Eine standardisierte Methode für die Analyse von Leber sinusoidalen Endothelzellen und ihre Fenestrationen durch Rasterelektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Analyse des sinusoidalen Endothels der Leber. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Leber isoliert und mit Fixiermittel durchblutet wird. Als nächstes wird die Leber in Blöcke geschnitten und dehydriert, um sie für die Elektronenmikroskopie vorzubereiten.

Anschließend werden die Leberproben mit Sputtern beschichtet und unter einem Elektronenmikroskop untersucht. Abschließend werden die elektronenmikroskopischen Aufnahmen analysiert und der Fensterdurchmesser und die Häufigkeit sowie die prozentuale Porosität berechnet. Letztlich wird die Elektronenmikroskopie eingesetzt, um Veränderungen im sinusförmigen Endothel der Leber unter verschiedenen Bedingungen darzustellen.

Diese Methode gibt uns Einblick in die Ultrastruktur und Morphologie der Blutgefäße der Leber in ihrem Endothel. Es kann auch verwendet werden, um die Niere und das Gehirn auf die gleiche Weise zu untersuchen: Alle Eingriffe, bei denen Tiere verwendet werden, werden gemäß der lokalen Gesetzgebung durchgeführt. Diese Arbeit wurde vom Tierschutzausschuss des lokalen Gesundheitsbezirks von Sydney genehmigt.

Die erlaubten Verfahren sind in der Dokumentation der Projektlizenz beschrieben und folgen Richtlinien, die das Wohlergehen des Tieres jederzeit gewährleisten. Dies ist eine Operation, die nicht überleben kann. Nach der Herstellung des Fixiermittels gemäß dem Textprotokoll den Perfusionspuffer und das Fixiermittel auf 35 bis 37 Grad Celsius erwärmen.

Sobald das Tier mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin anästhesiert ist, beurteilen Sie den Grad der Sedierung durch Zurückziehen der Hintergliedmaßen und ein Einklemmen des Schwanzes. Machen Sie dann mit einer stumpfen Schere einen Y-Schnitt in den Bauch des Tieres, um die Leber und die Pfortader freizulegen. Binden Sie dann zwei sehr lockere Nähte um die Pfortader, eine proximal zur Leber und die andere eher distal zur Leber.

Kanülieren Sie die Pfortader mit einer Infusionskanüle in geeigneter Größe. Ziehen Sie dann die Nähte fest, um die Kanüle zu sichern. Mit fünf bis 20 Millilitern PBS, die auf 37 Grad Celsius erwärmt werden, beginnt man nun mit der Perfusion bei einem Druck von 10 Zentimetern H2O.

Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen in die Leber, die Artefakte und einen zu hohen Luftdruck erzeugen würden, der die Leber schädigt, durchtrennen Sie die CVA der Bauch- und Brustvene, damit der Puffer frei aus der Leber austreten kann. Dies verhindert einen hohen Gegendruck, eine Schädigung der Leber, der sinusförmigen und endothelialen Zellen oder LCCs. Sobald die Leber blutfrei ist, ersetzen Sie das PBS durch Elektronenmikroskopie oder em, Fixiermittel und Perfund, bis die Leber verhärtet und sehr blass ist.

Ungefähr fünf Minuten. Schneide dann mit dem Skalpell die Leber in ein bis zwei Kubikmillimeter große Blöcke. Verwenden Sie em Fixativ zum Posten.

Fixieren Sie das Taschentuch für 24 bis 72 Stunden bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann das Gewebe in einen 0,1 molaren Natrium-Cate-Puffer und lagern Sie es bis zu 12 Monate lang bei vier Grad Celsius, um die Proben für die Rasterelektronenmikroskopie oder das REM zu montieren. Nachdem Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll dehydriert haben, beschriften Sie die Basis der REM-Stummel aus Metall und kleben Sie doppelseitiges Kohleband unter einem Präpariermikroskop auf die Oberseite der Stiche, visualisieren Sie die Proben, um die Oberfläche mit den besten Sinuskurven für das REM zu identifizieren.

