Name: Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse von Mikrobiomdynamiken in Reinkulturen und natürlichen Gemeinschaften. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht Forschern die schnelle Überwachung mikrobieller Ökosysteme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir erkennen dankbar Michael Jahn und Yuting Guo für die Bereitstellung bzw. das Verfahren und die Datasets in Reinkultur und der Belebtschlamm-Gemeinschaft. Wir danken weiter Katrin Mörters für die Biogas-Community-Proben zu analysieren. Diese Arbeit wurde von der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR, Projekt Biogas-Fingerprint Nr. 22008313) im Auftrag des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL), des zentralen Innovationsprogramms für KMU (ZIM) des Bundesministeriums finanziert. für Wirtschaft und Technologie (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), die Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU, Projekt-On-Demand-Produktion von Phosphatdünger aus Reststoffen von Brauerei Und Kläranlage 33960/01-32), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (FZK 03XP0041G) und die Helmholtz-Gemeinschaft programmorientierte Förderung (POF III R31 Thema 3 Bioenergie).

<ol><li>Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+microbial+assimilations+of+soil+carbon%2C+nitrogen%2C+phosphorus%2C+and+sulfur+in+terrestrial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17445(2015).</li>
<li>Fathepure, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+studies+in+microbial+degradation+of+petroleum+hydrocarbons+in+hypersaline+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 173(2014).</li>
<li>Alshehrei, F. <a target="_blank" href="http://pubs.sciepub.com/jaem/5/1/2/">Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms.</a> Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).</li>
<li>Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Synthesis+of+medium-chain+chemicals+from+renewables%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).</li>
<li>Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+control+managed+natural+metacommunities%3A+Species-sorting+and+mass-transfer+paradigms+in+metacommunities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities.</a> Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).</li>
<li>Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification%2C+sorting+and+sequencing+of+methanogenic+archaea+based+on+F420+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 180(2017).</li>
<li>Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li>
<li>Lloyd-Price, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains%2C+functions+and+dynamics+in+the+expanded+Human+Microbiome+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project.</a> Nature. 550, 61-66 (2017).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Stability+Properties+of+Microbial+Communities+Assessed+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry.</a> mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).</li>
<li>Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprinting+for+analyzing+microbial+intracommunity+structure+variation+and+identifying+subcommunity+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function.</a> Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Functions+in+Managed+Microbial+Systems+by+Cytometric+Bar+Coding%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding.</a> Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).</li>
<li>Lefort, T., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/plankt/article/36/1/243/1519288">Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters.</a> Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).</li>
<li>Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+flow+cytometry+reveals+microbial+dynamics+influenced+by+concurrent+natural+and+operational+events+in+groundwater+used+for+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 6, 38462(2016).</li>
<li>van Gelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytometric+approach+to+follow+variation+and+dynamics+of+the+salivary+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota.</a> Methods. 134, 67-79 (2018).</li>
<li>Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+tool+for+characterization+of+microbial+cultures+by+combining+cytomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Determination+of+Plasmid+Copy+Number+of+Flow-Sorted+Cells+using+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).</li>
<li>Koch, C., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li>
<li>Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).</li>
<li>Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIC-an+automated+approach+for+the+detection+of+dynamic+variations+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities.</a> Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).</li>
<li>Günther, S., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitated+gate+setting+by+sequential+dot+plot+scanning%3A+Facilitated+Gate+Setting+by+Sequential+Dot+Plot+Scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning.</a> Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).</li>
<li>Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry+for+Detection+of+Silver+at+the+Bacterial+Single+Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1326(2017).</li>
<li>Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. <a target="_blank" href="http://digital.csic.es/bitstream/10261/5293/1/planktonic.pdf">Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities.</a> Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).</li>
<li>Gasol, J. M., Morán, X. A. G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/8623_2015_139">Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity.</a> Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).</li>
<li>Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/2041-210X.12607">Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry.</a> Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).</li>
<li>Kinet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+community+fingerprinting+and+amplicon+sequencing+for+the+assessment+of+landfill+leachate+cellulolytic+bioaugmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation.</a> Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).</li>
<li>De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+fast+microbial+community+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting.</a> Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).</li>
<li>Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometric+fingerprints%3A+evaluation+of+new+tools+for+analyzing+microbial+community+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 273(2014).</li>
<li>Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29265528">Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).</li>
<li>Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+fingerprinting+for+microbial+strain+discrimination+and+physiological+characterization%3A+Flow+Cytometric+Fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting.</a> Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).</li>
