Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie ein Protokoll erstellt werden kann, das den physiologischen Zustand von Cyanobakterien mithilfe der Durchflusszytometrie und molekularer Sonden effektiv analysiert. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen zur Zellphysiologie mikrobieller Gemeinschaften zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass ein optimiertes Protokoll mit fluoreszierenden Sonden zwischen den physiologischen Zuständen von Cyanobakterien auf Ebene einzelner Zellen in Echtzeit unterscheiden kann.

David Hartnell, ein Doktorand, der im Cytometrielabor der Bournemouth University arbeitet, wird dieses Verfahren demonstrieren. Bevor Sie das Experiment beginnen, bringen Sie ein leeres Hämolyseröhrchen auf die Probeninjektionssonde an. Klicken Sie auf Entblocken.

Danach Rückwärtsspülung durchführen, um den Reinigungsprozess der Durchflusszytometrie zu starten. Am Ende der Rückwärtsspülung eine neue Hämolyseröhre mit zwei Milliliter ultra-reinem, gefiltertem Wasser auf die Probeninjektionssonde (SIP) laden und die Zeitbegrenzung auf 10 bis 15 Minuten sowie die Fluidikgeschwindigkeit auf schnell einstellen. Anschließend eine neue Datenzelle auswählen und die entsprechenden Schwellenwerte für Fluoreszenz und Lichtstreuung einstellen, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.

Klicken Sie dann auf „Ausführen“. Wenn die Gesamtanzahl der Ereignisse pro Sekunde nicht unterhalb der Herstellerempfehlung liegt, führen Sie zwei Milliliter Dekontaminationslösung zwei Minuten lang im Schnellmodus durch. Wiederholen Sie anschließend die Schritte zum Rückspülen und Spülen mit ultrareinem Wasser.

Um eine primäre M.aeruginosa-Reinkultur vorzubereiten, sterilisieren Sie 98 Milliliter ultra-reines filtriertes Wasser, das mit zwei Millilitern Algenmedium gemischt wurde, in einem 250-Milliliter-Becherglas 20 Minuten lang bei 120 Grad Celsius im Autoklaven. Wenn sich eine Kultur in einer hohen stationären Dichte befindet, dispergieren Sie zwei Milliliter Zellen durch Vortexen und überführen Sie anschließend die Zellen unter die Probeninjektionssonde.

Überprüfen Sie mithilfe der Lichtmikroskopie, ob die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Wählen Sie anschließend im Durchflusszytometrie-Software ein Histogramm aus, um die Daten des Vorwärtsstreulichts aufzuzeichnen, und klicken Sie auf „log“, um die Daten auf der x-Achse in logarithmischer Skalierung anzuzeigen.

Stellen Sie in einer separaten Ausgabe ein weiteres Histogramm mit logarithmischer Achse ein, um die natürliche Fluoreszenz der M.aeruginosa-Zellen aufzuzeichnen. Wählen Sie anschließend eine Lichtquelle aus, die Phycocyanin anregen kann, sowie einen Detektor, der die Emissionen der resultierenden Fluoreszenz filtern kann. Wählen Sie für die Aufzeichnung mit höchster Auflösung die Einstellungen, die der Kerngröße des Zielorganismus am nächsten kommen.

Und stellen Sie eine relativ geringe Fließgeschwindigkeit ein. Stellen Sie vor der Datenaufnahme einen Schwellenwert ein, um Streulicht- und Fluoreszenzsignale auszuschließen, die durch elektronisches Hintergrundrauschen oder Zellprobenrückstände verursacht werden. Wählen Sie anschließend eine neue Datenzelle aus.

Erstellen Sie ein Dichtediagramm mit den Parametern Vorwärts- und Seitwärtsstreuung auf einer logarithmischen Skala, und klicken Sie auf „Ausführen“. Wenden Sie nun das Tor für die Vorwärtslichtstreuung und die natürliche Fluoreszenz auf die Daten von Vorwärts- zu Seitwärtsstreuung an, um Signale mit geringer Streuung auszuschließen und nur die Signale mit höherer relativer Fluoreszenz von Phycocyanin einzubeziehen. Sammeln Sie anschließend Ereignisse, bis die Probe vollständig analysiert ist, und verwenden Sie die Daten zur Bestimmung der anfänglichen Zellanzahl.

Um die Aufnahme des molekularen Sondenmittels durch die Zelle zu optimieren, setzen Sie die Hälfte der zuvor vorbereiteten Monokultur den geeigneten Bedingungen zur Erzeugung einer toten Kontrolle aus. Überprüfen Sie die Variationen im mikroskopischen Milieu der Probe, um den Zelltod der Kultur zu bestätigen. Danach dispergieren Sie die Koloniebildung, wie zuvor gezeigt.

Wählen Sie anschließend einen 488-Nanometer-Laser in Kombination mit einem Detektor aus, der die Fluoreszenz der grünen und orangefarbenen Nukleinsäuresonden erfassen kann. Verwenden Sie außerdem den 640-Nanometer-Laser, um die Phycocyanin-Signale über ihre jeweiligen Detektoren aufzuzeichnen. Legen Sie in einem neuen Datensatz ein Dichtediagramm mit den Parametern Vorwärts- und Seitenstreuung an.

