Name: Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie ein optimiertes Protokoll für retinale Venenverschlüsse bei Mäusen mit Rose Bengal und Laser-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Untersuchung vaskulärer Verletzungen und Ödeme ohne chirurgischen Eingriff.

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<div>Diese Arbeit wurde vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (an CCO), dem National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (an AMP) und dem National Institute on Aging (NIA) R21AG063012 (an CMT) unterstützt.</div>

Dieses Protokoll folgt der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Nagetierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigt und überwacht.
HINWEIS: Alle Experimente verwendeten zwei Monate alte männliche Mäuse, die etwa 20 g wogen.
1. Herstellung und Verabreichung von Tamoxifen zur induzierbaren genetischen Ablation von gefloxten Genen
HINWEIS: Der Durchmesser des Netzhautgefäßes kann durch das Gewicht des Tieres beeinflusst werden. Stellen Sie sicher, dass alle Tiere, die für einen Versuch verwendet werden, ein ähnliches Gewicht haben.
<ol><li>Verdünnen Sie Tamoxifen in Maisöl auf eine Konzentration von 20 mg / ml. HINWEIS: Tamoxifen ist ein Giftstoff und ist lichtempfindlich. Vor Licht schützen, z.B. mit Alufolie.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Lösung für ein paar Sekunden vor.</li>
	<li>Im Ofen bei 55 °C 15 min ziehen lassen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich das Tamoxifen vollständig aufgelöst hat. Zusätzliches Wirbeln kann erforderlich sein.</li>
	<li>Lagern Sie die Lösung bis zu 1 Woche bei 4 °C.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel zur Tamoxifen-Injektion. Reinigen Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol.  Verabreichen Sie 2 mg Tamoxifen (100 μl von 20 mg/ml) intraperitoneal (IP) einmal täglich für die festgelegte Zeit gemäß der spezifischen induzierbaren Cre-Linie.</li>
	<li>Lassen Sie den Tieren zwei Tage Ruhe, bevor Sie mit den Versuchen beginnen.</li>
</ol>2. Herstellung von Reagenzien für die Laser-Photokoagulation
<ol><li>Rose Bengal HINWEIS: Rose bengal ist lichtempfindlich. Bis zur Verwendung im Dunkeln aufbewahren und frisch zubereiten, um beste Ergebnisse zu erzielen.<ol><li>Bereiten Sie Rosenbengalen vor, indem Sie es in steriler Kochsalzlösung auf 5 mg/ml verdünnen und durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtrieren.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit Rosenbengalen versehen ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Ketamin/Xylazin<ol><li>Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung entsprechend für folgende Konzentrationen verdünnen: Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Carprofen<ol><li>Verdünnen Sie Carprofen auf 1 mg/ml in steriler Kochsalzlösung.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit Carprofen ausgestattet ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterile Kochsalzlösung<ol><li>Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze vor, die mit einer 26-g-Nadel mit steriler Kochsalzlösung versehen ist.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Laser-Setup
<ol><li>Behandeln Sie das Lichtwellenleiterkabel vorsichtig und verbinden Sie es mit der Lasersteuerbox und dem Laseradapter des Netzhautmikroskops.</li>
	<li>Schalten Sie den Lampenkasten des Netzhautmikroskops ein.</li>
	<li>Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Imaging-Programm.</li>
	<li>Passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie es mit einem weißen Blatt Papier vor das Mausokular halten und im Bildgebungsprogramm auf Anpassen klicken.</li>
	<li>Schalten Sie die Lasersteuerbox ein, indem Sie den Schlüssel drehen und den Anweisungen auf dem Bildschirm der Lasersteuerbox folgen. HINWEIS: Der in diesem Experiment verwendete Laser ist Klasse 3B und kann Augenschäden verursachen. Tragen Sie eine Schutzbrille, wenn Sie den Laser bedienen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Basislaserleistung.<ol><li>Verwenden Sie einen Laserleistungsmesser.</li>
		<li>Stellen Sie den Bildschirm der Lasersteuerbox auf folgende Parameter ein: 50 mW und 2.000 ms.</li>
		<li>Schalten Sie den Laser ein und platzieren Sie den Leistungsmesser vor dem Okular. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Licht des Mikroskops ausgeschaltet ist, während Sie die Basislaserleistung testen.</li>
		<li>Drücken Sie das Fußschalterpedal, um den Laser zu aktivieren.</li>
		<li>Die Laserleistung soll 13-15 mW betragen. HINWEIS: Die Anzeige der Laserleistung bestimmt die Erfolgsrate bei Netzhautvenenverschlüssen. Wenn die Laserleistung zu niedrig ist, können Anpassungen an der Leistung und dem Zeitpunkt der Laserbelichtung vorgenommen werden. Empfehlungen finden Sie in Tabelle 1 .</li>
	</ol></li>
	<li>Passen Sie die experimentelle Laserleistung an, indem Sie den Bildschirm der Lasersteuerbox für die folgenden Parameter einrichten: 100 mW, 1.000 ms.</li>
	<li>Schalten Sie den Laser aus. HINWEIS: Aus Sicherheitsgründen und um eine Überhitzung zu vermeiden, ist es am besten, den Laser zwischen den Mäusen ausgeschaltet zu lassen.</li>
</ol>4. Mausschwanzvenen-Injektion von Rose Bengal
<ol><li>Gießen Sie 300 ml Wasser in ein 500-ml-Becherglas.</li>
	<li>Erwärmen Sie das Becherglas in der Mikrowelle für 1 Min.</li>
	<li>Geben Sie Gaze in das warme Wasser im Becherglas.</li>
	<li>Setzen Sie die Maus in eine Rückhaltemaschine.</li>