<li>Besmer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-Scale+Simulation+and+Real-Time+Tracking+of+a+Microbial+Contamination+Event+and+Subsequent+Shock-Chlorination+in+Drinking+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26909672">High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment.</a> European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine erfolgreiche Analyse der mikrobiellen Populationen und Gemeinschaften erfordert gut abgestimmte Cytometers, eine geeignete Wahl der zellenparameter und einen zuverlässigen Workflow von Probenahme und Fixierung auf die Messung und Datenauswertung. Die ausgewählte zellenparameter müssen mit den verfügbaren Erregung Wellenlängen Gemahl. Wir nutzen und empfehlen DAPI, die sehr empfindlich bei niedrigen Konzentrationen ist; aber muss mit einem UV-Laser, angeregt werden, die in der Regel nicht im standard Cytometer Aufbauten besteht. Andere Farbstoffe, wie z. B. SYBR Green I, auch ganze Bevölkerungen Fleck oder Gemeinschaften aber liefern in der Regel schlechter als Auflösungen. Wir empfehlen nicht, mit Fisch-Verfahren oder Lebensfähigkeit Tests in mikrobieller Gemeinschaften. Diese Ansätze sind nicht zu quantifizieren, zu überprüfen und zu steuern, weil ihre Auswirkungen auf die einzelnen Arten in der Gemeinschaft ist ungewiss. Sie können nicht zuverlässig getestet werden, solange ein Großteil der typischen Gemeinschaften als eine Reinkultur noch nicht verfügbar ist.
Wichtige Schritte im Protokoll gehören Probenahme und Fixierung Verfahren sowie Zellsortierung. Die Probenahme kann kompliziert werden, durch die Tendenz bestimmter Reinkulturen und mikrobieller Gemeinschaften zu aggregieren, Flocken oder Partikel von der Probenmatrix einhalten. Es ist wichtig, diese Aggregate zu zerstreuen und die Zellen in einer Probe zu trennen, bevor man sie zur durchflusszytometrischen Analyse um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren. Die vorgestellten Vorbereitung Protokolle wurden optimiert, um einzelne Zelle Analyse zu ermöglichen. Eine endgültige 50 µm Filtrierung erfolgt vor der Messung entfernen alle verbleibenden Aggregate und verhindern, dass die 70 µm Düse von der Zelle Sorter und die Strömung Küvette des Analysators verstopfen. Zelle Flocken aus Kläranlagen sind besonders reichlich, robust und entscheidend für die Funktion des Systems. Wir untersuchten die planktonischen und Schlamm Basis mikrobielle Gemeinschaften in verschiedenen Tanks mit einer Full-Scale Kläranlage, das etablierte Protokoll zu testen. Der Schlamm bilden Zelle, die Aggregate deutlich abgeführt wurden und die Zusammensetzung der Gemeinschaft blieb stabil. Darüber hinaus stellte planktonischen und Schlamm-basierten Gemeinschaften bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen ihnen in allen drei gesampelten Tanks (Abbildung 8, ergänzende Datei 1-S10). Diese Ergebnisse wurden durch vergleichende 16 s rDNA Amplikons Sequenzierung von einem frisch, ein Formaldehyd behandelten-überprüft ein Formaldehyd und Ethanol fixiert-, und eine sortierte Probe10. Dennoch kann außerordentlich anspruchsvoll Umweltproben, wie starke Biofilme oder Bakterien wachsen in eng vernetzten Ketten abführen möglich. Bodenproben können besonders problematisch sein, da die allgegenwärtigen Partikel im Histogramm angezeigt und können die Zellen durch schieren Fülle verdecken. In solchen Fällen müssen traditionelle sequenziermethoden angewendet werden.
Die Fixierung Stabilität jeder neuen Sample-Set sollte getestet werden, bevor Sie das Experiment damit Ergebnis gültige entwerfen. Gute Fixierung Stabilität ermöglicht auch die gepoolten Färbung und Messung von mehreren Referenzpunkten Zeit an einem einzigen Tag. Es ermöglicht außerdem Replikation Messungen und Retrospektive Zellsortierung von entscheidenden Zeitpunkten nach den Abschluss und die endgültige Auswertung des Versuchs. Die Fixierung Stabilität der Reinkultur wurde über 28 Tage (Abbildung 9) überprüft. Für vor-Ort-Untersuchungen einschließlich der Probentransport sollte die Fixierung Stabilität über einen längeren Zeitraum (in diesem Fall 60 Tage für die Gemeinschaft Belebtschlamm 195 Tage für die Biogas-Community, ergänzende Datei 1-S9) getestet werden.
Die Färbung ist in der Regel nicht problematisch, aber mit einem biologischen Standard Anwendung von der bioinformatische Bewertungsinstrumente darf gesteuert werden muss. Wir nutzten die mock-Stamm E. Coli BL21 (DE3), nach dem ASC-Protokoll fixiert und wurde für den Einsatz in jeder Färbung Charge gehortet.
Abgesehen von DAPI, SYBR Green wurde ich erfolgreich angewendet um mikrobielle Gemeinschaften für mehrere Jahre14,23,24,25,26zu beheben. SYBR Green ich lösen Gemeinschaften in hohen und niedrigen Nukleinsäure Teilmengen (HNA und LNA) mit lebenden Zellen in ein Online-Modus. DAPI, ist genauer in seiner Bindung an DNA und ermöglicht die Unterscheidung von mehr als 50 Untergemeinschaften in einem Muster-Set jedoch erfordert einen Fixierung Schritt vor der Färbung.
Zellsortierung ist ein herausragendes Merkmal dieses Ansatzes und kann angewendet werden, wenn bestimmte Untergemeinschaften von Interesse sind. Es muss betont werden, dass weder PFA-(durchgeführt für nur 30 min) noch Ethanol Behandlung oder DAPI-Färbung10 wirkt sich negativ auf die nachfolgenden 16 s Amplikons Sequenzierung hatte. Potenzial beeinflusst die Fixierung und Färbung Verfahren auf Untergemeinschaft Metagenom Analysen noch geprüft werden müssen.
Eine Menge von Informationen über die Community-Funktionen und Trend Dynamik erhalten Sie unabhängig von der Sortierung Ansatz bei der Bioinformatik-Werkzeuge mit, die Community-Funktionen auf einer virtuellen Ebene der Zelle für Zelle lösen und verbinden Sie diese Funktionen mit abiotischen Parameter.
Kürzlich eine Reihe von neuen Bioinformatik Bewertung, alles nützliche Werkzeuge für beide die SYBR Green ich und DAPI-Ansätze, wurden entwickelt, um durchflusszytometrischen Gemeinschaft Mustern zu lösen. Dies sind FlowFP27, die Pakete in dieser Studie (FlowCHIC20, FlowCyBar28) verwendet, ein Dekonvolution Modell mit frischem Wasser Gemeinschaften29 etabliert und ein Werkzeug benutzt, um die Stämme nach ihrer physiologischen diskriminieren Eigenschaften-30. Darüber hinaus kann durchflusszytometrischen Vielfalt bestimmt25 und sogar Stabilitätseigenschaften mikrobieller Gemeinschaften können jetzt mit einem online-Tool10verfolgt werden.
So haben fließen durchflusszytometrischen Analyse einen großen Vorteil, wenn es darum geht, schnelle Auswertung von mikrobiellen Gemeinschaften und möglichen abiotischen Parameter Korrelationen. Allerdings gibt es immer noch Beschränkungen in Bezug auf die Methode. Es kann nicht wirklich online mit dem FlowCyBar-Werkzeug aufgrund der erfahrenen basierend Tor Einstellvorgang angewendet werden. Darüber hinaus würde die Entwicklung nach Maß, bedienungsfreundlich fließen Cytometers stark die Verbreitung des Analyseansatzes Fluss durchflusszytometrischen Microbiome voranzutreiben. Erste Schritte in diese Richtung sind durchgeführte28.
Zukünftige Anwendungen der mikrobiellen Durchflusszytometrie können in der mikrobiellen Ökologie vorgestellt werden, wie es ermöglicht Hochfrequenz Überwachung im Bereich der bakteriellen Generationszeiten und es nachgewiesen wurde, dass ökologische Paradigmen durchflusszytometrischen Daten5 anwendbar sind ,10. Die Methode ist sehr nützlich für Routine-Screenings von Naturlandschaften wie die obligatorische Trinkwasser-Steuerelemente in der Schweiz31. Es kann auch ein wertvolles Instrument für medizinische Anwendungen wie menschliche15 oder tierischen32 Microbiome Screening. Darüber hinaus können neueste Entwicklungen in der Bioinformatik mikrobielle Durchflusszytometrie ein integraler Sensor in die Prozesssteuerung von verwalteten mikrobieller Systeme zu ermöglichen. Mikrobielle Gemeinschaft zytometrie bietet auch ein Screening-Instrument für Zellsortierung, wodurch höhere Auflösung genomische Untersuchungen von bestimmten Community Teilmengen.

