Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen ( Microcystis aeruginosa) Mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie ein Protokoll erstellt werden kann, das den physiologischen Zustand der Cyanobakterien mithilfe von Durchflusszytometrie und molekularen Sonden effektiv analysieren kann. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Zellphysiologie mikrobieller Gemeinschaften zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass ein optimiertes Fluoreszenzsondenprotokoll in Echtzeit zwischen den physiologischen Zuständen von Cyanobakterien auf der Ebene einzelner Zellen unterscheiden kann.

Dieses Verfahren wird von David Hartnell, einem Doktoranden, der im Zytometrielabor der Bournemouth University arbeitet, demonstriert. Legen Sie vor Beginn des Experiments ein leeres Hämolyseröhrchen auf die Probeninjektionssonde. Klicken Sie auf Verstopfung entfernen.

Und dann eine Rückspülung, um den Reinigungsprozess der Durchflusszytometrie zu starten. Laden Sie am Ende der Rückspülung ein neues Hämolyseröhrchen mit zwei Millilitern ultrareinem gefiltertem Wasser auf die Probeninjektionssonde (SIP) und stellen Sie das Zeitlimit auf 10 bis 15 Minuten und die Fluidikgeschwindigkeit auf schnell ein. Wählen Sie als Nächstes eine neue Datenzelle aus, und legen Sie die relevanten Fluoreszenz- und Lichtstreuschwellen fest, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.

Klicken Sie dann auf Ausführen. Wenn die Gesamtereignisse pro Sekunde nicht geringer sind als die vom Hersteller empfohlen, lassen Sie zwei Milliliter Dekontaminationslösung zwei Minuten lang schnell laufen. Wiederholen Sie die Schritte Rückspülung und Reinstwasserspülung.

Zur Herstellung einer primären M.aeruginosa-Monokultur werden 98 Milliliter hochreines gefiltertes Wasser, gemischt mit zwei Millilitern Algenmedium, in einem 250-Milliliter-Becherglas für 20 Minuten bei 120 Grad Celsius autoklaviert. Wenn sich eine Kultur in einer hohen stationären Dichte befindet, disaggregieren Sie zwei Milliliter Zellen durch Vortexen. Übertragen Sie dann die Zellen unter die Probeninjektionssonde.

Bestätigen Sie durch Lichtmikroskopie, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Wählen Sie dann ein Histogrammdiagramm in der Durchflusszytometer-Software aus, um die Vorwärtslichtstreudaten aufzuzeichnen. Klicken Sie auf Logarithmus, um die Daten in einer logarithmischen Skala auf der X-Achse anzuzeigen.

Legen Sie in einer separaten Ausgabe ein weiteres logarithmisches Achsenhistogramm fest, um die natürliche Fluoreszenz der M.aeruginosa-Zellen aufzuzeichnen. Wählen Sie als Nächstes eine Lichtquelle aus, die Phycocyanin anregen kann, und einen Detektor, der die Emissionen der resultierenden Fluoreszenz filtern kann. Für die Aufzeichnung mit der höchsten Auflösung wählen Sie die Einstellungen, die der Kerngröße des Zielorganismus am nächsten kommen.

Und stellen Sie eine relativ langsame Durchflussmenge ein. Legen Sie vor der Datenerfassung einen Schwellenwert fest, um Lichtstreu- und Fluoreszenzsignale auszublenden, die durch elektronisches Hintergrundrauschen oder Zellprobenrückstände verursacht werden. Wählen Sie dann eine neue Datenzelle aus.

Erstellen Sie ein Dichtediagramm mit Vorwärts- und Seitenstreuungsparametern auf einer logarithmischen Skala, und klicken Sie auf Ausführen. Wenden Sie nun das Forward Light Scatter und das Natural Fluorescence Gate auf die Forward by Side Scatter-Daten an, um alle Streusignale mit niedrigem Pegel auszuschließen und nur die höheren relativen Fluoreszenz-Phycocyanin-Signale einzubeziehen. Erfassen Sie dann Ereignisse, bis die Stichprobe abgeschlossen ist, und verwenden Sie die Daten, um die anfängliche Zellzahl zu bestimmen.

Um die Aufnahme der molekularen Sondenzellen zu optimieren, wird die Hälfte der zuvor vorbereiteten Monokultur den geeigneten Bedingungen für die Erzeugung einer Totkontrolle ausgesetzt. Überprüfen Sie die Schwankungen in der Mikroumgebung der Probe, um den Tod der Kultur zu bestätigen. Und dann disaggregieren Sie die Kolonieformation, wie gerade gezeigt.

Wählen Sie als Nächstes einen 488-Nanometer-Laser neben einem Detektor aus, der die Fluoreszenz der grünen und orangefarbenen Nukleinsäuresonden aufzeichnen kann. Und der 640-Nanometer-Laser, um die Phycocyanin-Signale durch ihre jeweiligen Detektoren aufzuzeichnen. Richten Sie in einem neuen Datenblatt ein Dichtediagramm mit Vorwärts- und Seitenstreuungsparametern ein.

