der Prozentsatz der LSEC Membran, die durch Fensterung perforiert ist) zu studieren, weil SEM ermöglicht die Beobachtung von großen Flächen der endothelialen Oberfläche und Messung von Tausenden wenn nicht Zehntausende von Fensteranordnungen. Trotz seiner Nützlichkeit, die Ergebnisse, die sich aus gemeldet werden SEM-basierte Studien fürLSEC Parameter wie Fenstergröße, die Anzahl, die Häufigkeit und die Porosität variieren weithin in der Literatur beschrieben (Tabelle 1). Fensteranordnungen und Siebplatten sind fragile Strukturen Vertrag zu brechen, erweitern oder zusammenwachsen während der Probenvorbereitung ist somit schonende Verarbeitung benötigt, um ihre Integrität zu bewahren. Erhöhte Perfusionsdruck 14; falsche Osmolarität der Fixiermittel und Puffer 15; unzureichende Fixierung oder Fixierungszeit; und die Geschwindigkeit der Postfixierung Entwässerung und Trocknung sind alle Bereiche der Verarbeitung für SEM, die Artefakte, die mit der Erhaltung der Ultrastruktur eingreifen (Figur 2) erzeugen kann. Verlust Fensterungen (&quot;Fenstersturz) und Fensterung Schrumpfung als Folge der schlechten Fixierung auftreten, was zu einer verringerten Durchmesser und Fensterung Zellporosität. Methoden, um den Erhalt von Proben für die REM-Analyse zu verbessern zuvor 15-17 beschrieben und diskutiert werdenhier mit zusätzlichen Tipps, wie Sie Probekonservierung zu verbessern. Die Hauptziele der Probenkonservierung sind, um Blut von der Sinusoide entfernen, so dass die Oberfläche der LSEC visualisiert und LSEC Schäden die durch Hochdruck oder verzögerte Fixierung zu vermeiden. Ganze Leberperfusion Fixiermittel über die Pfortader ist die bevorzugte Methode für Leberfixierung. Wie im Detail beschrieben, an anderer Stelle muß 16,18 Perfusion bei niedrigem Druck durchgeführt werden (beispielsweise 10 cm H 2 0) in den druckbedingten Artefakte Perfusion und Beschädigungen des LSEC vermeiden, typischerweise manifestiert sich als große Lücken in der Zellmembran. Jedoch können angemessenen Fixierung häufig mittels Nadel Perfusion von Leberbiopsien von Menschen und Tieren gewonnen werden, wie an anderer Stelle beschrieben 19. Diese Technik beinhaltet das direkte Einspritzen Fixiermittel in das Gewebe, bis Blut aus der Probe gespült und das Gewebe fest und fixiert. Fixation von Proben für die Elektronenmikroskopie braucht perf seinORMED möglichst schnell nach Beendigung des Blutflusses zu ultrastrukturelle Veränderungen als Folge der Lebern extrem schnelle autolytische Prozesse zu verhindern. Wir stellen auch ein Verfahren zur Bildanalyse, die der Aufnahme von Artefakten minimiert, und vereinheitlicht die Messung von Fensteranordnungen. Variation bei der Auswahl der Sinuskurven für Mikroaufnahmen, Bildanalyse von Artefakten, und die Messung der Zellbereich für Porosität und Fensterfrequenz haben große Unterschiede in veröffentlichten Ergebnissen geführt. Eine Standardmethode zur Bewertung und Messung der Fensteranordnungen und der Mindestanforderungen für die Datendarstellung nicht eindeutig in der Literatur bisher 4,10,20-31 gerichtet.