	<li>Drücken Sie die Gaze vorsichtig in den Mausschwanz und suchen Sie nach den erweiterten Venen. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle nach der Warmwasserdilatation mit einem Alkoholtupfer.</li>
	<li>Führen Sie die Nadel in die Injektionsstelle ein und ziehen Sie an der Spritze, um sicherzustellen, dass Sie sich in der Vene befinden. Injizieren Sie dann die Mausschwanzvene und verabreichen Sie die richtige Menge entsprechend dem Gewicht des Tieres (37,5 mg/kg). Üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, um Hämatome oder Blutungen zu vermeiden. Löschen Sie die Website.</li>
	<li>Lösen Sie die Maus aus der Rückhalteeinrichtung und legen Sie sie wieder in den Käfig.</li>
	<li>Lassen Sie die Rose Bengal vor der Injektion von Anästhetika 8 Minuten lang zirkulieren. HINWEIS: Dadurch liegen insgesamt 10 Minuten zwischen der Rose Bengal Injektion und der Laserbestrahlung.</li>
</ol>5. Verschluss der Hauptvenen
<ol><li>Schalten Sie die beheizte Mausplattform ein.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid in jedes Auge.</li>
	<li>Injizieren Sie 150 μl der Anästhetika, Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg) IP. HINWEIS: Während dieses Vorgangs erhielt die Maus zwei IP-Injektionen. Daher wechselten sich die Seiten ab. Die IP-Injektion für die Anästhesie wurde in den unteren rechten Bauchquadranten gegeben, und die Kochsalzlösung wurde in den unteren linken Bauchquadranten injiziert. Es wird empfohlen, vor der Injektion an der Spritze zu ziehen, um sicherzustellen, dass sich die Nadel im Bauch und nicht in den Organen befindet.</li>
	<li>Kneifen Sie das Tier in die Zehen, um die Tiefe der Anästhesie zu bestimmen, und warten Sie, bis es nicht mehr reagiert.</li>
	<li>Fügen Sie einen Tropfen Proparacainhydrochlorid pro Auge (Analgetikum) hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie Gelsalbe auf beide Augen hinzu.</li>
	<li>Injizieren Sie 150 μL Carprofen subkutan zwischen die Ohren.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus auf der Plattform.</li>
	<li>Passen Sie die Plattform an, bis die Sicht auf den retinalen Fundus klar und fokussiert ist.</li>
	<li>Zählen Sie die Netzhautvenen und machen Sie ein Bild des Fundus. HINWEIS: Netzhautvenen sind dunkler und breiter als Arterien. Venen und Arterien wechseln sich ab; Manchmal kann sich jedoch eine verzweigte Arterie in der Nähe des Sehnervs und damit zwei benachbarte Arterien befinden.</li>
	<li>Schalten Sie den Laser ein und zielen Sie auf eine Netzhautvene in ca. 375 μm Entfernung von der Sehscheibe.</li>
	<li>Bestrahlen Sie das Gefäß, indem Sie den Fußschalter drücken und den Laserstrahl leicht bis zu 100 μm bewegen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und bewegen Sie den Laserstrahl nach jedem Puls so, dass die Bestrahlung nicht auf eine Stelle fokussiert wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Bestrahlung auf anderen großen Gefäßen, um 2-3 Verschlüsse zu erreichen.</li>
</ol>6. Bestimmung der Anzahl der am Tag 0 verschlossenen Venen
<ol><li>Schalten Sie die Lampe aus, nachdem Sie die Gefäße bestrahlt haben, und warten Sie 10 Minuten. HINWEIS: Lichteinwirkung kann Netzhautschäden und Entzündungen verursachen. Schalten Sie die Lampe während der Wartezeit aus, um die Exposition zu minimieren7.</li>
	<li>Schalten Sie die Lampe wieder ein und zählen Sie die Anzahl der verschlossenen Venen.</li>
	<li>Machen Sie ein Bild des Fundus.</li>
</ol>7. Nachsorge
<ol><li>Injizieren Sie 1 ml sterile Kochsalzlösung. HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 5, Schritt 3.</li>
	<li>Fügen Sie Gleitmittel Augentropfen auf beide Augen hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie Gelsalbe auf beide Augen hinzu.</li>
	<li>Beobachten Sie, wie sich die Maus von der Narkose erholt, und bringen Sie sie nicht mit den anderen Tieren in den Käfig zurück, bis sie sich vollständig erholt hat. Carprofen (5 mg/kg) kann täglich bis zu 2 Tage nach dem Eingriff verabreicht werden. Wenn sie auf Menschen angewendet werden, ist Schmerz kein Symptom von RVO. HINWEIS: Lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.</li>
</ol>8. Beurteilung des Netzhautödems mittels optischer Kohärenztomographie (OCT)
HINWEIS: Dieser Schritt kann zum Zeitpunkt des Interesses des Prüfers durchgeführt werden. Der Höhepunkt des Netzhautödems für eine C57BL / 6J-Maus ist 1 Tag nach dem RVO-Verfahren. Dieser Zeitpunkt kann je nach Hintergrund der Maus variieren.
<ol><li>Schalten Sie den Leuchtkasten des Netzhautbildmikroskops, das OCT-Gerät und die beheizte Mausplattform ein.</li>
	<li>Befolgen Sie am Tag nach dem Verschluss die Schritte 5.2 bis 5.7, um das Tier vorzubereiten.</li>
	<li>Öffnen Sie die Softwareprogramme für die Bildbearbeitung und das Office-Anpassungstool.</li>
	<li>Stellen Sie im OAT-Programm den Nudge auf 5 ein.</li>
	<li>Nehmen Sie OCT bei 75 μm distal von der Verbrennung oder 4 Klicks.</li>
	<li>Nehmen Sie OCT-Bilder an vier Quadranten der Netzhaut auf.</li>
	<li>Analysieren Sie die OAT-Abbilder mithilfe einer Ablaufverfolgungssoftware.</li>
	<li>Vergleichen Sie die Netzhautdicke von vorbestrahlten Messungen mit 1 Tag nach RVO oder zum interessierenden Zeitpunkt. HINWEIS: Berücksichtigen Sie bei der Analyse der Daten die Anzahl der bestrahlten Venen, da dies die Entwicklung von Netzhautödemen beeinflussen kann. Die Tiere werden dann durch Verabreichung von Anästhetika eingeschläfert, gefolgt von einer Perfusionsoperation, die nicht überlebt.</li>
</ol>