Mikroorganismen spielen eine entscheidende Rolle in vielen Aspekten der menschlichen Leben. Sie sind die biotischen Haupttreiber des Planeten Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel Zyklen1und fungieren als erniedrigende2,3 , sowie die Synthese4 Biokatalysatoren in verschiedenen Branchen, wie z. B. Abwasserbehandlung 5 oder Biotechnologie6. Sie bilden auch die menschlichen Mikrobiom, die menschliche Gesundheit und Stoffwechsel7,8direkt beeinflusst. Daher sind die Informationen auf Struktur, Funktion und dynamisches Verhalten von Mikroorganismen, in Beantwortung ihrer unmittelbaren Umgebung notwendig, wenn unser Ziel ist es zu verstehen und diese Systeme zu manipulieren. Nächste Generation sequencing (NGS) ist die bewährte Technologie zur Lösung von Microbiome Struktur und Funktion9. Die Analyse und Bewertung der NGS-Daten können nicht nachgeben quantitativen Informationen und ist immer noch teuer, zeitaufwendig und keineswegs bereit, vor-Ort-Ergebnisse in Leistung Gängen. Einige Bakterien zeigen Generationszeiten unter 1 h und ständig wechselnden Gemeinschaftsstrukturen in bestimmten Umgebungen10Ursache. Im Anschluss an solche Dynamik würde durch Sequenzierung Ansätze das Finanz- und Belegschaft der meisten wissenschaftlichen Labors überschreiten.
Im Gegensatz dazu kann Durchflusszytometrie Gemeinschaft ähnlich NGS Daten, Fingerabdrücken unter Beibehaltung einer höheren Zeit, Arbeit und Kosten-Effizienz. Hier präsentieren wir Ihnen fließen durchflusszytometrischen Techniken mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik auf der Linie auf der Ebene der einzelnen Zelle zu verfolgen. Im Gegensatz zu NGS Durchflusszytometrie liefert keine phylogenetische Zugehörigkeit oder Informationen auf funktionelle Gene, sondern liefert quantitative Zellzahlen. Mit Durchflusszytometrie, können mikrobielle Gemeinschaften in Untergemeinschaften mit unterschiedliche Lichtstreuung und Fluoreszenzeigenschaften (forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) liefern Hinweise der Zellengröße und Granularität, beziehungsweise) gelöst werden. Der vorgestellte Ansatz nutzt überwiegend Zelle Größe - und DNA belaufen sich Informationen, die auf bestimmte Zelltypen und physiologischen (Wachstum) Staaten verbunden sind. Der DNA-Gehalt wird quantifiziert mit UV-erregbare 4', 6-Diamidino-2'-Phenylindole (DAPI) Farbstoff, der bindet an A-T reichen Regionen der DNA und kann sogar chromosomalen unterschiedlichem lösen. Durch die Kombination von DAPI Fluoreszenz und FSC können mehr als 50 Untergemeinschaften unterschieden und für die Umstellung Zeit11Häufigkeiten überwacht werden. Die Untergemeinschaft Fülle Variationen können mit Veränderungen in der Mikro-Umwelt Umgebung, wie z. B. pH-Wert und Produkt-Titer12, mit globalen Parameter, wie z. B. das Wetter13,14, oder im Falle von Darm oder Speichel korreliert werden mikrobiome mit bestimmten medizinischen Behandlungen15. Diese Korrelationen zeigen wichtige Untergemeinschaften verantwortlich für bestimmte Funktionen in den metabolischen Netzwerkes der ganzen Gemeinde. Die wichtigsten Untergemeinschaften können dann werden speziell gefördert oder unterdrückt durch die Veränderung der Mikro-Umfeld oder sortiert für anschließende Sequenzierung15 oder Proteomic Untersuchung16.
Allerdings ist mikrobiellen Gemeinschaft Durchflusszytometrie nicht noch weit aufgrund der eher niedrigen Anzahl Fluss durchflusszytometrischen Geräte ordnungsgemäß auflösen von mikrobiellen Populationen oder Gemeinschaften gegründet. Darüber hinaus kann der Mangel an Erfahrung, Gemeinschaft Analyse Rohrleitungen und effektive Datenauswertung eine Eintrittsbarriere für Forscher Microbiome Analyse Herausforderungen darstellen. Wir haben umfangreiche Workflows zur Lösung dieser Probleme festgestellt. Um ihre allgemeine Anwendbarkeit zu veranschaulichen, präsentieren wir ihnen auf drei beispielhafte Sample-Sets (ergänzende Datei 1-S1), nämlich ich) eine Reinkultur (PC) für biotechnologische Anwendungen in definierten klar Medium (Pseudomonas Putida KT 2440 auf angebaut (Glukose), Ii) eine komplexe Lab-Gemeinschaft in klare Medium (Belebtschlamm Gemeinschaft (ASC) im synthetischen Abwasser) und Iii) eine komplexe Community von Naturlandschaften in einer dichten Matrix (Biogas-Community (BC) in Maissilage).
Mehrere Faktoren beeinflussen die Protokoll-Wahl für jeden der diese Sample-Sets. Tieffrieren verzichtet auf den Einsatz von giftigen Chemikalien, sondern beschränkt sich meist auf Lab-Umgebungen durch die Verwendung von flüssigem Stickstoff für Schock Zuckerguss. Die Formaldehyd-Stabilisierung und anschließende Ethanol Fixierung ermöglicht Bulk Sampling ohne die Notwendigkeit einer aliquoten Vorbereitung und erweist sich über lange Zeiträume stabil sein. Jedoch möglicherweise Protein-reiche Proben wie menschlichem Speichel15 problematisch, da Protein Flocken, denaturiert durch Formaldehyd, ungünstigen Signal-Rausch-Verhältnis führen können. Die probentrocknung dauert die meiste Zeit (ca. 1 h insgesamt) der Verfahren in diesem Vergleich, aber auf der Baustelle ohne giftige Chemikalien durchgeführt werden kann. Es liefert stabile Pellets in Rohren, die ohne Kühlung oder zusätzliche Gefahr Vorsichtsmaßnahmen problemlos versendet werden können. Darüber hinaus wurden viele alternative Fixierung Methoden vorgeschlagenen11. Wir empfehlen dringend, um die Auflösung und Fixierung Stabilität verschiedener Protokolle zu testen, bei der Einführung eines neuen Muster-Set.
Wir zwei verschiedene fließen Cytometers verwendet, um die Sätze zu analysieren: (i) eine sehr aufwendige und teure, Forschung zentriert Zelle Sorter und (Ii) eine Anwendung konzentriert Top Bank Analyzer, die für vor-Ort-Anwendung5besser geeignet erscheint. Der BC wurde mit der Bank Top Analyzer gemessen, während der PC und der ASC mit dem Cell Sorter gemessen wurden. Die Analyse der drei beispielhafte Probe setzt benötigte unterschiedliche Verfahren zur optimierten Reproduzierbarkeit, Probe Stabilität und Workflow-Komfort. Das folgende Protokoll wird in den Abschnitten für die drei verschiedenen Systeme angeben.

