Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der mikrobiellen Ökologie und Biotechnologie zu beantworten, z. B. welche ökologischen Konzepte ein bestimmtes Ökosystem antreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um die schnelle Mikrobiomdynamik mit dem kurzen Intervall-Probenahmeregime zu schließen und gleichzeitig sehr kostengünstig zu bleiben. Diese Methode kann verwendet werden, um Informationen über biotechnologische und natürliche mikrobielle Gemeinschaften sowie über tierische und menschliche Mikrobiome für Ernährungs- und Gesundheitszustände zu erhalten.

Verfahren wird von Florian Schattenberg, Techniker und SediMeter-Bediener in unserem Labor, vorgeführt. Um eine Biogasgemeinschaftsprobe zu trocknen, verwenden Sie eine modifizierte Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um 200 Mikroliter des viskosen Gärrests in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit 1,7 Millilitern PBS zu überführen. Legen Sie die Röhrchen nach gründlichem Mischen für eine Minute in ein Ultraschallbad, um alle großen Zellaggregate aufzulösen und an Pflanzenzellresten haftende Zellen zu befestigen.

Nach der Beschallung wird die Probe gründlich gemischt und die Zellen durch ein 50-Mikrometer-Porensieb in ein 2-Milliliter-Kunststoffröhrchen filtriert. Das Filtrat wird in vier 400stel Mikroliter Aliquote aufgeteilt und die Aliquote zweimal zentrifugiert, wobei der Überstand beide Male vollständig verworfen wird, um die Mikrobenprobe so gründlich wie möglich mechanisch zu entwässern. Anschließend trocknet man die Probe in einer beheizten Vakuumzentrifuge, um ein stabiles Pellet zu erhalten, und lagert das Pellet bei vier Grad Celsius lichtgeschützt.

Zur Stabilisierung und Fixierung von Belebtschlammproben zentrifugieren Sie vier Milliliter der Zellen und suspendieren das Pellet in vier Millilitern mit zwei Prozent Formaldehyd in PBS. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die stabilisierte Zellprobe und fixieren das Pellet in vier Millilitern 70 % Ethanol für eine Lagerung bei minus 20 Grad Celsius. Mischen und übertragen Sie 0,6 Milliliter der fixierten Zellsuspension in ein Glasröhrchen mit 1,4 Millilitern PBS und beschallen Sie nach gründlichem Mischen 10 Minuten lang, wie gezeigt.

Am Ende der Beschallung werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in zwei Millilitern frischem PBS wieder suspendiert. Nach gründlichem Mischen beschallen Sie die Zellen wie gerade gezeigt fünf Minuten lang und stellen den OD 700 Nanometer mit frischem PBS auf 035 ein. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Permeabablisierungspuffer, der 0,11 molare Zitronensäure und 4,1 μmolare Tween 20 enthält, unter gründlichem Mischen für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Sammeln Sie dann die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet gründlich in zwei Millilitern Färbelösung mit 0,68 Mikromolar DAPI für eine mindestens 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz. Laden Sie für die Bead-Kalibrierung die Bead-Mischung für die lineare Kalibrierung in das Durchflusszytometer und messen Sie die Beads kontinuierlich, während Sie die Positionen der Düse und der Laseroptik manipulieren, um das Gerät im linearen Bereich vorzukalibrieren. Wenn die Bead-Peaks in eine voreingestellte Kalibrierungsvorlage eingepasst werden können, wechseln Sie in den Log-Modus und laden Sie eine logarithmische Kalibrierungsbead-Probe.

Passen Sie die logarithmischen Bead-Peaks an ihre voreingestellte Kalibrierungsschablone an, um die Hardware des Instruments fein abzustimmen, und verwenden Sie die Verstärkungseinstellung der Photomultiplier-Röhre, um alle notwendigen letzten Anpassungen an der Bead-Position vorzunehmen. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Aufrechterhaltung konsistenter Messungen, um die Vergleichbarkeit zwischen den Experimenten zu ermöglichen. Daher sind die tägliche Kalibrierung des Zytometers und die Verwendung von Kügelchen in den biologischen Stumpflidern für den Erfolg der langsamen Kytrom-Mikrobiom-Dialyse von entscheidender Bedeutung. Wenn die Zellen fertig sind, mischen und filtrieren Sie die Proben und fügen Sie den logarithmischen Kügelchenmix zu den Zellen hinzu.

Mischen und laden Sie nun die Probe auf das Zytometer und erstellen Sie ein Tor, um die gefärbten Zellen einzuschließen und das Rauschen und die Kügelchen auszuschließen. Analysieren Sie dann den Probensatz nacheinander mit einer maximalen Geschwindigkeit von 3.000 Ereignissen pro Sekunde, bis 250.000 Zellen innerhalb des Cell Gates erkannt werden. Um die Durchflusszytometriedaten zu analysieren, entwickeln Sie eine Master-Gate-Vorlage, die für alle Proben verwendet werden kann.

