Name: Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen ( Microcystis aeruginosa) Mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit optimierten molekularen Sonden und Durchflusszytometrie die Zellmortalität in Cyanobakterien wie Microcystis aeruginosa präzise bestimmen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalysen einzelner Zellen.

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Die Autoren möchten Doktorand Dave Hartnell und Bournemouth University für die Unterstützung und Finanzierung für die Forschung und Einrichtungen anzuerkennen.

1. Vorbereitung der Molecular Probe und Durchflusszytometer <ol><li> Verdünnte Lösungen der Nukleinsäure-Sonden, die als eine 5 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) geliefert werden Aliquots der erforderlichen Konzentrationen in ultrareinem H 2 O. gefilterten </li><li> Bewahren Sie die Nukleinsäuresonden in dunkler Umgebung zwischen -5 ° C und - 25 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Schalten Sie das Durchflusszytometer und Last-Software-Paket (siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für die FCM-Spezifikationen). </li><li> Stellen Sie eine leere Hämolyse Rohr (12 x 75 mm) an der Probeninjektionssonde (SIP), klicken Sie auf Sprünge zu helfen und dann wieder bündig mit der FCM Reinigungsprozess zu starten. ANMERKUNG: Manche Probe Stufen für die SIP können verschiedene Arten von Rohren einschließlich Mikrozentrifugenröhrchen unterzubringen. Die in der FCM Vorrichtung verwendet molekulare Sonde Verdünnungsmittel und Mantelflüssigkeit ist von einer Qualität zur Analyse der &quot;Typ 1&quot; 0,22 um Membran filtriert Quelle. </li><li> Ortein frischer Hämolyse Rohr mit 2 ml Reinstwasser gefiltert H 2 O auf dem SIP, eine Frist für 10-15 min und einem fluidischen Geschwindigkeit zu schnell (oder einer Flussrate von&gt; 66 &amp; mgr; l / min). </li><li> Wählen Sie eine neue Datenzelle, zu relevanten Schwellenwerte für Fluoreszenz und Lichtstreuung Kanäle, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren, und klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot; setzen. </li><li> Wenn die Gesamt Ereignisse pro Sekunde sind nicht unter Empfehlung der Hersteller, dann eine 2 ml Probe des Dekontaminationslösung für 2 Minuten auf schnelle und wiederholen Sie die Schritte 1.4 und 1.5. HINWEIS: Überprüfen Sie bitte die Herstellerempfehlungen für die FCM-Start-up-Reinigungsprotokolle, wie sie zwischen den Modellen variieren. Tests für bestimmte Grenzwerte muss auch im Einklang mit der FCM-Modell sein, da einige Geräte ermöglicht es dem Benutzer, Spannungen gewinnt den Photomultipliern (PMTs) die Verstärkung oder Verringerung des elektrischen Signals von den optischen Detektoren verbucht worden sind. Die in dieser Erfah verwendet FCM Modellment hat Spannung PMTs fixiert und verwendet einen Schwellenwert von 80.000 Vorwärtslichtstreuung (FSC-H), um Teilchen, die kleiner als 2,0 um und elektronisches Rauschen aus. </li></ol> 2. Herstellung von Kulturen und erste Zellzahlen <ol><li> Autoklav 98 ml Reinstwasser filtriert H 2 O und 2 ml Algenmedium (x50-Konzentration) in einem 250 ml Becherglas während 20 Minuten bei 120 o C. </li><li> Von einer anfänglichen Monokultur von Microcystis aeruginosa (PCC 7806) in einer hohen stabilen Zustand Dichte Platz 2 ml der Probe in ein Rohr unter dem SIP. Disaggregieren keine Koloniebildung durch Vortexen oder Ultraschallbehandlung 20 und bestätigen gleichmäßig verteilt Zellen durch Lichtmikroskopie. HINWEIS: Übermäßige Exposition gegenüber Ultraschallwellen, um Zelllyse führen und sollte mit Vorsicht angewendet werden. Da Ultraschallbehandlung können Gasbläschen kollabieren Ausgänge wie Seitenlichtstreuung (wie in Arten wie Microcystis aeruginosa gefunden) (SSC-H) Intensität mehr an sich gewordennsitive. </li><li> Innerhalb der FCM-Software, wählen Sie ein Histogramm, um Daten von Vorwärtslichtstreuung (FSC-H) aufzeichnen und die Handlung Spezifikationen konfigurieren, indem Sie &quot;log&quot;, um in einer logarithmischen Skala auf der Achse anzuzeigen. </li><li> In einem separaten Ausgang, wählen Sie ein anderes Histogramm (Log-Achse), um natürliche Fluoreszenz aufzunehmen, wie die Zubehörphotosynthetischen Pigment Phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12,5 nm), in Microcystis aeruginosa gefunden. </li><li> Verwenden einer Lichtquelle, Phycocyanin und einen Detektor, der die Emissionen aus dem erhaltenen Fluoreszenzfilter kann anregen kann. HINWEIS: Photosynthesepigment wie Chlorophyll angeregt mit dem häufig verwendeten 488 nm blauen Laser sein, während Phycocyanin ist mehr als 600 nm angeregt und wird nur mit einer roten Lichtquelle 21 festgestellt werden. Überprüfung mit dem Durchflusszytometer Hersteller für Anregungslichtquellen und den Spektren der Emissionsdetektoren, hier sowohl einer 488 nm und 640 nm-Laser verwendet wurden