<table><tbody><tr><td>Milli-Q System Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak Ultrafiltration Cartridge</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy cell sorter</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&nbsp;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, Kalifornien, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhren R928 und R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3 Software</td><td>Beckman-Coulter, Brea, Kalifornien (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &micro; M&nbsp; FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F8815</td><td>350/440 blau fluoreszierend</td></tr><tr><td>2 &mu; m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 gelb-grün fluoreszierende Kügelchen&nbsp;</td></tr><tr><td>0,5 μm m Fluoresbrite BB Carboxylat-Mikrosphären</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &mu; m Fluoresbrite BB Carboxylat-Mikrosphären</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 blau fluoreszierend</td></tr><tr><td>1 & micro; mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 gelb-grün fluoreszierende Kügelchen&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS-Nr. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Laser Genesis CX,Coherent</td><td>, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32 Serie PMTs</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax Software</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&ouml; rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alle optischen Filter</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>Herstellernummer: 42398</td></tr><tr><td>R-software v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><<td>a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td><a href="http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kennzeichnenden microbiome dynamik – durchflusszytometrie basierten workflows von reinkulturen zu natürlichen gemeinschaften

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

Die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik ist von entscheidender Bedeutung zu verstehen und zu kontrollieren, natürliche Ökosysteme und technische Anwendungen, Gefahren durch Mikroorganismen. Nächste Generation sequenziermethoden werden weithin genutzt, um mikrobiome zu lösen, aber sie sind in der Regel Ressourcen- und zeitintensiv und vor allem qualitative Informationen zu liefern. Microbiome durchflusszytometrischen Analyse leidet nicht die Nachteile und können relative Untergemeinschaft Häufigkeiten und absoluten Zelle Zahlen auf Linie. Obwohl es keine direkte phylogenetische Information liefert, kann es die auswertetiefe und Auflösung der Sequenzierung Ansätze verbessern. Im Gegensatz zu medizinischen Anwendungen in Forschung und Routine-Einstellungen ist Durchflusszytometrie für Microbiome Analyse noch nicht weit verbreitet. Fehlende Angaben zu Probe-Vorbereitung und Daten-Analyse-Pipelines kann eine Eintrittsbarriere für die Forscher Herausforderungen Microbiome Analyse, die oft Lehrbuch Flow-zytometrie-Anwendungen erstellen. Hier präsentieren wir drei umfangreiche Workflows für Reinkulturen, komplexen Gemeinschaften in Mittel- und komplexen Gemeinschaften in herausfordernden Matrizen bzw. klar. Wir beschreiben einzelne Verfahren, Probenahme und Fixierung und Färbung Protokolle für das jeweilige Sample-Sets optimiert. Wir erarbeiten der durchflusszytometrischen Analyse mit einem komplexen Forschung zentriert und eine Anwendung fokussierte Bank Top-Gerät, beschreiben die Zelle Sortieren Verfahren und Daten-Analyse-Pakete empfehlen. Wir zudem wichtige experimentelle Kontrollen vorschlagen und gelten die dargestellten Abläufe für die jeweiligen Sample-Sets.

