Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Ziel dieses Verfahrens ist es, Biomoleküle wie DNA oder Proteine, die mit organischem Fluor markiert sind, in lebenden Mikroorganismen mit Hilfe einer auf Elektroporation basierenden Methode zu internalisieren und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem elektrokompetente Zellen zunächst mit fluoreszenzmarkierten Biomolekülen inkubiert werden, bevor sie in eine Elektroporationsstation überführt werden. Durch das Anlegen einer hohen Spannung über den Vete ermöglichen transiente Porenbildungen sowohl an der Zellwand als auch an der Zellmembran eine biomolekulare Diffusion in die Zellen.

Anschließend werden die Zellen in einem reichhaltigen Medium inkubiert, damit sie sich erholen können, bevor die überschüssigen, nicht internalisierten Biomoleküle entfernt werden. Schließlich werden die Zellen auf ein Kissen mit geringer Fluoreszenz mit minimalem Nährstoffaufkommen übertragen, und dann wird ein Glasdeckglas darüber gelegt, um ein Glas-Agro-Sandwich zu bilden. Letztendlich wird die Essenzmikroskopie verwendet, um den Ort, das Diffusionsmuster und die dynamischen Eigenschaften der markierten Biomoleküle in den lebenden Zellen zu analysieren.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir die Grenzen der Lebendzellbildgebung erkannten. Aufgrund des schnellen Glitchings von photofluoreszierenden Proteinen wie GFP kamen wir zu dem Schluss, dass wir durch die Beladung lebender Zellen mit Biomolekülen, die mit organischer Fluorkraft markiert sind, lebende Mikroorganismen transplantieren würden. Die Hauptvorteile dieser Kraft sind Helligkeit, Fotostabilität und geringe Größe.

Wir hoffen dann, die Lokalisierung und Diffusion von DNA oder Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung auf viel längeren Zeitskalen verfolgen zu können, was vielen wichtigen biologischen Prozessen entsprechen würde. Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Mikroinjektion, besteht darin, dass sie auch auf Mikroorganismen angewendet werden können, die kleiner sind als der Durchmesser einer typischen Mikroinjektionsnadel. Ein weiterer Vorteil der Elektroporation besteht darin, dass eine große Anzahl von Zellen gleichzeitig mit fluoreszierenden Biomolekülen beladen werden kann und diese parallel sichtbar gemacht werden können, was die Elektroporation zu einer besonders augendurchsatztechnischen Technik macht.

Obwohl diese Methode einen Einblick in das Diffusions- und Dynamikverhalten von fluoreszenzmarkierten Biomolekülen in vivo geben kann, kann sie auch in anderen Zusammenhängen angewendet werden, z. B. auf Elektroden-Biomoleküle, die nicht markiert sind, aber sie kann beispielsweise eine physiologische Reaktion auslösen, wenn sie von der Zelle internalisiert wird. Um Arös-Pads für Bakterien oder Hefe-Fluoreszenzmikroskopie zu konstruieren, beginnen Sie mit der Herstellung von etwa zwei x niedrig fluoreszierenden Medien, Schmelzen Sie dann umgehend eine Lösung von 2%Aros in destilliertem Wasser mit einer Labormikrowelle. Geben Sie ein passendes Volumen der heißen HA-Rose in das Medium und pipettieren Sie die Mischung vorsichtig auf und ab. Um Blasenbildung zu vermeiden, pipettieren Sie sofort etwa 200 Mikroliter der entstandenen Mischung auf ein Mikroskop-Deckglas in Standardgröße.

Lassen Sie den Deckglas eine Minute lang bei Raumtemperatur auf der Bank, bis sich das Gel verfestigt oder vorübergehend gelagert wird. Legen Sie einen zweiten gereinigten Deckglas über das frische Pad und üben Sie vorsichtig Druck von oben aus, um die Eierrose einzuflassen, beginnend mit einem Vorrat fluoreszierender Biomoleküle, die in einem Puffer mit geringer Ionenstärke hergestellt wurden. Übertragen Sie bis zu fünf Mikroliter der Biomoleküle entweder in ein 20-Mikroliter-Aliquot kompetenter Bakterien oder in 50 Mikroliter kompetenter Hefezellen. Die Menge der fluoreszierenden Biomoleküle, die mit den Zellen inkubiert werden, korreliert direkt mit der Menge der pro Zelle internalisierten Biomoleküle.