zusammen mitein 675 ± 12,5 nm optischer Filter. </li><li> Für die Aufnahme der Einstellungen in der Nähe des Kerngröße des Zielorganismus (10 &amp; mgr; m) und einer relativ geringen Durchflussrate (14 &amp; mgr; l / min) höchste Auflösung wählen. HINWEIS: Für die beste Auflösung Proben sollten nach fertigt Empfehlung von Ereignissen pro Sekunde ausgeführt werden. </li><li> Vor der Datenerfassung mit einem Schwellenwert zu Tor aus Lichtstreuung und / oder Fluoreszenz-Signale, die durch die elektronische Hintergrundrauschen oder Zellprobe Schmutz verursacht werden. </li><li> Wählen Sie eine neue Datenzelle, erstellen eine Dichte Grundstück mit FSC-H und SSC-H-Parameter auf einer logarithmischen Skala und auf Ausführen. </li><li> Wenn Probendichte führt zu einer übermäßigen Ereignisrate, kann Verdünnungsschritte unternommen, um Genauigkeit und Präzision zu erhöhen. </li><li> Von der Dichte Grundstück gelten Software-Toren aus dem vorherigen Histogramm auf den niedrigen Pegel Streusignale, die von Hintergrundrauschen oder Schmutz (FSC &lt;320.000) hergestellt auszuschließen. Umgekehrt Gate die höhere relative FluoreszenzPhycocyanin Signale von Zellen und enthalten nur diese Ereignisse (FL4, 56.000 - 1.950.000). </li><li> Verwenden Sie die Zahl der Zellen in den gated Bereichen erfasst und teilen sie durch das Gesamtvolumen der Probe, die durch die FCM durchlaufen hat, um herauszufinden, wie viele Zellen pro ml. HINWEIS: Der FCM Modell verwendet hat hier eine Mikroprozessor gesteuerte Schlauchpumpe System, das Probenvolumen zu bestimmen. Andere FCM Geräte erfordern einen kalibrierten Partikelsuspension oder eine Berechnung von H 2 O Gewicht / Volumen Unterschiede zum gesamten Probenvolumen zu überprüfen. </li><li> Hinzufügen der erforderlichen Menge von Zellen, die frisch hergestellt Medien, um eine Batch-Wachstumszyklus (250.000 Zellen / ml) von Microcystis aeruginosa starten. HINWEIS: Arten werden in den Wachstumsraten je nach ihrem In-situ-Umgebungsparameter und die Verfügbarkeit von Nährstoffen, so dass ein Batch-Zyklus sollte vorher aufgezeichnet, um Lebenszyklusphasen zu bestimmen abweichen. </li></ol> 3. Optimsierung von Molecular Probe Zellaufnahme <ol><li> Ernte Hälfte des Microcystis aeruginosa Kultur in Schritt 2 aus einer exponentiellen Phase vorbereitet und verwenden als &quot;live&quot; Kontrolle. HINWEIS: Die Proben aus einer hohen Dichte Kultur direkt zu einer exponentiellen Phase verdünnt kann Optimierungsergebnisse durch tote Zelle Umsatz auswirken, im Vergleich zu der Kulturen von einem Anfangsverzögerung / Induktionsphase beimpft. </li><li> Bereiten Sie die andere Hälfte als &quot;tot&quot; Steuerung durch Verwendung von Verfahren, wie beispielsweise 70% Ethanol, Erhitzen von Proben bei 60 ° C für 1 Stunde, Paraformaldehyd oder 4% Formaldehyd für 30 Minuten 6,11,22. Überprüfen Variationen in der Proben-Mikroumgebung (z. B. pH). HINWEIS: Die positive, durch Hitze abgetöteten, &quot;tot&quot; Kontrolle in Microcystis aeruginosa unterscheidet sich von einer &quot;Live&quot; Probe durch seine Abnahme Phycocyanin Signale. Induziert Mortalität durch andere Verfahren nicht dazu führen, die gleiche Leistung und wird vary in Arten. </li><li> Up Mischproben mit unterschiedlichen Verhältnissen von Set &quot;Live&quot; und &quot;tot&quot; Proben (zB 0%, 25%, 50%, 100%). </li><li> Disaggregieren Koloniebildung durch Vortexen oder Ultraschallbehandlung und pH-Wert prüfen. </li><li> Wählen Sie einen 488-nm-Laser zusammen mit Detektoren, die Fluoreszenz von der grünen aufzeichnen kann (FL1, 530 ± 15 nm) und orange (FL2, 585 ± 20 nm) Nukleinsäuresonden und die 640-nm-Laser, um Phycocyanin Signale durch ihre jeweiligen Detektor aufzeichnen. HINWEIS: Wenn an DNA gebunden ist, hat der grüne Nucleinsäuresonde eine ungefähre Fluoreszenzanregungswellenlänge von 504 nm und Emissionsmaxima von 523 nm, während die orange Nukleinsäuresonde weist eine Anregungswellenlänge von 547 nm und Emissionsmaxima von 570 nm. A 488 nm Argonionen-Festkörperlaser eingesetzt werden, um beide Molekülsonden erregt werden jedoch ein grüner Laser (bis 547 nm) eine höhere Orangefluoreszenz zu produzieren. </li><li> Als Ausgangspunkt, stellen diemolekulare Sonde mit den Herstellern empfohlenen Konzentration auf die 50% &quot;live&quot; und 50% &quot;tot&quot; Kultur und Inkubation im Dunkeln. </li><li> Wählen Sie eine neue Datenzelle, legen Sie die Probe unter dem SIP mit Schwellen und Trigger, die Hintergrundgeräusche (FSC-H 80.000) reduzieren wird. </li><li> Erstellen Sie eine Dichte Grundstück mit FSC-H und SSC-H-Parameter, und drei Histogramme. Ein Histogramm unter Verwendung der jeweiligen molekularen Sonde optischen Detektorkanal (FL1 oder 2), eine zur Erkennung Phycocyanin Emissionen (FL4-H) und das andere FSC-H, die alle auf einer logarithmischen Skala. </li><li> Die Proben der Microcystis aeruginosa mit Nukleinsäuresonden