<ol><li>Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+retinal+vein+occlusion%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+prevalence%2C+incidence%2C+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors.</a> Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).</li>
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<li>Iftikhar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+peak+vision+in+retinal+vein+occlusion+patients+treated+for+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Loss of peak vision in retinal vein occlusion patients treated for macular edema.</a> American Journal of Ophthalmology. 205, 17-26 (2019).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.

Das Maus-RVO-Modell bietet eine Möglichkeit, die RVO-Pathologie besser zu verstehen und potenzielle Therapeutika zu testen. Während das Maus-RVO-Modell in der Praxis weit verbreitet ist, besteht ein Bedarf an einem aktuellen detaillierten Protokoll des Modells, das seine Variabilität adressiert und die Optimierung des Modells beschreibt. Hier stellen wir einen Leitfaden mit Beispielen aus der Praxis zur Verfügung, was geändert werden kann, um die konsistentesten Ergebnisse in einer Kohorte von Versuchstieren zu erzielen ...

Der retinale Venenverschluss (RVO) ist eine häufige retinale Gefäßerkrankung, von der im Jahr 2015 weltweit etwa 28 Millionen Menschen betroffen waren1. RVO führt bei Erwachsenen und älteren Menschen im erwerbsfähigen Alter zu einem Rückgang und Verlust der Sehkraft, was eine anhaltende sehgefährdende Krankheit darstellt, die im nächsten Jahrzehnt voraussichtlich zunehmen wird. Einige der unterschiedlichen Pathologien der RVO umfassen hypoxisch-ischämische Verletzungen, Netzhautödeme, Entzündungen und neuronalen Verlust2. Derzeit ist die erste Behandlungslinie für diese Erkrankung die Verabreichung von vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Inhibitoren (VEGF). Während die Anti-VEGF-Behandlung dazu beigetragen hat, Netzhautödeme zu verbessern, sind viele Patienten immer noch mit einem Rückgang des Sehvermögens konfrontiert3. Um die Pathophysiologie dieser Krankheit besser zu verstehen und mögliche neue Behandlungslinien zu testen, ist es notwendig, ein funktionelles und detailliertes RVO-Mausmodellprotokoll für verschiedene Mausstämme zu erstellen.
Es wurden Mausmodelle entwickelt, die das gleiche Lasergerät verwenden, das bei menschlichen Patienten verwendet wird, gepaart mit einem Bildgebungssystem, das auf die richtige Größe für eine Maus skaliert ist. Dieses Mausmodell der RVO wurde erstmals 20074 beschrieben und von Ebneter und anderen weiter etabliert 4,5. Schließlich wurde das Modell von Fuma et al. optimiert, um wichtige klinische Manifestationen von RVO wie das Netzhautödem6 zu replizieren. Seit das Modell zum ersten Mal berichtet wurde, haben viele Studien es mit der Verabreichung eines Photosensibilisator-Farbstoffs verwendet, gefolgt von der Photokoagulation der wichtigsten Netzhautvenen mit einem Laser. Die Menge und Art des verabreichten Farbstoffs, die Laserleistung und die Expositionszeit variieren jedoch signifikant zwischen den Studien, die diese Methode verwendet haben. Diese Unterschiede können oft zu einer erhöhten Variabilität des Modells führen, was die Replikation erschwert. Bis heute gibt es keine veröffentlichten Studien mit spezifischen Details über mögliche Wege zur Optimierung.
Dieser Bericht stellt eine detaillierte Methodik des RVO-Mausmodells im C57BL/6J-Stamm und einem Tamoxifen-induzierbaren endothelialen Caspase-9-Knockout-Stamm (iEC Casp9KO) mit einem C57BL/6J-Hintergrund vor, der für die RVO-Pathologie als Referenzstamm für eine genetisch veränderte Maus relevant ist. Eine frühere Studie hatte gezeigt, dass eine nicht-apoptotische Aktivierung der endothelialen Caspase-9 ein Netzhautödem auslöst und den neuronalen Tod fördert8. Die Erfahrung mit diesem Stamm half dabei, mögliche Modifikationen zu ermitteln und Einblicke in das RVO-Mausmodell zu geben, das auf andere genetisch veränderte Stämme anwendbar sein kann.

<table><tbody><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>NADA #141-199</td><td>halten bei 4 > C</td></tr><tr><td>Maisöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Faser-Patchkabel</td><td>Thor Labs</td><td>M14L02</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>Alcon</td><td>00658 06401</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Lasercheck</td><td>Coherent</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrin</td><td>Akorn</td><td>NDCL174478-201-15</td><td></td></tr><tr><td>Phoneix Micron IV mit Meridian,&nbsp; StreamPix- und OCT-Module</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proparacainhydrochlorid</td><td>Akorn</td><td>NDC: 17478-263-12</td><td>halten bei 4 > C</td></tr><tr><td>Refresh</td><td>Allergan</td><td>94170</td><td></td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330000-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-5G</td><td>lichtempfindlich</td></tr><tr><td>Tropicamid</td><td>Akorn</td><td>NDC: 174478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierung des mausmodells mit retinalen venenverschlüssen zur begrenzung der variabilität