Nach der Elektroporation die Mischung bis zu 10 Minuten auf Eis inkubieren. Wählen Sie gleichzeitig einen Elektroporationsprüfstand mit entsprechendem Elektrodenabstand und kühlen Sie ihn auf Eis. Die Zellmischung in das vorgekühlte Vete geben.

Klopfen Sie ein paar Mal vorsichtig auf die Vete, um alle Blasen aus der Lösung zu entfernen. Entfernen Sie mit einem Papiertuch jegliche Feuchtigkeit aus dem Vete und legen Sie den Vete in den Elektroator. Legen Sie unmittelbar nach diesem Vorgang einen Hochspannungsimpuls an die Zellen an.

Stellen Sie sicher, dass die auf dem Elektroator angezeigte Zeitkonstante zwischen vier und sechs Millisekunden liegt. Niedrigere Zeitkonstanten sind oft auf das Vorhandensein von überschüssigem Salz oder Blasen innerhalb des qve zurückzuführen und können die Aufnahme von Biomolekülen in die Zellen verringern oder ganz hemmen. Höhere Spannungsimpulse verbessern die Zellbeladung, können aber auch die Lebensfähigkeit der Zellen unmittelbar nach der Elektroporation beeinträchtigen.

Fügen Sie 500 Mikroliter Rich Media hinzu und geben Sie die Zellen in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Zellmembran sich erholen, indem Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius oder Hefe bei 29 Grad Celsius für zwei bis 10 Minuten inkubieren. Nach dem Einbau des Biomoleküls und der Wiederherstellung des Wachstums schleudern Sie die Zellen eine Minute lang in einer vier Grad Celsius vorgekühlten Zentrifuge und verwerfen Sie das Rückenlagemittel Reese.

Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Puffer und wiederholen Sie die Suspensionsvorgänge zum Schleudern und Entfernen sowie zur Pufferreanimation. Noch drei Mal. Diese Waschschritte entfernen alle Spuren von nicht internalisierten Biomolekülen aus der Zellsuspension.

Im Falle des markierten Proteins erfolgt die Internalisierung und der zusätzliche Reinigungsschritt durch Pipettieren der Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit einem 0,22-Mikron-Membranfilter ausgestattet ist. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation vom Puffer und stellen Sie sicher, dass genügend Flüssigkeit über dem Filter verbleibt, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern, und verwerfen Sie die Durchflussfraktion. Geben Sie unterhalb des Filters 500 Mikroliter frisches PBS über die Zellen und wiederholen Sie die Kombination aus einem Spin-Down und einer frischen PBS-Ausgabe.

Noch zwei Mal. Führen Sie einen letzten Spin-Down bei 3.300 G für eine Minute durch. Um die vorherige PBS-Wäsche zu entfernen, suspendieren Sie die Zellen erneut mit 150 Mikrolitern PBS.

Entfernen Sie abschließend den oberen Abdeckschub von dem zuvor angefertigten aros Pad. Laden Sie die Zellen auf das Pad, indem Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension tropfenweise pipettieren. Nach dem Auflegen eines neuen gereinigten Deckglases auf das arose pad sind die Sandwichzellen nun bereit für die Fluoreszenzmikroskopie.

Negativkontrollen, wie z. B. nicht bewertete Kontrollen, die mit markierten Biomolekülen inkubiert wurden, oder leere Zellen, die weder elektrisch bewertet noch inkubiert wurden, sollten ebenfalls parallel zu allen geladenen Proben hergestellt werden. Beladene Zellen können auf jedem geeigneten Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden. Während der Weitfeld-Imaging-Modus die Bildgebung und Analyse auf Zellebene ermöglicht, ist Rasen oder hohe niedrige Beleuchtung oder optimal für die Beobachtung und Verfolgung einzelner Moleküle. Um ein übermäßiges Photobleichen der Biomoleküle zu verhindern, stellen Sie bitte sicher, dass alle Laserbeleuchtungen auf der Bühne vor dem Laden der Probe ausgeschaltet oder mit einem undurchsichtigen Filter blockiert werden.