<table><tbody><tr><td>25% EM-Qualität Glutaraldehyd</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>Lagerbestand bis zur Verwendung bei -20 °C lagern, Wiedereinfrieren vermeiden</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Pulver</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Paraformaldehyd immer frisch</td></tr><tr><td>zubereiten Natrium-Cacodylat-Pulver</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td>0,2 M Vorratsöl, pH 7,4 durch Auflösen des Pulvers in dH2O, meist bei 0,1 M durch Herstellen einer 1:2-Verdünnung verwenden</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>1 M CaCl2 durch Auflösen des Pulvers in dH2O</td></tr><tr><td>Osmiumtretroxid</td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>Ampullen vor Gebrauch in schwacher Säure waschen, um Verunreinigungen zu vermeiden. 2 % Brühe in Glasflasche</td></tr><tr><td>Ethanol - Absolute</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836&nbsp;</td><td>100 % Ethanol muss hochwertig sein und mit einem Molekularsieb gelagert</td></tr> werden<tr><td>Andere Ethanolqualitäten</td><td>Labtech</td><td>EL5</td><td>Bereiten Sie bewertete Ethanole mit dH2O</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52619&nbsp;</td><td>Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen lassen</td></tr><tr><td>Kanülen</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td><td>18 G ist für die meisten Ratten geeignet, 22 G ist für die meisten Mäuse geeignet, aber es ist gut, ein paar 24 G zur Hand zu haben, wenn es sich um sehr kleine Mäuse</td></tr><tr><td>handelt Leitfähiges Kohleband</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>Kohlenstofffarbe</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td></td><td></td><td>Muss unter Lizenz erworben</td></tr><tr><td>werden Xylazin</td><td></td><td></td><td>Muss unter Lizenz bezogen werden</td></tr><tr><td>Molekularsieb</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208647</td><td>Entfernt Wasser aus dem 100 % Ethanol</td></tr></tbody></table>

eine standardisierte methode für die analyse von leber sinusoidalen endothelzellen und ihre fenestrationen durch rasterelektronenmikroskopie

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Sinusförmige Endothelzellen der Leber sind das Tor zur Leber, ihre transzellulären Fenestrationen ermöglichen den ungehinderten Transfer von kleinen und gelösten Substanzen aus dem Blut in das Leberparenchym für den Stoffwechsel und die Verarbeitung. Fensterungen sind dynamische Strukturen - sowohl ihre Größe als auch ihre Anzahl können als Reaktion auf verschiedene physiologische Zustände, Medikamente und Krankheiten verändert werden, was sie zu einem wichtigen Ziel für die Modulation macht. Um zu verstehen, wie die LSEC-Morphologie von verschiedenen Krankheits-, toxischen und physiologischen Zuständen beeinflusst wird und wie sich diese Veränderungen auf die Leberfunktion auswirken, ist eine genaue Messung der Größe und Anzahl der Fenestrationen erforderlich. In diesem Artikel beschreiben wir die Fixierungs- und Verarbeitungstechniken der Rasterelektronenmikroskopie, die in unserem Labor verwendet werden, um eine reproduzierbare Probenvorbereitung und genaue Interpretation zu gewährleisten. Zu den Methoden gehören die Perfusionsfixierung, die Sekundärfixierung und Dehydratisierung, die Vorbereitung für das Rasterelektronenmikroskop und die Analyse. Schließlich stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Methode zur standardisierten Bildanalyse zur Verfügung, von der alle Forscher auf diesem Gebiet profitieren werden.

Anfangs Visualisierung bei geringer Vergrößerung mit dem Rasterelektronenmikroskop zeigt, eine flache Oberfläche der Leber Probe mit einer exponierten Fläche groß genug, um viele große Lebergefäße und Sinusoide (Figur 1A) zu beobachten. Sicherstellen der korrekten Leberblock Platzierung auf der Montagestummel ist unerlässlich für den Erhalt von klaren Bildern der Sinusoide und die Glisson-Kapsel der Leber sollte aus diesem Grund (1B) vermieden werden. Erhöhen der Vergrößerung erlaubt nä...

Die gefensterte sinusoidale Endothelzelle der Leber ist ein biologisch wichtiges Filtersystem, das stark von verschiedenen Krankheiten, Toxinen und physiologischen Zuständen beeinflusst wird. Diese Veränderungen wirken sich erheblich auf die Leberfunktion aus. Wir beschreiben Methoden zur Standardisierung der Messung der Größe und Anzahl der Fenster in diesen Zellen.