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mausmodelle des retinalen Venenverschlusses (RVO) werden häufig in der Augenheilkunde verwendet, um hypoxisch-ischämische Verletzungen in der neuralen Netzhaut zu untersuchen. In diesem Bericht wird eine detaillierte Methode, die kritische Schritte aufzeigt, mit Empfehlungen zur Optimierung bereitgestellt, um konsistent erfolgreiche Okklusionsraten über verschiedene genetisch veränderte Mausstämme hinweg zu erreichen. Das RVO-Mausmodell besteht hauptsächlich aus der intravenösen Verabreichung eines Photosensibilisator-Farbstoffs, gefolgt von einer Laser-Photokoagulation unter Verwendung eines Netzhaut-Bildgebungsmikroskops, das an einem ophthalmogesteuerten Laser befestigt ist. Drei Variablen wurden als Determinanten der Okklusionskonsistenz identifiziert. Durch die Anpassung der Wartezeit nach der Verabreichung von Rosenbengalen und das Ausbalancieren der Basislinie und der experimentellen Laserleistung kann die Variabilität zwischen den Experimenten begrenzt und eine höhere Erfolgsrate von Okklusionen erreicht werden. Mit dieser Methode können Netzhauterkrankungen untersucht werden, die durch Netzhautödeme und hypoxisch-ischämische Verletzungen gekennzeichnet sind. Da dieses Modell Gefäßverletzungen induziert, kann es auch zur Untersuchung des Neurovaskulaturs, des neuronalen Todes und der Entzündung angewendet werden.

Das RVO-Mausmodell zielt darauf ab, erfolgreich Verschlüsse in den Netzhautvenen zu erreichen, die zu hypoxisch-ischämischen Verletzungen, einem Abbau der Netzhautbarriere im Blut, neuronalem Tod und Netzhautödem führen8. Abbildung 1 zeigt eine Zeitleiste der Schritte zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit, eine schematische Darstellung des experimentellen Designs und skizziert Schritte, die je nach experimenteller Fragestellung weiter optimiert werden können. Die ...

Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für den retinalen Venenverschluss unter Verwendung von Rose Bengal und einem lasergesteuerten retinalen Bildgebungsmikroskopsystem mit Empfehlungen zur Maximierung der Reproduzierbarkeit in gentechnisch veränderten Stämmen.

Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Das Protokoll bietet ein Modell, um Mechanismen von Gefäßverletzungen und der anschließenden Entwicklung von Ödemen auf nicht-invasive Weise zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Verletzung im Laufe der Zeit ohne chirurgischen Eingriff live verfolgen können. Dies bietet Möglichkeiten, Behandlungen effizienter zu testen.Es kann schwierig sein, zu lernen, wie man die richtige Schwanzvenierung durchführt und das Tier richtig auf der Plattform unterbringt. Für beide Techniken empfehle ich, geduldig zu sein und die Dinge langsam anzugehen. Fassen Sie zunächst vorsichtig das Glasfaserkabel an und verbinden Sie es mit der Lasersteuerbox und dem Laseradapter des Netzhautmikroskops, und schalten Sie dann die Lampenbox des Netzhautmikroskops ein.Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Bildbearbeitungsprogramm. Legen Sie ein weißes Blatt Papier vor das Mikroskop-Okular und passen Sie den Weißabgleich an, indem Sie im Bildgebungsprogramm auf Einstellen klicken. Schalten Sie die Lasersteuerbox ein, indem Sie die Taste drehen und den Anweisungen auf dem Bildschirm der Lasersteuerbox folgen.Um die Basislaserleistung zu überprüfen, stellen Sie die Lasersteuerbox auf 50 Milliwatt und 2.000 Millisekunden ein. Schalten Sie dann den Laser ein und legen Sie den Leistungsmesser vor das Okular. Drücken Sie das Fußschalterpedal, um den Laser zu aktivieren, mit dem Ziel, dass die Laserleistung 13 bis 15 Milliwatt beträgt.Stellen Sie dann die experimentelle Laserleistung auf 100 Milliwatt und 1.000 Millisekunden ein und schalten Sie den Laser aus. Gießen Sie 300 Milliliter Wasser in ein 500-Milliliter-Becherglas und erwärmen Sie das Becherglas eine Minute lang in der Mikrowelle. Dann legen Sie eine Gaze in das warme Wasser.Als nächstes legen Sie eine zwei Monate alte männliche Maus in eine Fessel. Drücken Sie die warme Gaze vorsichtig in den Mausschwanz und suchen Sie nach den erweiterten Venen. Injizieren Sie mit einer 26-Gauge-Nadel die entsprechende Menge Rosenbengalen entsprechend dem Gewicht des Tieres und üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus, um Hämatome oder Blutungen zu vermeiden, bevor Sie die Stelle abwischen.Lösen Sie dann die Maus aus der Rückhalteeinrichtung und legen Sie sie wieder in den Käfig. Lassen Sie die Rose Bengal acht Minuten vor der Injektion von Anästhetika zirkulieren. Schalten Sie die beheizte Mausplattform ein.Dann fügen Sie einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid in jedes Auge der Maus hinzu. Nach der Bestätigung der Anästhesie fügen Sie einen Tropfen Proparacainhydrochlorid pro Auge hinzu und fügen Sie dann Augensalbe zu beiden Augen hinzu. Als nächstes injizieren Sie 150 Mikroliter Carprofen subkutan zwischen die Ohren.Legen Sie dann die Maus auf die Plattform und stellen Sie die Plattform ein, bis die Sicht auf den retinalen Fundus klar und fokussiert ist. Zählen Sie die Netzhautvenen und machen Sie ein Bild des Fundus. Als nächstes schalten Sie den Laser ein und zielen Sie auf eine Netzhautvene, die etwa 375 Mikrometer von der Sehscheibe entfernt ist.Bestrahlen Sie das Gefäß, indem Sie den Fußschalter drücken und den Laserstrahl leicht bis zu 100 Mikrometer bewegen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal und bewegen Sie den Laserstrahl nach jedem Puls so, dass die Bestrahlung nicht auf eine Stelle fokussiert wird. Wiederholen Sie die Bestrahlung auf anderen großen Gefäßen, um zwei bis drei Verschlüsse zu erreichen.Nachdem Sie die Gefäße