Folgende repräsentative Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit von Wiederholungen und veranschaulichen die verschiedenen Data-Visualisierung und Analyse-Techniken auf jedem der drei Sample-Sets. Sie zeigen die Ergebnisse der möglichen Datenpipelines Bewertung für standard Forschung Fragen zu den jeweiligen Satz geeignet. Die vorgestellten Techniken sind jedoch nicht ausschließlich auf das Sample-Set, die sie mit vorgestellt werden. Die Flow Cytometry Rohdaten wurde öffentlich mit FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 zur Verfügung gestellt. Bisher liegen hochgeladenen ASC unter ID FR-FCM-ZYD7.
Biologische und technische repliziert wurden genommen, vorbereitet und nach veröffentlichten Protokolle11analysiert. Biologischer Replikate aus dem PC und ASC wurden aus drei parallelen Kolben. Biologischer Replikate des v. Chr. wurden drei weitere Kostproben an einem Standort in einer pilot-Scale-Anlage gelegt. Drei Aliquote einer Probe wurden fixiert, gefärbt und analysiert, um die technische Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Methoden Reproduzierbarkeit wurde nach bereits veröffentlichten Verfahren11bewertet. Eine Tor-Vorlage für alle Proben einer Sample-Set (ergänzende Datei 1-S6) wurde verwendet für die Berechnung der Standardabweichung (%) pro Tor.
Für den PC war die maximale Standardabweichung der relativen Fülle 3,44 %, während die durchschnittliche Standardabweichung 2,13 % (Abbildung 1). Für die ASC und der BC wurden die maximale Standardabweichungen von der relativen Häufigkeiten 1,27 bis 0,88 %, während die Durchschnitte der Standardabweichungen 2.13 bis 0,21 % (ergänzende Datei 1-S8) waren.
Ein Standardverfahren bei der Untersuchung von einer reinen Stamm-Kultur ist die Vorbereitung einer Wachstumskurve, Lag-Phase, Generationszeiten und Zelldichte unter bestimmten Bedingungen zu analysieren. Wir kombinieren dieses Verfahren mit dem Fluss durchflusszytometrischen Analyse Workflow, ein tieferes Verständnis des Systems (Abbildung 2) zu erreichen. Der FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke zeigen die Zellzyklus Staaten der Kultur an verschiedenen Punkten der Batch-Kultur. Kopiervorlage master Tor (ergänzende Datei 1-S6) wurde gegründet, um den Anteil der Zellen mit einem (c1n), quantifizieren zwei (c2n) und mehrere Chromosomen (cXn, Abb. 2 b). Der überwiegende Teil der beimpften Zellen hatte nur ein Chromosom (93,7 % um 0 Uhr). Dies änderte sich drastisch während des exponentiellen Wachstums, wo fast alle Zellen enthalten mehr als eine (99,6 %, 4 h) und über die Hälfte der Bevölkerung (53,1 %) sogar mehr als zwei Chromosomen enthielten. Dies zeigt p. Putidas Fähigkeit, seine Chromosomen schneller als ihre Generationszeit zu replizieren.
Durchflusszytometrischen Analyse erweist sich als sehr nützlich für die Überwachung der Entwicklung der mikrobiellen Lebensgemeinschaften. Es kann Gemeinschaft Dynamik sehr viel näher als die mehr Ressource intensiv molekularbiologische Methoden5,10folgen. Wir haben diese Dynamik in einem Film und eine Übersicht der Belebtschlamm Gemeinschaft Verschiebungen im Laufe der Zeit gewonnen. Jede Sekunde Frame zeigt ein FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstück einen Auswahlpunkt (ergänzende Datei 2). Eine sehr ausgeprägte Verschiebung zwischen 0 und 4 Tag folgte die Errichtung einer Kern-Community nach Tag 7. Zusätzliche Untergemeinschaften kam am 21. Tag. Wir haben master Tor Vorlage (ergänzende Datei 1-S6), die die Bewertung der mikrobiellen Dynamik auf einer Untergemeinschaft Ebene aktiviert. Die dominierende Untergemeinschaften in verschiedenen Phasen des Experiments waren eindeutig mit dem CyBar-Tool (Abbildung 3). In Kombination mit der Häufigkeitsverteilung der relativen Untergemeinschaft Häufigkeiten half Tore wählen interessante (signifikante Änderung in Hülle und Fülle zu einem wichtigen Zeitpunkt ausgelöst) und tragfähige (über 5 % relative Häufigkeit) für die Sortierung und weitere Analyse22.
Industriellen Maßstab Bioreaktor Anwendungen können mögliche räumliche Heterogenitäten bedingt Unruhe konfrontiert werden. Ändern der Betriebsparameter, wie Veränderungen in der Qualität der nicht-synthetische Substrate sind auch häufig ausgesetzt. Der BC steht für ein solches System und wurde von verschiedenen Orten in einem dynamisch gesteuerte Stecker Fluss Reaktor gesampelt. Der FSC vs. DAPI Fluoreszenz Diagramme (Abbildung 4) von der vorbildlichen Referenzpunkten zeigen nur wenig räumliche, sondern ausgeprägte zeitliche Heterogenität. Der BC wurde mit beiden untersucht, schnell automatisiert CHIC und die tiefer gehende master Tor Vorlage basierenden CyBar Ansatz.
Naturgemäß automatisierte, schnelle und neutrale macht den CHIC in einer industriellen Umgebung besonders interessant für vor-Ort-Kontrolle der Bioprozesse. Es vergleicht rohen .fcs Daten aller verfügbaren Proben. Zwei dieser Vergleiche sind in Abbildung 5dargestellt. Die Ergebniswerte der Unähnlichkeit bestätigen die bisherigen Beobachtungen über räumliche und zeitliche Heterogenität. Die NMD Parzellen erzeugt Form schick Werkzeuge Unähnlichkeit Matrix (Abbildung 6) weiter konkretisiert dieses Ergebnis und visualisiert es entsprechend.
Darüber hinaus haben wir die relativen Häufigkeiten von 23 Untergemeinschaften des v. Chr. mit einem master Tor-Vorlage (ergänzende Datei 1-S6) berechnet. Eine Korrelationsanalyse von 48 Proben aus einem ein-Jahres-Frist wurde durchgeführt, um funktionale Beziehungen in der mikrobiellen Gemeinschaft verstehen. Dies kann helfen, um Tore von Interesse für weitere Untersuchungen (4 Zellsortierung) zu identifizieren. Starke positive oder negative Korrelationen mit abiotischen Parametern wie Produkt Titer können helfen, zu verstehen und Ökosysteme und biotechnologische Prozesse zu optimieren. Die organischen raumbelastung enthalten in diesem Zusammenhang (Abbildung 7) ist ein Beispiel für ein abiotischer Parameter. G4, G5 und G10 weisen starke positive Korrelationen und könnte möglicherweise fermentative Arten enthalten, während die negative Korrelation im G8 in Richtung methanogenen Archaeen andeuten könnten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg"> Abbildung 1: Reproduzierbarkeit der durchflusszytometrischen Analyse der Reinkultur. FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke mit Kontrolle Perlen (A, B) und bar Grundstücke 3 Untergemeinschaft Häufigkeiten [%] mit Fehlerbalken repräsentieren eine ± Standardabweichung (C, D). Die relativen Häufigkeiten wurden mit der Tor-Vorlage gezeigt in ergänzende Datei 1-S6 bestimmt. Drei biologische Wiederholungen A, B und C die Wachstumskurve um 4 Uhr wurden und drei technische Wiederholungen P1, P2, P3 bereiteten aus Probe A und dreimal, jeweils gemessen: M1, M2, M3, und sind mit ihren jeweiligen Standardabweichungen angegeben. 