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Lebersinusendothel zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Leber isoliert und mit Fixansmittel durchspült wird. Anschließend wird die Leber in Gewebeproben geschnitten und für die Elektronenmikroskopie durch Dehydratisierung vorbereitet.Anschließend werden die Leberproben sputterbeschichtet und im Elektronenmikroskop untersucht. Schließlich werden die Elektronenmikrografien analysiert und Durchmesser und Frequenz der Fenestren sowie die Porositätsprozentzahl berechnet. Letztendlich dient die Elektronenmikroskopie dazu, Veränderungen im sinusoidalen Endothel der Leber unter verschiedenen Bedingungen darzustellen.Diese Methode verschafft uns Einblick in die Ultrastruktur und Morphologie der Leberblutgefäße in ihrem Endothel. Sie kann auch verwendet werden, um die Niere und das Gehirn auf die gleiche Weise zu untersuchen. Alle Verfahren, bei denen Tiere verwendet werden, erfolgen gemäß der lokalen Gesetzgebung. Diese Arbeit wurde vom Ausschuss für Tierwohl des Sydney Local Health District genehmigt.Die zulässigen Verfahren sind in der Projektlizenzdokumentation beschrieben und folgen Richtlinien, die das Wohlbefinden der Tiere jederzeit sicherstellen. Es handelt sich um einen nicht überlebensfähigen Eingriff. Erwärmen Sie nach der Vorbereitung des Fixativs gemäß dem Textprotokoll den Perfusionspuffer und das Fixativ auf 35 bis 37 Grad Celsius.Nachdem das Tier durch eine einzige intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin anästhesiert wurde, überprüfen Sie die Sedierungstiefe durch den Rückzugsreflex der Hintergliedmaßen und einen Schwanzquetschtest. Anschließend führen Sie mit stumpfen Scheren einen Y-förmigen Schnitt in der Bauchdecke des Tieres durch, um die Leber und die Pfortader freizulegen. Danach legen Sie zwei sehr lockere Nahtlagen um die Pfortader an, eine proximal zur Leber und die andere weiter distal zur Leber.Kanülieren Sie die Pfortader mit einer entsprechend dimensionierten intravenösen Kanüle. Anschließend ziehen Sie die Nähte fest, um die Kanüle zu sichern. Beginnen Sie nun die Perfusion mit fünf bis 20 Milliliter PBS, die auf 37 Grad Celsius erwärmt wurden, bei einem Druck von 10 Zentimetern H2O.Vermeiden Sie, dass Luftblasen in die Leber gelangen, da diese Artefakte und einen zu hohen Luftdruck verursachen würden, was die Leber beschädigen würde. Durchtrennen Sie die abdominelle und thorakale Vena cava, damit der Puffer ungehindert aus der Leber austreten kann. Dies verhindert einen hohen Gegendruck, Schäden an der Leber, an sinusoidalen und endothelialen Zellen oder an LCCs. Sobald die Leber blutfrei ist, ersetzen Sie das PBS durch Elektronenmikroskopie- (EM-)Fixans und perfundieren Sie, bis die Leber verhärtet und sehr blass ist.Ungefähr fünf Minuten. Danach mit dem Skalpell die Leber in Blöcke von ein bis zwei Kubikmillimetern schneiden. Zur Nachfixierung EM-Fixativ verwenden.Fixieren Sie das Gewebe bei vier Grad Celsius für 24 bis 72 Stunden. Danach überführen Sie das Gewebe in 0,1 molarer Natrium-Cate-Pufferlösung und lagern es bei vier Grad Celsius bis zu 12 Monate lang, um die Proben für die Rasterelektronenmikroskopie oder REM zu montieren. Nach der Dehydrierung der Proben gemäß dem Textprotokoll beschriften Sie die Unterseite der metallischen REM-Präparatstifte und bringen doppelseitiges Kohlenstoffband auf die Oberseite der Stifte unter einem Stereomikroskop an, um die Proben zu visualisieren und die Oberfläche mit den besten Sinusoide für die REM zu identifizieren.Kleben Sie die Probe mit der gewählten Oberfläche nach oben auf die Kohlebandoberfläche des Stubs und befestigen Sie sie fest am Stub. Nach Durchführung der Sputter-Beschichtung und der REM-Untersuchung gemäß dem Textprotokoll öffnen Sie ein Bild in ImageJ und verwenden einen in das Bild eingebetteten Maßstabsbalken, um den Maßstab festzulegen. Nutzen Sie das Polygon-Werkzeug in ImageJ, um den gesamten flachen Bereich der LSEC