im Dunkeln inkubieren für bis zu 60 min, Aufzeichnung in getrennten Datenzellen bei einer Anzahl von Zeitpunkten (1, 5, 10, 15, 30 und 60 min). HINWEIS: Bei der Einstellung von Parametern wie pH-Check mit fertigt für mögliche Reaktionen von bestimmten Chemikalien (für die getesteten Nukleinsäure-Sonden ein Puffer kann nicht Phosphate oder hohen ein- oder diva enthaltenlieh Kationen, da die Bindung an DNA wird reduziert). </li><li> Tragen Sie eine Software-Tor, nur sind die FSC-H-Histogramm (320.000 - 1.500.000) für die Zielorganismen Zellgröße, in die jeweilige Fluoreszenzsonde Kanal-Histogramm. ANMERKUNG: Die in diesem Protokoll verwendeten Konzentrationen waren 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 um, was entweder durch Erhöhen oder Verringern des Volumens Microcystis aeruginosa Probe oder anfängliche Stammlösung von Nukleinsäure-Sonden geändert werden können. </li><li> In der Fluoreszenzsonde Kanal, gelten andere inclusive Software-Tor auf den höchsten Gipfel im Histogramm (grüne FL1-H, 240.000 - 1.650.000, orange FL2-H, 30.000 - 165.000) und in der Folge, dass positive Gate-Sonde Fluoreszenz in den Density-Plot. </li><li> Lauf Schritte 3,1-3,11 bei 100% &quot;live&quot; 100% &quot;tot&quot; und alle Mischkulturproben, Einstellung des Molekularsondenkonzentrationen (zB x 0,1 x 10) und / oder der Temperatur und pH-Werte, falls notwendig. </li> &lt;li&gt; Vergleichen Sie die Anzahl der positiven molekularen Sonde Fluoreszenzsignale in die ursprüngliche Zelldichte von &quot;toten&quot; Zellen (von einem halben Gesamt FSC-H oder einer 100% &quot;tot&quot; Kultur genommen), um den Gesamtanteil der Zellen mit der Nukleinsäure befleckt finden Sonden. </li><li> Tun Sie dies für jeden Zeitraum innerhalb jeder Konzentration, um die optimale Protokoll für den höchsten Prozentsatz der Zell Nukleinsonde Aufnahme, ohne nicht-spezifische Färbung (verwenden Sie die Mittel in einem One-Way ANOVA oder Kruskal-Wallis-Test zu finden, wenn die Daten nicht-para). </li></ol> 4. Molecular Probe Fluoreszenz Diskriminierung <ol><li> Für die Prüfung von Fluoreszenzinterferenz / Überlappung von intrinsischen oder nicht-spezifische Zellfärbung wählen Sie die 50% &quot;live&quot; und 50% &quot;tot&quot; Mischkultur Daten und nehmen Sie alle Tore. </li><li> Tragen Sie eine Software-Tor, nur sind die FSC-H-Histogramm (320.000 - 1.500.000) für die Zielorganismen Zellgröße, in die PhycocyaninKanal-Histogramm. </li><li> Tor der höchste Gipfel Phycocyanin und Label als &quot;live&quot;, mit dem Zusatz von der untersten Spitze als &quot;tot&quot; bezeichnet. </li><li> Führen Sie eine weitere Gate-Schritt in die jeweilige molekulare Sonde Fluoreszenzhistogramm-Kanal, mit ein zu einer Zeit, die &quot;live&quot; und dann &quot;tot&quot; Phycocyanin (FL4) Signale, die Aufnahme sowohl mittlere Wellenlängen. HINWEIS: Der Modus zur Induktion der Mortalität in diesem Experiment wurde durch Wärmebehandlung, die sich aus diesem Protokoll Phycocyanin Signale deutlich verringert wurde. Andere Verfahren zur Herstellung von Populationen von &quot;toten&quot; Zellen können verschiedene Ausgänge in den erworbenen Läufe ergeben. </li><li> Verhältnis die mittleren Wellenlängen der positiven molekularen Sonde Fluoreszenz (&quot;tot&quot;) und die Eigen / nicht-spezifische Signal (&quot;Live&quot;), um Protokoll Empfindlichkeit zu bestimmen. HINWEIS: Um die Fluoreszenz Diskriminierung &quot;live&quot; und &quot;tot&quot; popul verbesserntionen, erhöhen Sie die Kohlenstoffquelle zur aktiven Fleck-Aufnahme in Nährstoff erschöpft Zellen oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zellwanddurchlässigkeit und resultierenden Fluoreszenzsignale 6 zu verbessern. Begrenzte Entschädigung in einigen FCM Modelle für spektrale Überlappung kann durch benutzer manipuliert paarweisen Korrektur während der Probennahme (PMT Spannungsänderungen) oder von post-analytische Spezialsoftware durchgeführt werden. </li><li> Wählen Sie das optimiertes Protokoll, wo die höchste Menge an &quot;toten&quot; Zellen hat, ohne dass es eine unspezifische Färbung gefärbt worden. Wenn eine Anzahl von Tests haben ähnliche Ergebnisse zu akzeptieren das Protokoll mit der niedrigsten Konzentration und Inkubationszeit, zusammen mit guten Fluoreszenzsignal Diskriminierung. Folgen produziert Anweisungen für die Zytometer Herunterfahren. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die erhöhte Anzahl von Publikationen mit molekularen Sonden zeigt an, dass verlässliche und aussagekräftige Daten erhalten 5,6,8 werden - 15,19,22,23. Als der noch gibt es keine perfekte Färbung für die Lebensfähigkeit der Zellen, die wirksam sein kann für alle Arten mit der gleichen Konzentration und Inkubationszeit 6,10. Sogar die gleiche Art von Sonden mit veränderten Fluoreszenzemissionen zeigt die Notwendigkeit, die richtige Konzentration und Inkubationszeit (Tabe...