bestrahlt haben, schalten Sie die Lampe aus und warten Sie 10 Minuten. Schalten Sie dann die Lampe wieder ein, zählen Sie die Anzahl der verschlossenen Venen und machen Sie ein Bild des Fundus. Nach der Bildaufnahme und der Kochsalzlösung fügen Sie Gleitmittel Augentropfen und Gelsalbe auf beide Augen hinzu.Beobachten Sie, wie sich die Maus von der Narkose erholt, und bringen Sie sie erst dann mit anderen Tieren in den Käfig zurück, wenn sie sich vollständig erholt hat. Die Anzahl der Okklusionen, die unmittelbar nach der Laserbestrahlung erreicht wurden, unterschied sich nicht zwischen den Tieren, die 10 und 20 Minuten nach der Verabreichung von Rosenbengalen gelasert wurden. Die Anzahl der Verschlüsse, die bis zu einem Tag nach dem retinalen Venenverschluss auftraten, nahm bei Tieren, die 20 Minuten nach der Verabreichung von Rosenbengalen gelasert wurden, unabhängig vom Genotyp signifikant ab.Ohne die experimentelle Leistung von 100 Milliwatt zu modifizieren, führte eine niedrige Basislaserleistung von 11,5 Milliwatt zu keinen Okklusionen. Im Gegensatz dazu führte eine Basislaserleistung von 13,5 Milliwatt zu erfolgreichen Okklusionen. Vier Haupttypen von Okklusionen treten nach der Laser-Photokoagulation auf: vollständig verschlossene Gefäße, teilweise verschlossene Gefäße, teilweise reperfundierte und vollständig reperfundierte Gefäße.Das bestrahlte Gefäßsystem von Tamoxifen-induzierbaren Endothelzell-Casp9-Knockout-Mäusen verbrachte mehr Zeit in teilweise reperfundierten und teilweise verschlossenen Zuständen als das von C57 Black 6-Mäusen, die mehr Zeit in vollständig verschlossenen Zuständen verbrachten. Der Verschlusszustand der Gefäße ändert sich innerhalb der ersten 10 Minuten nach der Laser-Photokoagulation schnell und flammenförmige Blutungen werden 24 Stunden nach der Verletzung beobachtet. Nach einem Netzhautvenenverschluss traten verschiedene ophthalmologische Pathologien auf.Das Ausmaß des Netzhautödems nach retinalem Venenverschluss kann bei den verletzten Augen mit optischen Kohärenztomographie-Bildern quantifiziert werden. Der Zustand der neuronalen Schichten kann auch bestimmt werden, indem die Desorganisation der inneren Schichten der Netzhaut beurteilt wird. Ein Beispiel für ein optisches Kohärenztomographiebild mit den entsprechenden Beschriftungen für jede Schicht ist hier dargestellt.Die Messung der Basislaserleistung ist wichtig. Diese Anzeige hat einen großen Einfluss auf den Erfolg der Okklusionen und kann optimiert werden. Zusätzliche Methoden wie OCT, ERG und Optiger können durchgeführt werden.Dies wird dazu beitragen, die Auswirkungen neurovaskulärer Verletzungen auf die neuronale Integrität der Netzhaut und die Funktion der Sehbahnen zu untersuchen. Diese Technik ebnet den Weg, um die molekularen Signalwege zu untersuchen, die neurovaskuläre Erkrankungen antreiben, und liefert durch die Verfolgung einzelner Tiere im Laufe der Zeit Daten, die leichter auf menschliche Krankheiten übertragen werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Nagetier Retina wurde lange als eine zugängliche Fenster zum Gehirn erkannt. In diesem Fachbeitrag stellen wir ein Protokoll, das die Maus-Modell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie, die Mechanismen, die zum Versagen der vaskulären Regeneration im zentralen Nervensystem nach einem ischämischen Verletzungen führen studieren beschäftigt. Das beschriebene System kann auch genutzt werden, um Strategien zu erkunden, um das Nachwachsen der funktionellen Blutgefäße in der Netzhaut und ZNS zu...