einschließlich fenestrierter und nicht fenestrierter Bereiche nachzuzeichnen; schließen Sie dabei große Schmutzpartikel auf der Zelloberfläche aus, die Fenestrierungen verdecken könnten. Um den Durchmesser der Fenestrationen zu messen, ziehen Sie mit dem Linien-Werkzeug eine Linie durch den jeweils längsten Durchmesser jeder Fenestration.Drücken Sie M, um die Linie zu messen, und D, um die Linie dauerhaft auf dem Bild zu zeichnen. Diese Linie wird als Fensterungsdurchmesser definiert und ist nun im Ergebnisfeld von ImageJ verfügbar. Messen Sie alle Lücken, die größere Öffnungen im LSEC-Zytoplasma über 250 Nanometer sind, sowie die Fenestrierungen. Berechnen Sie die Fläche von Lücken, die nicht kreisförmig sind, indem Sie sie umfahren und ImageJ verwenden, um ihre Fläche anhand der Daten aus dem Ergebnisfeld in ImageJ zu berechnen. Tragen Sie diese Daten in eine Excel-Tabelle ein.Verwenden Sie für weitere Analysen die folgenden Formeln zur Durchführung von Fenestrierungsberechnungen. Der durchschnittliche Fenestrierungsdurchmesser entspricht dem Mittelwert aller Fenestrierungsdurchmesser. Die Fenestrierungsfläche entspricht pi r quadrat, wobei r aus den einzelnen Fenestrierungsdurchmessern berechnet wird.Der Porositätsprozentwert entspricht sigma pi R quadrat geteilt durch die analysierte Gesamtfläche in Quadratmikrometern, multipliziert mit 100; schließen Sie dabei die Summe der Lückenflächen von dieser Berechnung aus. Um die Daten in Publikationen darzustellen, geben Sie den Fenestrierungsdurchmesser an, zusammen mit einem Hinweis, dass Randdurchmesser zur Definition der Fenestrierungen verwendet wurden, sowie Angaben zur Fenestrierungshäufigkeit und Porosität. Fügen Sie außerdem eine Aussage hinzu, die bestätigt, ob Lücken in die Analyse einbezogen wurden, und fügen Sie ein Häufigkeitsverteilungsdiagramm des Fenestrierungsdurchmessers, die Anzahl der Leberprobenblöcke sowie Bilder bei. Das Rasterelektronenmikroskop (REM) bei niedriger Vergrößerung zeigt eine ebene Oberfläche der Leberprobe mit einem ausreichend großen freigelegten Bereich, um zahlreiche große Lebervenen, Sinusoide, den Portalkomplex sowie die zentrale Vene (ES) zu erkennen, wie hier dargestellt.Die korrekte Platzierung des Leberpräparats auf dem Probenträger ist entscheidend, um klare Bilder der Sinusoide zu erhalten; dabei ist darauf zu achten, dass die Glisson-Kapsel, die alle Details der Lebersinusoide bedeckt, vermieden wird. Aus diesem Grund ermöglicht, wie hier gezeigt, eine höhere Vergrößerung die Beobachtung der Fenestrierungen der LSEC. Die Platten der Hepatozyten können blutgefäßeähnlich erscheinen, doch Merkmale wie die BLI helfen bei der Orientierung.Diese Abbildung zeigt, dass ein hoher Perfusionsdruck Artefakte verursachen kann, wie beispielsweise große Lücken im Endothel, die durch die Koaleszenz der LSEC-SIV-Platten entstehen. Diese sind im REM leicht erkennbar und helfen, die Zellmembran direkt über den Kernen zu vermeiden, die als Wölbung unterhalb der Oberfläche der LSEC sichtbar ist, was zur Genauigkeit der Berechnungen der Fensterungsdichte und Porosität beiträgt. Schließlich ermöglichen die Quantifizierung des Durchmessers, der Dichte und der Häufigkeit der LSEC-Fensterungen eine empirische Messung der Fensterungen und erlauben die Erfassung von Veränderungen, die durch Alterung, Krankheiten, Toxine oder Therapien hervorgerufen werden. Nach dem Perfusionsverfahren kann das Gewebe für andere Methoden wie die Transmissionselektronenmikroskopie aufgearbeitet werden, um die zelluläre Ultrastruktur und die Mitochondrienstruktur zu untersuchen.Es kann auch für die Histologie verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Studium der Leber sinusförmige Endothelzellen (SECS) muss mit primären Zellen aus dem Tier erhalten, da keine Zelllinien existieren durchgeführt werden. Diese Methode basiert auf Leber Verdauung und differentielle Zentrifugation für SEC Reinigung für nachfolgende Kultivierung und Experimentieren.