Die Zelle ist ein komplexes System, das ständig reagiert auf die Umwelt durch die Beeinflussung der physiologischen Parameter und ihre Funktion zu verändern. Die Populationsdynamik von isogenen mikrobiellen Populationen sowohl in der Natur und das Labor werden durch die Entwicklung von Unterpopulationen betroffen sind, auftreten, auch unter relativ konstanten Umgebungsbedingungen 1-3. Die Variabilität der natürlichen mikrobiellen entsteht durch die hohe Variabilität der Umweltbedingungen. Diese manchmal stochastische Prozesse anschließend produzieren Subpopulationen, die sehr unterschiedlich zu dem Bevölkerungsdurchschnitt liegen. Neuere Erkenntnisse haben ergeben, dass diese physiologischen Subpopulationen reagieren unterschiedlich auf Umweltbedingungen und können Signalverbindungen oder Inhibitoren, die dramatisch beeinflussen und beeinflussen die Gesamtbevölkerung 3,4 herzustellen. Die Schaffung eines Verfahrens zur Heterogenität innerhalb einer Population zu definieren ist der Schlüssel zu unständnis der Ökologie von Mikroben in verschiedenen Umgebungen und ist von wesentlicher Bedeutung bei der Erstellung Kenntnisse Ärgernis Cyanobakterien, wie die giftigen Microcystis, die Auswirkungen stark auf menschliche Sicherheit der Wasserversorgung. Arten wie Anabaena morphologische Heterogenität als Reaktion auf Umweltveränderungen angezeigt, die Entwicklung von spezialisierten Zellen wie Heterocysten und Akineten 2. Im Gegensatz dazu Microcystis Zellen nicht klar, morphologische Heterogenität während einer Stressreaktion anzuzeigen. Die Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Zellen ist der wichtigste Aspekt der physiologischen Differenzierung und ermöglicht ein besseres Verständnis der mikrobiellen Populationsdynamik. Die konzeptionelle Problem der bakteriellen Lebensfähigkeit selbst bleibt jedoch schwierig und schlecht gekennzeichnet 1,5,6. Durchflusszytometrie (FCM) ist ein sicheres und schnelles Verfahren zur Analyse von Einzelzellen. Um das Verständnis der einzelnen Zelle physio erhöhenlogy durch FCM, molekularen Sonden sind verwendet worden, um eine Anzahl von metabolischen und biochemischen Prozessen 7 unterscheiden. Dies hat zu mehr Wissen von Arten auf zellulärer und Bevölkerungsebene geführt und im Gegenzug geholfen Wasserressourcenmanagement 8,9. Jedoch unterscheiden sich Organismen hinsichtlich der molekularen Sonde Aufnahme und Ausströmen durch die Poren und die Pumpen in Zellwänden und Membranen, die zu einer Reihe von molekularen Sonde Design und Protokollimplementierung 6,10,11 geführt. Molekularsonden für kommerzielle und Forschungszwecke verfügbar sind oft mit einer generisches Protokoll, die zu einem ganz anderen Zelltyp anwendbar sein kann, geliefert. Man muss sehr vorsichtig beim Übertragen von Protokollen für einen Zelltyp entwickelt, um weitere 6 sein kann, ist es daher eine wesentliche Aufgabe der molekularen Sonden effektiv vor der Verwendung zu optimieren. Die grüne und orange Nukleinsäuresonden sowohl Doppel-und Einzel Nukleinsäuren mit minimalen Basis binden wählenivität und werden verwendet, um die Plasmamembranintegrität von Zellen zu beurteilen. Die grüne Nukleinsäuresonde eine deutlich verbesserte Zellmarkierung Fluoreszenzsignal im Vergleich zu anderen molekularen Sonden wie Propidiumiodid basierenden Verbindungen 12, die auch als ein Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen wirken kann. Der Ausdruck &quot;die Lebensfähigkeit der Zellen&quot; hier davon aus, dass DNA-Abbau nach dem Verlust der Plasmamembranintegrität auftritt. Die Nucleinsäuresonden sind unsymmetrische Cyaninfarbstoffe mit drei positive Ladungen und können nicht in Zellen mit intakten Membranen unter gekennzeichnet Konzentrationen sowohl eukaryotische als auch prokaryotische 14,15 11,13 Organismen. Der Bindung einer Nukleinsäure-Sonde an Nukleinsäuren in der bis zu einer&gt; 500 fachen Zunahme der Fluoreszenz-Emissionen von endogenen Signalen in Zellen, die ihre Membranintegrität beeinträchtigt haben ergeben. Obwohl molekulare Sonden wie das grün Nucleinsäuresonde kann ein guter Indikator für die einzelne Zellphysiologie zu sein, gibt es einen Bedarf to optimieren jede Sonde mit der beabsichtigten Zielorganismus, wie Inkubationszeiten wurden von 7 min variiert - 30 Minuten und die Konzentration im Bereich von 0,1 &amp; mgr; M - 0,5 &amp; mgr; M in Microcystis Experimente allein 15-19. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die zytometrische Assays von Grün und die relativ neu orange Nukleinsäuresonden (die bisher nicht von den Cyanobakterien Spezies Microcystis aeruginosa getestet) zu optimieren. Folgendes entwickelten Methodik kann dann auf andere Spezies übertragen und als eine Plattform für die Optimierung der Protokolle in anderen molekularen Sonden, wodurch das Verständnis der Mikroben und deren ökologische Verhalten Erhöhung verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Cyanobacteria Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500ML</td><td>BG-11 Konzentrierte Süßwasserlösung (50x Verdünnung)</td></tr><tr><td>Dekontaminationsflüssigkeit</td><td>BD Biosciences</td><td>653155</td><td>Laufen Sie 2 Minuten lang, wenn die Ausgänge mehr als 12 Ereignisse pro Sekunde bei schnell oder einer Durchflussrate von 66 & Mikro betragen; l/min.&nbsp; Gefolgt von 2 min Hülle H2O.</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>auf Anfrage</td><td>BD Accuri C6</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>Nukleinsäurefärbung &ndash; 5 mM Lösung in DMSO</td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S11368</td><td>Nukleinsäurefärbung &ndash; 5 mM Lösung in DMSO</td></tr></tbody></table>