Beginnen Sie mit dem Laden der Durchflusszytometrie-Normdateien in ein entsprechendes Durchflusszytometrie-Analyseprogramm und verarbeiten Sie die Proben sukzessive. Laden Sie die Proben, doppelklicken Sie auf eine Messung und wählen Sie die Parameter der X- und Y-Achse aus den entsprechenden Dropdown-Menüs aus, um ein Vorwärtsstreudiagramm im Vergleich zu DAPI-Fluoreszenzdiagrammen zu öffnen. Verwenden Sie das Polygon-Zeichenwerkzeug, um das zuvor generierte Messzellen-Gate zu reproduzieren, um die Perlen und das Rauschen auszuschließen, und benennen Sie das Gate entsprechend.

Ziehen Sie den Cell-Gate-Eintrag in die Gruppenliste "Alle Samples" und doppelklicken Sie auf das Cell-Gate, um selektiv nur die Zellenereignisse anzuzeigen. Definieren Sie die in einer Stichprobe vorherrschenden Sub-Communities mit dem Elliptic-Gate-Tool und fassen Sie sie zusammen. Fügen Sie dann zusätzliche Sub-Community-Zuordnungen und nachfolgende Beispiele hinzu, bis die Master-Gate-Vorlage auf alle Beispiele passt.

Steuern Sie die Vorlage des Haupttors mit der Side-Scatter-Scan-Methode, um Untergemeinschaften, die nahe beieinander liegen, aufzulösen. Fügen Sie dann alle untergeordneten Communitys zum Tabelleneditor hinzu, und legen Sie die Ausgabestatistik auf die Häufigkeit des übergeordneten Elements fest. Verwenden Sie den Tabelleneditor, um die relativen Sub-Community-Häufigkeiten in eine geeignete Tabellenkalkulationssoftware zu exportieren und die Datenformatierung gemäß den Richtlinien im Handbuch der Seitenleiste anzupassen.

Um die Dynamik und Korrelationen der Sub-Community zu visualisieren, installieren und laden Sie dann das R-Paket, und laden und normalisieren Sie die txt-Datei. Vorwärtsstreu- versus DAPI-Fluoreszenzdiagramme zeigen die Zellzykluszustände von reinen Stammkulturen zu verschiedenen Zeitpunkten in einer Batch-Kultur. Die Verwendung eines Master-Gate-Templates ermöglicht dann die Quantifizierung des Anteils von Zellen mit einem, zwei oder mehreren Chromosomen, was beispielsweise die Fähigkeit dieser repräsentativen Mikrobe zeigt, ihre Chromosomen schneller zu replizieren als ihre Generationszeit.

Bei der Untersuchung komplexer mikrobieller Gemeinschaften im Laufe der Zeit können das Tempo und die Bedeutung der Verschiebung der Gemeinschaften leicht mit einer Dot-Plot-Sequenz visualisiert werden. Die dominanten Sub-Communities in den verschiedenen Stadien des Experiments können mit dem zytometrischen Barcode-Tool eindeutig identifiziert werden. Die Kombination dieser Daten mit der Häufigkeitsverteilung der relativen Abundanzen der Sub-Gemeinschaften ermöglicht die Auswahl von Gates, die signifikante Abundanzänderungen zu wichtigen Zeitpunkten zeigen.

Die Visualisierung dieser Daten in einem nicht-metrischen mehrdimensionalen Skalierungsdiagramm kann ein tieferes Verständnis der Community-Dynamik ermöglichen. Biogasgemeinschaften können aufgrund von Rührungseinschränkungen mit räumlichen Heterogenitäten konfrontiert sein. Die beispielhaften Probenahmestellen der Biogas-Community weisen eine geringe räumliche, aber ausgeprägte zeitliche Heterogenität auf.

Starke positive oder negative Korrelationen mit abiotischen Parametern wie Produktdichtern können helfen, Ökosysteme und biotechnologische Prozesse zu verstehen und zu optimieren. Darüber hinaus erleichtern sie die Identifizierung von Toren von besonderem Interesse für die anschließende Sortierung und Analyse. Bei der Etablierung dieses Verfahrens wird empfohlen, verschiedene Fixierungs- und Färbeverfahren zu bewerten, um ihre Leistung und Stabilität für jedes neue Probenset zu beurteilen.

Nach der Sortierung können weitere Ansätze wie Ampliconsic Fencing, Metagenomik und Proteomik angewendet werden, um die Top-Gemeinschaften auszuwählen, die Informationen über die protogenetische Zugehörigkeit zu Aktivitätszuständen abseits von Stoffwechselwegen liefern. Diese Methode ebnete den Weg für mikrobielle Ökologen und Bioverfahrenstechniker, die Dynamik des Mikrobioms, natürliche und kontrollierte Ökosysteme mit einem vernünftigen Einsatz von Ressourcen zu verfolgen.