In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Das Ziel dieses Protokolls ist, hohe Wirtschaftlichkeit und hohe Ausbeute von Hepatozyten und sinusförmigen endothelial Zellen von Leber zu erhalten. Dies geschieht durch die Vorrichtung der Leber mit einer Typ IV Kollagenase Lösung über die Pfortader, gefolgt von differentielle Zentrifugation, Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen zu erhalten.

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung vor, um die Endothelzellen der Mausaorta direkt zu beobachten. Diese Technik ist nützlich, wenn der zelluläre und molekulare Phänotyp von Endothelzellen in verschiedenen Strömungsmustern und bei der Entwicklung von Arteriosklerose untersucht wird.

Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Routinemethode für die Verwendung der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM), einer leistungsstarken 3D-Bildgebungstechnik. Die erfolgreiche Anwendung von SBF-SEM hängt von der richtigen Fixierung und Gewebefärbung sowie der sorgfältigen Berücksichtigung der Bildgebungseinstellungen ab. Dieses Protokoll enthält praktische Überlegungen für den gesamten Prozess.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Hier stellen wir vor, wie ein nicht-alkoholisches Fettlebererkrankung (NAFLD)-assoziiertes Hepatozelluläres Karzinom (HCC) Zebrafischmodell generiert werden kann, um die Auswirkungen von Cholesterinüberschuss auf die Lebermikroumgebung und die Immunzelllandschaft zu untersuchen.

Analyse der Lebermikroumgebung während des frühen Fortschreitens des nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung-assoziierten hepatozellulären Karzinoms im Zebrafisch

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Das vorliegende Protokoll optimiert die Methoden der  Leber-in-situ-Perfusion/Dezellularisierung und der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um eine zuverlässige Plattform zur Visualisierung der Dynamik des Remodells der extrazellulären Matrix (EZM) während der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) zu schaffen.

3D-Bildgebung der extrazellulären Matrix der Leber in einem Mausmodell der nicht-alkoholischen Steatohepatitis

Ein einfaches und umfassendes Protokoll, um dreidimensionale Details von Membrankontaktstellen zwischen Organellen in Hepatozyten aus der Leber oder Zellen in anderen Geweben zu erfassen.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.

Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

Erfahren Sie eine standardisierte Methode zur Analyse von Lebersinus-Endothelzellen und deren Fenestrationen mittels Rasterelektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Messungen von Durchmesser, Dichte und Porosität.

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

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