molecular probe-optimierung, um zellmortalität in einem photosynthetische organismen bestimmen (<em&gt; microcystis aeruginosa</em&gt;) mittels durchflusszytometrie

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

Mikrobielle Subpopulationen in Feld- und Laborstudien haben gezeigt, dass hohe Heterogenität in der morphologischen und physiologischen Parametern. Bestimmen der Echtzeitzustand einer mikrobiellen Zelle geht über lebenden oder toten Kategorien, wie Mikroben in einem Ruhezustand, wobei die Zellteilung und metabolische Aktivität vermindert existieren. Da es notwendig ist für die Detektion und Quantifizierung von Mikroorganismen, Durchflusszytometrie (FCM) mit molekularer Sonden stellt ein schnelles und genaues Verfahren, um festzustellen Gesamtpopulation Lebensfähigkeit. Durch die Verwendung von SYTOX Grüne und orange SYTOX im Modell Cyanobakterien Microcystis aeruginosa, um die Integrität der Membran zu erkennen, entwickeln wir eine übertragbare Methode für die schnelle Anzeige der einzelnen Zelle Sterblichkeit. Die molekulare Sonden in dieser Zeitschrift verwendet wird als grün oder orange Nukleinsäure-Sonden bezeichnet werden (obwohl es auch andere Produkte mit ähnlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen, die eine vergleichbare Formen der actio habenn, die wir ausdrücklich auf die vorderen erwähnten Sonden). Protokolle mit molekularen Sonden variieren zwischen den Arten, die sich hauptsächlich in der Konzentration und Inkubationszeiten. Nach diesem Protokoll auf Microcystis aeruginosa setzen die grüne Nucleinsäuresonde wurde bei Konzentrationen von 0,5 &amp; mgr; M nach 30-minütiger Inkubation und die orange Nucleinsäuresonde bei 1 uM nach 10 min optimiert. In beiden Sonden Konzentrationen von weniger als der angegebenen optimalen Rahmen Berichterstattung von Zellen mit Membranschäden führten zu einem. Umgekehrt, 5 uM Konzentrationen und höher in beiden Proben zeigte eine Art von nicht-spezifischer Färbung, wobei &quot;live&quot; Zellen erzeugt einen Ziel Fluoreszenz, was zu einer überproportionalen Anteil &quot;abgetötet&quot; Zellzahlen. Die positiven Kontrollen (durch Hitze abgetöteten) vorgesehen testbare tote Biomasse, auch wenn die Angemessenheit der Steuerungsgeneration bleibt umstritten. Durch den Nachweis einer logischen Sequenz von Schritten für die Optimierung der grün und orange Nucleinsäuresonden wir demonstrate, wie ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Cyanobakterien physiologischen Zustand effektiv zu analysieren erstellen.