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

Hier präsentieren wir das Maus-Laser-induzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) Protokoll, ein experimentelles Modell, das die vaskulären Kennzeichen der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nachbildet. Einmal gemeistert, kann es zuverlässig und effektiv CNV als Modellsystem induzieren, um verschiedene experimentelle Maßnahmen zu testen.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von hochauflösenden spectral-Domain optische Kohärenztomographie (HR-SD-OCT) Lieferung der Gen-Therapie-Agenten in den subretinalen Raum zu unterstützen, beurteilen seine areal Abdeckung und Photorezeptor Vitalität zu charakterisieren.

Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen

Hier präsentieren wir Ihnen die Nützlichkeit der längs in-Vivo Bildgebung bei der Nachbereitung der morphologischen Veränderungen der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation bei Mäusen.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung und Immunfluoreszenzfärbung von Netzhaut-Flachhalterungen und Analysen von Mäusen. Auch die Verwendung der Fluoresceinfundusangiographie (FFA) bei Mäusewelpen und die Bildverarbeitung werden ausführlich beschrieben.

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Dieser Artikel beschreibt einen gut etablierten und reproduzierbaren Lektin-Färbungsassay für die gesamten Netzhautpräparate und die Protokolle, die für die quantitative Messung von Gefäßparametern erforderlich sind, die bei proliferativen und nicht-proliferativen Retinopathien häufig verändert sind.

Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Hier beschreiben wir eine in vivo bildgebende Technik mittels optischer Kohärenztomographie, um die Diagnose und quantitative Messung der Retinopathie bei Mäusen zu erleichtern.

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Hier stellen wir drei Datenanalyseprotokolle für Fluorescein-Angiographie (FA) und optische Kohärenztomographie (OCT) Bilder in der Studie der Netzhautvenenokklusion (RVO) vor.

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Subretinale Injektionen sind eine unverzichtbare Technik für die präklinische Entwicklung von Therapeutika für Photorezeptor- und RPE-Erkrankungen. Wir beschreiben eine optimierte transsklerale subretinale Injektionstechnik bei Mäusen, die die intraoperativen Erfolgsraten verbessert und Netzhautschäden minimiert.

Optimierte minimal-invasive transsklerale subretinale Injektionstechnik in der Maus

Erfahren Sie ein optimiertes Protokoll für retinale Venenverschlüsse bei Mäusen mit Rose Bengal und Laser-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Untersuchung vaskulärer Verletzungen und Ödeme ohne chirurgischen Eingriff.

Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität

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