50.000 Veranstaltungen verzeichneten in der Zelle-Tor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg"> Abbildung 2: Zellzyklus Analyse der in Reinkultur, die während einer Wachstumskurve experimentieren über 12 Std. (A). FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke von der Bi-stündlichen Kostproben, die eine Veränderung der DNA-Gehalt in der exponentiellen Wachstumsphase aufweisen. Diese Messreihe enthalten nicht Perlen (siehe ergänzende Datei 1-S3). (B). optische Dichte basierenden Wachstumskurve mit Fehlerbalken repräsentieren eine ± Standardabweichung und relative Häufigkeiten in den Untergemeinschaften im Laufe der Zeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg"> Abbildung 3: Entwicklung der Belebtschlamm Gemeinschaftsstruktur über 24 Tage. (A) die FlowCyBar mit Überlagerung von Häufigkeitsverteilungen in Boxplots für den einzelnen Toren, die Ähnlichkeit der Trends arrangiert werden, visualisiert, die entsprechende Farb-Taste (B) und eine Ähnlichkeit-Analyse in einem NMD Plot Wit R &lt; 0,001 () ( C). die zugrunde liegenden Grundstücke sind in der Filmsequenz in ergänzende Datei 2 dargestellt. Relative Häufigkeiten wurden anhand der Tor-Vorlage, in ergänzende Datei 1 - S6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg"> Abbildung 4: räumliche und zeitliche Heterogenität der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur in industriellem Maßstab plug Flow biogasreaktor. (A) der Vergleich der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur der vier Probenahme Häfen I-IV am Tag 223. (B) der Vergleich der Zeit abhängigen Gemeinschaft Struktur Variationen von Tag 0, Tag 384 im Hafen II. Der Lärm hat verspätet abgeschnitten worden, um die Visualisierung zu verbessern. 250.000 Ereignisse wurden in der Zelle-Tor (ergänzende Datei 1-S6) gemessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg"> Abbildung 5: Bildvergleich durchflusszytometrischen Histogramm – schick. Das Prinzip des CHIC-Algorithmus wird durch den Vergleich zweier Proben repräsentieren die räumliche und zeitliche Heterogenität jeweils illustriert. (i) schicke Bilder entstehen aus .fcs Dateien nach Auswahl zwei Parameter (FSC vs. DAPI Fluoreszenz) angezeigt. Die Graustufen (0 – 255) kodiert die Anzahl der Ereignisse in einem Pixel. (Ii) CHIC Teilmengen werden nach Angabe des Bereichs, in Zellen generiert (hier: 200 &lt; x 4000 200 &lt; &lt; y &lt; 2200). (Iii) XOR Kombination Bild entsteht durch den Vergleich Pixel zwischen den Untergruppen. Kein Unterschied ist gleich 0 und wird als schwarz angezeigt. Maximale Differenz entspricht 200 und wird als weiß angezeigt. Der entsprechende XOR-Wert berechnet, indem die Graustufen-Werte alle Pixel im Bild XOR. (iv) Überlagerungsbild Kombination entsteht, wenn die Graustufen-Werte der Pixel der Teilmengen. Der entsprechende Overlay-Wert wird berechnet durch zählen der Pixel ein Overlay-Bild, die nicht gleich NULL und deshalb enthalten Informationen. (V) Unähnlichkeit Werte sind XOR und Overlay Werte dividiert. Diese sind die Basis für die NMD-Darstellung in Abbildung 6. Die Unähnlichkeit Werte und NMD Handlung zeigen eine vernachlässigbare räumliche- und eine ausgeprägte zeitliche Gemeinschaft Heterogenität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg"> Abbildung 6: CHIC basierte Ähnlichkeit Analyse der Biogas Gemeinschaft Proben. Die 0-Day-Probe wurde aus dieser Handlung aufgrund seiner extrem unterschiedlichen Gemeinschaftsstruktur verzerren die Analyse (ergänzende Datei 1-S11) ausgeschlossen. Die NMD Handlung bestätigt die Annahme über räumliche niedrig- und höhere zeitliche Heterogenität mit dem CHIC-Tool gemacht und erklärt in Abbildung 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg"> Abbildung 7: Korrelationsanalyse auf der Biogas-Community. Die Matrix wurde mit Spearmans Rangfolge Koeffizient berechnet und basiert auf der relativen Häufigkeiten von 23 Untergemeinschaften, die mit dem master Tor Template in ergänzende Datei 1-S6 ermittelt wurden. Sie wurden korreliert mit der organischen raumbelastung (OLR) für 48 Proben aus einem Zeitraum von einem Jahr. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg"> Abbildung 8: Ähnlichkeit Analyse von planktonischen (P) und Schlamm basiert (S) Gemeinschaften im Abwasser. Von der primären Klär (PCL), aktiviert Schlamm Becken (AS) und Digester Tank (DT) eine komplette Kläranlage (Punkt plottet in ergänzende Datei 1-S10) wurden Proben genommen. Relative Häufigkeiten wurden anhand der Tor-Vorlage in ergänzende Datei 1-S6 gezeigt. Diese Untergemeinschaft Häufigkeiten wurden auch mit dem FlowCyBar-Werkzeug erstellen Sie ein CyBar (ergänzende Datei 1-S10) und NMD analysiert Plot (R &lt; 0,01). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg"> Abbildung 9: Fixierung Stabilität der Reinkultur. Proben aus dem Wachstum Kurve Experiment genommen um 0 Uhr wurden nach der Fixierung in 15 % Glycerin über 28 Tage bei-80 ° C gelagert. FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke mit Perlen gezeigt werden. Messreihe beinhaltet keine Perlen (ergänzende Datei 1-S3). 50.000 Veranstaltungen verzeichneten in der Zelle-Tor (ergänzende Datei 1-S6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der mikrobiellen Ökologie und Biotechnologie zu beantworten, z. B. welche ökologischen Konzepte ein bestimmtes Ökosystem antreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um die schnelle Mikrobiomdynamik mit dem kurzen Intervall-Probenahmeregime zu schließen und gleichzeitig sehr kostengünstig zu bleiben. Diese Methode kann verwendet werden, um Informationen über biotechnologische und natürliche mikrobielle Gemeinschaften sowie über tierische und menschliche Mikrobiome für Ernährungs- und Gesundheitszustände zu erhalten.Das Verfahren wird von Florian Schattenberg, Techniker und SediMeter-Bediener in unserem Labor, vorgeführt. Um eine Biogasgemeinschaftsprobe zu trocknen, verwenden Sie eine modifizierte Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um 200 Mikroliter des viskosen Gärrests in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit 1,7 Millilitern PBS zu überführen. Legen Sie die Röhrchen nach gründlichem Mischen für eine Minute in ein Ultraschallbad, um alle großen Zellaggregate aufzulösen und an Pflanzenzellresten haftende Zellen zu befestigen.Nach der Beschallung wird die Probe gründlich gemischt und die Zellen durch ein 50-Mikrometer-Porensieb in ein 2-Milliliter-Kunststoffröhrchen filtriert. Das Filtrat wird in vier 400stel Mikroliter Aliquote aufgeteilt und die Aliquote zweimal zentrifugiert, wobei der Überstand beide Male vollständig verworfen wird, um die Mikrobenprobe so gründlich wie möglich mechanisch zu entwässern. Anschließend trocknet man die Probe in einer beheizten Vakuumzentrifuge, um ein stabiles Pellet zu erhalten, und lagert das Pellet bei vier Grad Celsius lichtgeschützt.Zur Stabilisierung und Fixierung von Belebtschlammproben zentrifugieren Sie vier Milliliter der Zellen und suspendieren das Pellet in vier Millilitern mit zwei Prozent Formaldehyd in PBS. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die stabilisierte Zellprobe und fixieren das Pellet in vier Millilitern 70 % Ethanol für eine Lagerung bei minus 20 Grad Celsius. Mischen und übertragen Sie 0,6 Milliliter der fixierten Zellsuspension in ein Glasröhrchen mit 1,4 Millilitern PBS und beschallen Sie nach gründlichem Mischen 10 Minuten lang, wie gezeigt.Am Ende der Beschallung werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in zwei Millilitern frischem PBS wieder suspendiert. Nach gründlichem Mischen beschallen Sie die Zellen wie gerade gezeigt fünf Minuten lang und stellen den OD 700 Nanometer mit frischem PBS auf 035 ein. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Permeabablisierungspuffer, der 0,11 molare Zitronensäure und 4,1 μmolare Tween 20 enthält, unter gründlichem Mischen für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.Sammeln Sie dann die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet gründlich in zwei Millilitern Färbelösung mit 0,68 Mikromolar DAPI für eine mindestens 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz. Laden Sie für die Bead-Kalibrierung die Bead-Mischung für die lineare Kalibrierung in das Durchflusszytometer und messen Sie die Beads kontinuierlich, während Sie die Positionen der Düse und der Laseroptik manipulieren, um das Gerät im linearen Bereich vorzukalibrieren. Wenn die Bead-Peaks in eine voreingestellte Kalibrierungsvorlage eingepasst werden können, wechseln Sie in den Log-Modus und laden Sie eine logarithmische Kalibrierungsbead-Probe.Passen Sie die logarithmischen Bead-Peaks an ihre voreingestellte Kalibrierungsschablone an, um die Hardware des Instruments fein abzustimmen, und verwenden Sie die Verstärkungseinstellung der Photomultiplier-Röhre, um alle notwendigen letzten Anpassungen an der Bead-Position vorzunehmen. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Aufrechterhaltung konsistenter Messungen, um die Vergleichbarkeit zwischen den Experimenten zu ermöglichen. Daher sind die tägliche Kalibrierung des Zytometers und die Verwendung von Kügelchen in den biologischen Stumpflidern für den Erfolg der langsamen Kytrom-Mikrobiom-Dialyse von entscheidender Bedeutung. Wenn die Zellen fertig sind, mischen und filtrieren Sie die Proben und fügen Sie den logarithmischen Kügelchenmix zu den Zellen hinzu.Mischen und laden Sie nun die Probe auf das Zytometer und erstellen Sie ein Tor, um die gefärbten Zellen einzuschließen und das Rauschen und die Kügelchen auszuschließen. Analysieren Sie dann den Probensatz nacheinander mit einer maximalen Geschwindigkeit von 3.000 Ereignissen pro Sekunde, bis 250.000 Zellen innerhalb des Cell Gates erkannt werden. Um die Durchflusszytometriedaten zu analysieren, entwickeln Sie eine Master-Gate-Vorlage, die für alle Proben verwendet werden kann.Beginnen Sie mit dem Laden der Durchflusszytometrie-Normdateien in ein entsprechendes Durchflusszytometrie-Analyseprogramm und verarbeiten Sie die Proben sukzessive. Laden Sie die Proben, doppelklicken Sie auf eine Messung und wählen Sie die Parameter der X- und Y-Achse aus den entsprechenden Dropdown-Menüs aus, um ein Vorwärtsstreudiagramm im Vergleich zu DAPI-Fluoreszenzdiagrammen zu öffnen. Verwenden Sie das Polygon-Zeichenwerkzeug, um das zuvor generierte Messzellen-Gate zu reproduzieren, um die Perlen und das Rauschen auszuschließen, und benennen Sie das Gate entsprechend.Ziehen Sie den Cell-Gate-Eintrag in die Gruppenliste "Alle Samples" und doppelklicken Sie auf das Cell-Gate, um selektiv nur die Zellenereignisse anzuzeigen. Definieren Sie die in einer Stichprobe vorherrschenden Sub-Communities mit dem Elliptic-Gate-Tool und fassen Sie sie zusammen. Fügen Sie dann zusätzliche Sub-Community-Zuordnungen und nachfolgende Beispiele hinzu, bis die Master-Gate-Vorlage auf alle Beispiele passt.Steuern Sie die Vorlage des Haupttors mit der Side-Scatter-Scan-Methode, um Untergemeinschaften, die nahe beieinander liegen, aufzulösen. Fügen Sie dann alle untergeordneten Communitys zum Tabelleneditor hinzu, und legen Sie die Ausgabestatistik auf die Häufigkeit des übergeordneten Elements fest. Verwenden Sie den Tabelleneditor, um die relativen Sub-Community-Häufigkeiten in eine geeignete Tabellenkalkulationssoftware zu exportieren und die Datenformatierung gemäß den Richtlinien im Handbuch der Seitenleiste anzupassen.Um die Dynamik und Korrelationen der Sub-Community zu visualisieren, installieren und laden Sie dann das R-Paket, und laden und normalisieren Sie die txt-Datei. Vorwärtsstreu- versus DAPI-Fluoreszenzdiagramme zeigen die Zellzykluszustände von reinen Stammkulturen zu verschiedenen Zeitpunkten in einer Batch-Kultur. Die Verwendung eines Master-Gate-Templates ermöglicht dann die Quantifizierung des Anteils von Zellen mit einem, zwei oder mehreren Chromosomen, was beispielsweise die Fähigkeit dieser repräsentativen Mikrobe zeigt, ihre Chromosomen schneller zu replizieren als ihre Generationszeit.Bei der Untersuchung komplexer mikrobieller Gemeinschaften im Laufe der Zeit können das Tempo und die Bedeutung der Verschiebung der Gemeinschaften leicht mit einer Dot-Plot-Sequenz visualisiert werden. Die dominanten Sub-Communities in den verschiedenen Stadien des Experiments können mit dem zytometrischen Barcode-Tool eindeutig identifiziert werden. Die Kombination dieser Daten mit der Häufigkeitsverteilung der relativen Abundanzen der Sub-Gemeinschaften ermöglicht die Auswahl von Gates, die signifikante Abundanzänderungen zu wichtigen Zeitpunkten zeigen.Die Visualisierung dieser Daten in einem nicht-metrischen mehrdimensionalen Skalierungsdiagramm kann ein tieferes Verständnis der Community-Dynamik ermöglichen. Biogasgemeinschaften können aufgrund von Rührungseinschränkungen mit räumlichen Heterogenitäten konfrontiert sein. Die beispielhaften Probenahmestellen der Biogas-Community weisen eine geringe räumliche, aber ausgeprägte zeitliche Heterogenität auf.Starke positive oder negative Korrelationen mit abiotischen Parametern wie Produktdichtern können helfen, Ökosysteme und biotechnologische Prozesse zu verstehen und zu optimieren. Darüber hinaus erleichtern sie die Identifizierung von Toren von besonderem Interesse für die anschließende Sortierung und Analyse. Bei der Etablierung dieses Verfahrens wird empfohlen, verschiedene Fixierungs- und Färbeverfahren zu bewerten, um ihre Leistung und Stabilität für jedes neue Probenset zu beurteilen.Nach der Sortierung können weitere Ansätze wie Ampliconsic Fencing, Metagenomik und Proteomik angewendet werden, um die Top-Gemeinschaften auszuwählen, die Informationen über die protogenetische Zugehörigkeit zu Aktivitätszuständen abseits von Stoffwechselwegen liefern. Diese Methode ebnete den Weg für mikrobielle Ökologen und Bioverfahrenstechniker, die Dynamik des Mikrobioms, natürliche und kontrollierte Ökosysteme mit einem vernünftigen Einsatz von Ressourcen zu verfolgen.