Vorwärtslichtstreuung (FSC) und Seitenlichtstreuung (SSC) Ausgänge von einer Microcystis aeruginosa Batch-Kultur in exponentiellen Phase liefert Informationen über Zellgröße (Durchmesser) und interne Granularität bzw. (Abbildung 1A). FSC können Zellen, die zu groß und / oder klein sein Microcystis aeruginosa sind, diskriminieren. Diese Diskriminierung oder Gating durch Raffination von Daten zwischen bestimmten Punkten eines FSC-Ausgang (1C)</str...

Mikrobenpopulationen enthalten, die wesentliche Zellheterogenität, das allgemeine Verhalten diktieren können. Molekulare Sonde Analyse durch Durchflusszytometrie können physiologische Zustände von Zellen zu bestimmen, aber ihre Anwendung variiert zwischen den Arten. Diese Studie liefert ein Protokoll, um genau zu bestimmen, Zellmortalität innerhalb von einem Cyanobakterium Bevölkerung, ohne zu unterschätzen oder Aufzeichnungs falsch positiven Ergebnissen.

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Mittels Durchflusszytometrie

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie ein Protokoll erstellt werden kann, das den physiologischen Zustand von Cyanobakterien mithilfe der Durchflusszytometrie und molekularer Sonden effektiv analysiert. Dieses Protokoll kann helfen, zentrale Fragen zur Zellphysiologie mikrobieller Gemeinschaften zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass ein optimiertes Protokoll mit fluoreszierenden Sonden zwischen den physiologischen Zuständen von Cyanobakterien auf Ebene einzelner Zellen in Echtzeit unterscheiden kann.David Hartnell, ein Doktorand, der im Cytometrielabor der Bournemouth University arbeitet, wird dieses Verfahren demonstrieren. Bevor Sie das Experiment beginnen, bringen Sie ein leeres Hämolyseröhrchen auf die Probeninjektionssonde an. Klicken Sie auf Entblocken.Danach Rückwärtsspülung durchführen, um den Reinigungsprozess der Durchflusszytometrie zu starten. Am Ende der Rückwärtsspülung eine neue Hämolyseröhre mit zwei Milliliter ultra-reinem, gefiltertem Wasser auf die Probeninjektionssonde (SIP) laden und die Zeitbegrenzung auf 10 bis 15 Minuten sowie die Fluidikgeschwindigkeit auf schnell einstellen. Anschließend eine neue Datenzelle auswählen und die entsprechenden Schwellenwerte für Fluoreszenz und Lichtstreuung einstellen, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.Klicken Sie dann auf „Ausführen“. Wenn die Gesamtanzahl der Ereignisse pro Sekunde nicht unterhalb der Herstellerempfehlung liegt, führen Sie zwei Milliliter Dekontaminationslösung zwei Minuten lang im Schnellmodus durch. Wiederholen Sie anschließend die Schritte zum Rückspülen und Spülen mit ultrareinem Wasser.Um eine primäre M.aeruginosa-Reinkultur vorzubereiten, sterilisieren Sie 98 Milliliter ultra-reines filtriertes Wasser, das mit zwei Millilitern Algenmedium gemischt wurde, in einem 250-Milliliter-Becherglas 20 Minuten lang bei 120 Grad Celsius im Autoklaven. Wenn sich eine Kultur in einer hohen stationären Dichte befindet, dispergieren Sie zwei Milliliter Zellen durch Vortexen und überführen Sie anschließend die Zellen unter die Probeninjektionssonde.Überprüfen Sie mithilfe der Lichtmikroskopie, ob die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Wählen Sie anschließend im Durchflusszytometrie-Software ein Histogramm aus, um die Daten des Vorwärtsstreulichts aufzuzeichnen, und klicken Sie auf „log“, um die Daten auf der x-Achse in logarithmischer Skalierung anzuzeigen.Stellen Sie in einer separaten Ausgabe ein weiteres Histogramm mit logarithmischer Achse ein, um die natürliche Fluoreszenz der M.aeruginosa-Zellen aufzuzeichnen. Wählen Sie anschließend eine Lichtquelle aus, die Phycocyanin anregen kann, sowie einen Detektor, der die Emissionen der resultierenden Fluoreszenz filtern kann. Wählen Sie für die Aufzeichnung mit höchster Auflösung die Einstellungen, die der Kerngröße des Zielorganismus am nächsten kommen.Und stellen Sie eine relativ geringe Fließgeschwindigkeit ein. Stellen Sie vor der Datenaufnahme einen Schwellenwert ein, um Streulicht- und Fluoreszenzsignale auszuschließen, die durch elektronisches Hintergrundrauschen oder Zellprobenrückstände verursacht werden. Wählen Sie anschließend eine neue Datenzelle aus.Erstellen Sie ein Dichtediagramm mit den Parametern Vorwärts- und Seitwärtsstreuung auf einer logarithmischen Skala, und klicken Sie auf „Ausführen“. Wenden Sie nun das Tor für die Vorwärtslichtstreuung und die natürliche Fluoreszenz auf die Daten von Vorwärts- zu Seitwärtsstreuung an, um Signale mit geringer Streuung auszuschließen und nur die Signale mit höherer relativer Fluoreszenz von Phycocyanin einzubeziehen. Sammeln Sie anschließend Ereignisse, bis die Probe vollständig analysiert ist, und verwenden Sie die Daten zur Bestimmung der anfänglichen Zellanzahl.Um die Aufnahme des molekularen Sondenmittels durch die Zelle zu optimieren, setzen Sie die Hälfte der zuvor vorbereiteten Monokultur den geeigneten Bedingungen zur Erzeugung einer toten Kontrolle aus. Überprüfen Sie die Variationen im mikroskopischen Milieu der Probe, um den Zelltod der Kultur zu bestätigen. Danach dispergieren Sie die Koloniebildung, wie zuvor gezeigt. Wählen Sie anschließend einen 488-Nanometer-Laser in Kombination mit einem Detektor aus, der die Fluoreszenz