Erstellen Sie dann ein Histogramm mit dem entsprechenden optischen Detektorkanal der Molekularsonde. Ein Histogramm zum Nachweis der Phycocyanin-Emissionen und ein Histogramm für Vorwärtsstreuereignisse, alle auf einer logarithmischen Skala. Führen Sie die Cyanobakterienproben mit unterschiedlichen Konzentrationen und Inkubationszeiten durch.

Erstellen Sie ein Gate im Forward-Scatter-Histogramm, um nur Ereignisse mit der Zellgröße des Zielorganismus einzuschließen. Und wenden Sie es auf den entsprechenden Fluoreszenzsondenkanal an. Erstellen Sie als Nächstes im Fluoreszenzsondenkanal ein weiteres inklusives Software-Gate gegen den höchsten Peak im Histogramm.

Anschließend wird die entsprechende positive Sondenfluoreszenz auf das Dichtediagramm übertragen. Vergleichen Sie die Anzahl der Fluoreszenzsignale mit der Anzahl der toten Kontrollzellen, wobei der höchste Prozentsatz der Zellnukleinsondenaufnahme keine unspezifische Färbung erzeugt. Um die Überlappung der Fluoreszenzinterferenz durch intrinsische oder unspezifische Zellfärbung zu testen, wählen Sie die 50 Prozent lebenden und 50 Prozent toten Mischkulturdaten aus.

Und entfernen Sie die fluoreszierenden Gates. Wenden Sie Gates an, um nur das Vorwärtsstreuhistogramm für die Zellgröße des Zielorganismus in das Histogramm des Phycocyaninkanals aufzunehmen. Die höchsten und niedrigsten Phycocyanin-Peaks werden abgegrenzt und als lebend bzw. tot bezeichnet.

Wenden Sie dann die Gates separat an die lebenden und toten Phycocyanin-Signale an. Und zeichnen Sie beide mittleren Wellenlängen auf. Um die Empfindlichkeit des Protokolls zu bestimmen, setzen Sie das Verhältnis zwischen den mittleren Wellenlängen der positiven Fluoreszenz der toten molekularen Sonde und des intrinsischen unspezifischen Live-Signals her.

Wählen Sie schließlich das optimierte Protokoll aus, bei dem die höchste Menge an toten Zellen gefärbt wurde, ohne dass eine unspezifische Färbung auftritt. In diesen Diagrammen sind die repräsentativen Vorwärts- und Seitenlichtstreuausgänge für die Zellgröße und die interne Komplexität einer M.aeruginosa-Batch-Kultur in der exponentiellen Phase dargestellt. Das Gating kann durchgeführt werden, indem die Daten zwischen bestimmten Punkten der vorderen Lichtstreuleistung verfeinert werden.

Phycocyanin erzeugt ein starkes Signal, wenn es von einer roten Lichtquelle abgefragt wird, das verwendet werden kann, um die interessierenden Populationen weiter abzugrenzen. Von den Vorwärtslichtstreu- und Fluoreszenzsignalen können die Daten dann von der ursprünglichen Ausgabe zu spezifischen Daten auf der M.aeruginosa-Probe für die endgültige Zellzählung gegated werden. Wenn lebende höher pigmentierte und tote niedriger pigmentierte Kontrollen gemischt werden, wird die abnehmende Verschiebung der Autofluoreszenz deutlich.

In membrankompromittierten Zellen erzeugen die Nukleinsäuresonden ein zusätzliches Signal, das durch die Durchflusszytometrie beobachtet und durch die Epifluoreszenzmikroskopie weiter bestätigt werden kann. Die Fluoreszenzunterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen nimmt mit der Zeit zwischen 0,05 und 0,5 mikromolaren Konzentrationen zu, nimmt jedoch zwischen der ein- und 100-mikromolaren Konzentration für beide Sonden ab. Tatsächlich scheint die optimale Konzentration für die grüne Nukleinsäuresonde 0,5 Mikromolare bei einer Inkubationszeit von 30 Minuten zu betragen.

Für die orangefarbene Nukleinsäuresonde beträgt die optimale Konzentration einen Mikromolaren für eine 10-minütige Inkubation. Einmal gemeistert, kann die Optimierung für jede molekulare Sonde an einem Tag abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Sonden in einer stabilen Umgebung unter den richtigen Temperatur-, pH- und Lichtbedingungen aufzubewahren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg, die Heterogenität von Lebensgemeinschaften im Phytoplankton zu erforschen. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein optimales Protokoll zur Beurteilung der Zellphysiologie mithilfe von Durchflusszytometrie und molekularen Sonden entwickeln können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit molekularen Sonden und giftigen Organismen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen des entsprechenden P.P.E. und das vollständige Verständnis der COSHH-Materialien getroffen werden sollten.