characterizing-microbiome-dynamics-flow-cytometry-based-workflows

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere...

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll zur Bewertung der Verfügbarkeit organischer und anorganischer Nährstoffe sowie der Häufigkeit und Struktur von mikrobiellen und viralen Gemeinschaften in abgelegenen Meeresumgebungen.

Entwirren der unsichtbaren Spieler im Ozean - ein Feld Führer zu Wasserchemie und Marine Mikrobiologie

Mikrobenpopulationen enthalten, die wesentliche Zellheterogenität, das allgemeine Verhalten diktieren können. Molekulare Sonde Analyse durch Durchflusszytometrie können physiologische Zustände von Zellen zu bestimmen, aber ihre Anwendung variiert zwischen den Arten. Diese Studie liefert ein Protokoll, um genau zu bestimmen, Zellmortalität innerhalb von einem Cyanobakterium Bevölkerung, ohne zu unterschätzen oder Aufzeichnungs falsch positiven Ergebnissen.

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Mittels Durchflusszytometrie

Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

Durchbruchskurven (BTCs) sind effiziente Werkzeuge, um den Transport von Bakterien in porösen Medien zu untersuchen. Hier stellen wir Werkzeuge auf Basis von Fluidgeräten in Kombination mit Mikroskopie und Zytometrischer Durchflusszählung vor, um BTCs zu erhalten.

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Wir beschreiben hierin eine einfache Analyse der Heterogenität des murinen Immun-B-Zell-Kompartiments im Peritoneum-, Milz- und Knochenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie. Das Protokoll kann angepasst und auf andere Mausgewebe ausgedehnt werden.

Durchflusszytometrische Charakterisierung der Entwicklung von Murinen B-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Richtlinie für den Aufbau und die quantitative Überwachung von Co-Kulturen, einschließlich photoautotropher zuckersezernierender Cyanobakterien und heterotropher Hefen.

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Wir bieten eine Technik an, um intaktes Baumphloem zu erhalten und es für die Beobachtung vorzubereiten.  Wir entwickeln eine Apparatur namens Phloem-Sandwich, die die Einführung und Beobachtung von Arthropoden, Mikroben und anderen Organismen ermöglicht, die Phloemgewebe bewohnen.

Technik zur Untersuchung Gliederfüßer und Mikrobielle Gemeinschaften im Baum Tissues

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Analyse von Mikrobiomdynamiken in Reinkulturen und natürlichen Gemeinschaften. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht Forschern die schnelle Überwachung mikrobieller Ökosysteme.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

Weitere Videos entdecken