der grünen und orangefarbenen Nukleinsäuresonden erfassen kann. Verwenden Sie außerdem den 640-Nanometer-Laser, um die Phycocyanin-Signale über ihre jeweiligen Detektoren aufzuzeichnen. Legen Sie in einem neuen Datensatz ein Dichtediagramm mit den Parametern Vorwärts- und Seitenstreuung an.Erstellen Sie anschließend ein Histogramm unter Verwendung des jeweiligen optischen Detektor-Kanals für den molekularen Farbstoff. Ein Histogramm zur Detektion der Phycocyanin-Emissionen und ein weiteres für die Vorwärtsstreuereignisse, jeweils auf einer logarithmischen Skala. Führen Sie die Cyanobakterien-Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen und Inkubationszeiten durch.Erstellen Sie ein Gate im Forward-Scatter-Histogramm, um nur Ereignisse mit der Zellgröße des Zielorganismus einzuschließen. Wenden Sie dieses anschließend auf den entsprechenden Fluoreszenzsondenkanal an. Erstellen Sie danach im Fluoreszenzsondenkanal ein weiteres einschließendes Software-Gate gegenüber dem höchsten Peak im Histogramm.Und anschließend die entsprechende positive Probefluoreszenz in das Dichtediagramm eingrenzen. Vergleichen Sie die Anzahl der Fluoreszenzsignale mit der Anzahl der toten Kontrollzellen, wobei der höchste Prozentsatz an zellulärem Nukleinsäureprobenaufnahme ohne unspezifische Färbung zu berücksichtigen ist. Zur Überprüfung der Überlappung von Fluoreszenzinterferenzen durch intrinsische oder unspezifische Zellfärbung wählen Sie die Daten aus einer Mischkultur mit 50 Prozent lebenden und 50 Prozent toten Zellen.Entfernen Sie außerdem die fluoreszierenden Tore. Wenden Sie Tore an, um nur das Forward-Scatter-Histogramm für die Zellgröße des Zielorganismus im Phycocyanin-Kanal-Histogramm einzuschließen. Trennen Sie die höchsten und niedrigsten Phycocyanin-Signale und kennzeichnen Sie diese jeweils als „lebend“ und „tot“.Wenden Sie anschließend die Gates getrennt auf die Signale des lebenden und toten Phycocyanins an und notieren Sie beide mittleren Wellenlängen. Um die Empfindlichkeit des Protokolls zu bestimmen, bilden Sie das Verhältnis der mittleren Wellenlängen der positiven Fluoreszenz des toten molekularen Sondensignals und des intrinsischen unspezifischen Signals der lebenden Zellen.Wählen Sie abschließend das optimierte Protokoll aus, bei dem die größte Menge an toten Zellen angefärbt wurde, ohne dass unspezifische Färbungen auftraten. In diesen Diagrammen sind die repräsentativen Vorwärts- und Seitwärts-Streulichtsignale für die Zellgröße und innere Komplexität einer M.aeruginosa-Batchkultur in der exponentiellen Phase dargestellt. Die Gating-Analyse kann durch die Eingrenzung der Daten zwischen bestimmten Punkten des Vorwärts-Streulichtsignals durchgeführt werden.Phycocyanin erzeugt ein starkes Signal, wenn es mit einer roten Lichtquelle angeregt wird, was zur weiteren Gating der Populationen von Interesse verwendet werden kann. Anhand des Vorwärtslichtstreu- und der fluoreszierenden Signale können anschließend Daten aus der ursprünglichen Ausgabe herausgefiltert werden, um spezifische Daten zur M.aeruginosa-Probe für die endgültige Zellzählung zu erhalten. Wenn lebende, stärker pigmentierte und tote, schwächer pigmentierte Kontrollen miteinander gemischt werden, wird die abnehmende Verschiebung der Autofluoreszenz deutlich.Bei Zellen mit beschädigter Membran erzeugen die Nukleinsäure-Sonden ein zusätzliches Signal, das mittels Durchflusszytometrie beobachtet und durch Epifluoreszenzmikroskopie weiter bestätigt werden kann. Die fluoreszenztechnische Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen nimmt im Bereich von 0,05 bis 0,5 Mikromolar mit der Zeit zu, nimmt jedoch im Bereich von 1 bis 100 Mikromolar für beide Sonden ab. Tatsächlich scheint die optimale Konzentration für die grüne Nukleinsäure-Sonde 0,5 Mikromolar bei einer Inkubationszeit von 30 Minuten zu betragen.Für die orangefarbene Nukleinsäuresonde beträgt die optimale Konzentration ein Mikromolar bei einer Inkubationszeit von 10 Minuten. Wenn man einmal Erfahrung gesammelt hat, kann die Optimierung für jede molekulare Sonde innerhalb eines Tages abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Sonden in einem stabilen Umfeld unter den geeigneten Bedingungen bezüglich Temperatur, pH-Wert und Licht zu lagern.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Mikrobiologie die Gemeinschaftsheterogenität bei Phytoplankton untersuchen konnten. Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein optimales Protokoll zur Beurteilung der zellulären Physiologie unter Verwendung der Durchflusszytometrie und molekularer Sonden entwickelt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit molekularen Sonden und toxischen Organismen äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, beispielsweise das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (P.P.E.) sowie die vollständige Kenntnis der COSHH-Materialien, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Quelle: Chapman, I. J., et al., Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Methode zur Unterscheidung von lebenden und toten Microcystis aeruginosa-Zellen durch die Kombination der Fluoreszenzsondenmarkierung mit der durchflusszytometrischen Analyse der Phycocyanin-Autofluoreszenz und des Sondensignals.