Erstellen Sie anschließend ein Histogramm unter Verwendung des jeweiligen optischen Detektor-Kanals für den molekularen Farbstoff. Ein Histogramm zur Detektion der Phycocyanin-Emissionen und ein weiteres für die Vorwärtsstreuereignisse, jeweils auf einer logarithmischen Skala. Führen Sie die Cyanobakterien-Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen und Inkubationszeiten durch.

Erstellen Sie ein Gate im Forward-Scatter-Histogramm, um nur Ereignisse mit der Zellgröße des Zielorganismus einzuschließen. Wenden Sie dieses anschließend auf den entsprechenden Fluoreszenzsondenkanal an. Erstellen Sie danach im Fluoreszenzsondenkanal ein weiteres einschließendes Software-Gate gegenüber dem höchsten Peak im Histogramm.

Und anschließend die entsprechende positive Probefluoreszenz in das Dichtediagramm eingrenzen. Vergleichen Sie die Anzahl der Fluoreszenzsignale mit der Anzahl der toten Kontrollzellen, wobei der höchste Prozentsatz an zellulärem Nukleinsäureprobenaufnahme ohne unspezifische Färbung zu berücksichtigen ist. Zur Überprüfung der Überlappung von Fluoreszenzinterferenzen durch intrinsische oder unspezifische Zellfärbung wählen Sie die Daten aus einer Mischkultur mit 50 Prozent lebenden und 50 Prozent toten Zellen.

Entfernen Sie außerdem die fluoreszierenden Tore. Wenden Sie Tore an, um nur das Forward-Scatter-Histogramm für die Zellgröße des Zielorganismus im Phycocyanin-Kanal-Histogramm einzuschließen. Trennen Sie die höchsten und niedrigsten Phycocyanin-Signale und kennzeichnen Sie diese jeweils als „lebend“ und „tot“.

Wenden Sie anschließend die Gates getrennt auf die Signale des lebenden und toten Phycocyanins an und notieren Sie beide mittleren Wellenlängen. Um die Empfindlichkeit des Protokolls zu bestimmen, bilden Sie das Verhältnis der mittleren Wellenlängen der positiven Fluoreszenz des toten molekularen Sondensignals und des intrinsischen unspezifischen Signals der lebenden Zellen.

Wählen Sie abschließend das optimierte Protokoll aus, bei dem die größte Menge an toten Zellen angefärbt wurde, ohne dass unspezifische Färbungen auftraten. In diesen Diagrammen sind die repräsentativen Vorwärts- und Seitwärts-Streulichtsignale für die Zellgröße und innere Komplexität einer M.aeruginosa-Batchkultur in der exponentiellen Phase dargestellt. Die Gating-Analyse kann durch die Eingrenzung der Daten zwischen bestimmten Punkten des Vorwärts-Streulichtsignals durchgeführt werden.

Phycocyanin erzeugt ein starkes Signal, wenn es mit einer roten Lichtquelle angeregt wird, was zur weiteren Gating der Populationen von Interesse verwendet werden kann. Anhand des Vorwärtslichtstreu- und der fluoreszierenden Signale können anschließend Daten aus der ursprünglichen Ausgabe herausgefiltert werden, um spezifische Daten zur M.aeruginosa-Probe für die endgültige Zellzählung zu erhalten. Wenn lebende, stärker pigmentierte und tote, schwächer pigmentierte Kontrollen miteinander gemischt werden, wird die abnehmende Verschiebung der Autofluoreszenz deutlich.

Bei Zellen mit beschädigter Membran erzeugen die Nukleinsäure-Sonden ein zusätzliches Signal, das mittels Durchflusszytometrie beobachtet und durch Epifluoreszenzmikroskopie weiter bestätigt werden kann. Die fluoreszenztechnische Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen nimmt im Bereich von 0,05 bis 0,5 Mikromolar mit der Zeit zu, nimmt jedoch im Bereich von 1 bis 100 Mikromolar für beide Sonden ab. Tatsächlich scheint die optimale Konzentration für die grüne Nukleinsäure-Sonde 0,5 Mikromolar bei einer Inkubationszeit von 30 Minuten zu betragen.

Für die orangefarbene Nukleinsäuresonde beträgt die optimale Konzentration ein Mikromolar bei einer Inkubationszeit von 10 Minuten. Wenn man einmal Erfahrung gesammelt hat, kann die Optimierung für jede molekulare Sonde innerhalb eines Tages abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Sonden in einem stabilen Umfeld unter den geeigneten Bedingungen bezüglich Temperatur, pH-Wert und Licht zu lagern.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Mikrobiologie die Gemeinschaftsheterogenität bei Phytoplankton untersuchen konnten. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein optimales Protokoll zur Beurteilung der zellulären Physiologie unter Verwendung der Durchflusszytometrie und molekularer Sonden entwickelt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit molekularen Sonden und toxischen Organismen äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, beispielsweise das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (P.P.E.) sowie die vollständige Kenntnis der COSHH-Materialien, während Sie dieses Verfahren durchführen.