Lace, eine ausgewählte Oberfläche mit der Vorderseite nach oben, die auf die Oberfläche des Carbonbandes des Stummels zeigt, und kleben Sie sie fest auf den Stummel. Nachdem Sie die Sputterbeschichtung und das REM gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben, öffnen Sie ein Bild in Bild J und verwenden Sie eine in das Bild eingebettete Maßstabsleiste, um den Maßstab mit dem Polygonwerkzeug in Bild J festzulegen. Verfolgen Sie den gesamten flachen Bereich des LSEC, einschließlich der gefensterten und gefensterten Bereiche, und schließen Sie alle großen Schmutzpartikel aus, die sich auf der Zelloberfläche befinden und die Fenster verdecken könnten. Um den Fensterdurchmesser zu messen, platzieren Sie eine Linie durch den längsten Durchmesser jeder Fensterung, indem Sie das Linienwerkzeug auswählen.

Drücken Sie M, um die Linie zu messen, und D, um die Linie dauerhaft auf dem Bild zu zeichnen. Diese Linie ist als Fensterdurchmesser definiert und wird nun im Ergebnisfeld von Bild J verfügbar sein.Messen Sie alle Lücken, bei denen es sich um größere Löcher im LSEC-Zytoplasma über 250 Nanometer handelt, sowie Fensterungen. Berechnen Sie die Fläche der Lücken, die nicht kreisförmig sind, indem Sie sie nachzeichnen und Bild J verwenden, um ihre Fläche nach den Daten aus dem Ergebnisfeld in Bild J in eine Excel-Tabelle zu berechnen.

Verwenden Sie für die weitere Analyse die folgenden Formeln für die Durchführung von Fensterberechnungen. Der durchschnittliche Fensterdurchmesser entspricht dem Durchschnitt aller Fensterdurchmesser. Die Fensterfläche entspricht pi r zum Quadrat, wobei R aus den einzelnen Fensterdurchmessern berechnet wird.

Der Porositätsprozentsatz entspricht dem Quadrat von Sigma Pi R über die gesamte analysierte Fläche, und Mikrometer mal 100 schließen die Gesamtfläche der Lücken aus dieser Berechnung aus. Zur Darstellung der Daten in Veröffentlichungen gehören der Fensterdurchmesser mit einer Aussage, die bestätigt, dass Grenzdurchmesser zur Definition von Fenstern, Fensterhäufigkeit und Porosität verwendet wurden, einschließlich einer Aussage, die bestätigt, ob Lücken in die Analyse einbezogen wurden, und einem Häufigkeitsverteilungsdiagramm des Fensterdurchmessers und der Anzahl der Leberblöcke sowie Bilder. Eine geringe Vergrößerung durch REM zeigt eine flache Oberfläche der Leberprobe mit einem exponierten Bereich, der groß genug ist, um viele große Lebergefäße und Sinusoide, einschließlich des Pfortaders, und des zentralen ES zu beobachten, wie hier gezeigt.

Die korrekte Platzierung des Leberblocks auf dem Montagestummel ist unerlässlich, um klare Bilder der Sinusoide zu erhalten, und die Glitzerkapsel, die alle Details der Sinusoide der Leber abdeckt, sollte vermieden werden. Aus diesem Grund ermöglicht eine höhere Vergrößerung, wie hier gezeigt, die Beobachtung von LSEC-Fenstern. Die Platten der Hepatozyten können wie Blutgefäße aussehen, aber Merkmale wie der BLI helfen bei der Orientierung.

Diese Abbildung zeigt, dass ein hoher Überdruckdruck Artefakte verursachen kann, wie z. B. große Lücken im Endothel, von denen angenommen wird, dass sie durch die Koaleszenz der LSEC-SIV-Platten verursacht werden, die im REM leicht zu identifizieren sind, wobei die Zellmembran direkt über den Zellkernen vermieden wird, die als Ausbuchtung unter der Oberfläche des LSEC zu sehen ist, was die Genauigkeit der Fenestrationsdichte und Porositätsberechnungen erleichtert. Schließlich ermöglicht die Quantifizierung der Dichte und Häufigkeit des Lesec-Fensterdurchmessers eine empirische Messung der Fensterungen und die Messung von Veränderungen, die durch Alterskrankheiten, Toxine oder Therapien induziert werden. Nach dem Perfusionsverfahren kann das Gewebe für andere Techniken wie die Transmissionselektronenmikroskopie aufbereitet werden, um die zelluläre Ultrastruktur und die mitochondriale Struktur zu untersuchen.

Es kann auch für die Histologie verwendet werden.