Viabilitätsanalyse von Microcystis aeruginosa mittels Durchflusszytometrie

Dieses Video zeigt einen Durchflusszytometrie-Assay zur Quantifizierung der ROS-Spiegel in 3D-Darmorganoiden, die von GFP-exprimierenden transgenen Mäusen gewonnen wurden. Diese Methode bietet ein experimentelles In-vitro-Modell, um die Wirksamkeit von Testverbindungen auf die ROS-Produktion zu untersuchen.

Durchflusszytometrischer Assay zur Quantifizierung von oxidativem Stress: Ein Assay zur Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies in Darmorganoiden mit fluorogenen Sonden

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Optisch kontrollierte Substanzen sind mächtige Werkzeuge, um Signalwege zu untersuchen. Um das Spektrum der möglichen Experimente zu erweitern, haben wir ein Gerät entwickelt, mit dem sich optisch gesteuerte Substanzen in Echtzeit mittels Durchflusszytometrie untersuchen lassen: die LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Die Kombination mit Optogenetik Flow Cytometry

Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und Zählperlen zur Quantifizierung von Bakteriensporen, die mit Ethidiumbromid markiert sind. Die Methode ist auch effizient, um die kovalente Kopplung von Proteinen auf der Oberfläche intakter Sporen zu analysieren.

Verbesserung der Bacillus subtilis-Sporenzählung und Markierungsanalyse in der Durchflusszytometrie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefeproben vor. Der Assay verwendet zwei Fluoreszenzfarbstoffe, SYTO 9 und Propidiumiodid (PI), um die Integrität der Plasmamembran zu quantifizieren. Es verwendet Durchflusszytometrie, um quantitative und reproduzierbare Schätzungen der lebenden, toten und geschädigten Zellfraktionen für Proben mit postoxidativem Stress zu liefern.

Ein optimierter LIVE/DEAD-Assay in Verbindung mit Durchflusszytometrie zur Quantifizierung des Post-Stress-Überlebens in Hefezellen

Erfahren Sie, wie Sie mit optimierten molekularen Sonden und Durchflusszytometrie die Zellmortalität in Cyanobakterien wie Microcystis aeruginosa präzise bestimmen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalysen einzelner Zellen.

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen ( Microcystis aeruginosa) Mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (

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