Schalten Sie außerdem die Kameraverstärkung der E-M-C-C-G aus, um eine Überbelichtung der Kamera zu vermeiden. Für einen inversen Mikroskopaufbau legen Sie das Aris-Pad-Sandwich mit der mit der Zelle bedeckten Seite nach unten zum unteren Objektiv hin auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie dann das Halogenlicht auf der Oberseite ein und bringen Sie die Zellen im Weißlicht-Durchlichtmikroskopie-Modus in den Fokus, bevor Sie den Laser einschalten, und fotografieren Sie die Zellen im Weißlicht-Transmissionsmodus.

Dieses Foto wird als Positionsreferenzkarte verwendet, die zwischen Regionen biomolekularer Fluoreszenz mit den tatsächlichen Positionen von Zellen innerhalb desselben Sichtfelds korreliert. Verwenden Sie für die Viabilitätsmessung eine Objektivheizung, die auf die optimale Temperatur eingestellt ist, und nehmen Sie alle 30 Minuten sequenzielle Bilder desselben Sichtfelds unter Weißlichtbeleuchtung auf, ohne den Tisch zu bewegen, schalten Sie die obere Oberseitenbeleuchtung aus und schützen Sie Ihre Probe vor allen anderen Umgebungslichtquellen im Labor. Schalten Sie dann die CCD-Kamera ein und beginnen Sie mit der Datenerfassung.

Starten Sie die Aufnahme des Fluoreszenzions, kurz bevor Sie die Laserbeleuchtung einschalten. Beginnen Sie nach der Fluoreszenzmikroskopie mit der Datenanalyse, indem Sie alle Fotos mit einer Bildverarbeitungssoftware wie Image J öffnen, um alle grundlegenden Bildparameter wie Helligkeit oder Kontrast über alle Bilder hinweg zu normalisieren, indem Sie die Set-Taste drücken und die Option "Auf alle anderen Bilder übertragen" auswählen. Option eins kann qualitativ feststellen, ob die Zellbeladung erfolgreich war, da beladene Zellen signifikant heller sein sollten als die nicht elektroporierten Zellen, die als Negativkontrolle für ein gegebenes Bild verwendet wurden.

Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug mit der freien Hand und kreisen Sie verschiedene Fluoreszenzbereiche mit handgezeichneten Polygonen ein. Vergleichen Sie die Fluoreszenzintensität aller relevanten Polygone, indem Sie die Messoption aus dem Analysemenü auswählen. Wiederholen Sie diesen Vorgang manuell oder mit einem automatisierten Skript, um die Intensität pro Pixel aller Zellen in jeder Probe und den Negativkontrollen zu extrahieren.

Wenn eine elektrobewertete Zelle mit einem oder mehreren fluoreszierenden Biomolekülen beladen ist, ist ihre durchschnittliche Emissionsintensität größer als die durchschnittliche Intensität einer negativen Kontrollprobe. Um die Lebensfähigkeit der Zellen manuell zu bewerten, zählen Sie den Prozentsatz der intakten Teilung durch nicht teilende und beschädigte Zellen. Im selben Sichtfeld, für das alle 30 Minuten Daten über mehrere Teilungen aufgezeichnet wurden, ist es nicht immer möglich, die Anzahl der pro Zelle internalisierten Biomoleküle direkt zu zählen, insbesondere wenn die Biomoleküle schnell diffundieren oder wenn Zellen mit mehr als fünf markierten Biomolekülen beladen sind.

Die zellbasierte Photobleaching-Analyse ermöglicht die Bewertung der Anzahl der markierten Biomoleküle pro Zelle unter solchen Bedingungen. Zeichnen Sie mit der Freihand-Auswahltaste den Umriss einer bestimmten Fluoreszenzzelle nach und extrahieren und plotten Sie die Rohzellfluoreszenz als Funktion der Zeit aufgrund von Photobleicheffekten. Das Intensitäts-Zeit-Diagramm wird eine exponentiell abnehmende Kurve sein, die stark belasteten Zellen, aber für Zellen, die weniger als 10 Biomoleküle enthalten, sollten klare Schritte unterscheidbar sein.

Berechnen Sie die durchschnittliche Autofluoreszenz nach dem Photobleichen, indem Sie den Mittelwert der Rohfluoreszenzintensitätswerte in der Nähe des flachen Endabschnitts des Experiments bilden, der z. B. aus den letzten 50 bis 100 Bildbildern in der Zeitrafferserie stammen kann. Nachdem Sie auch die Basisintensität bestimmt haben, berechnen Sie die zeitabhängige Photobleichintensität, indem Sie die Basislinien-Autofluoreszenz von den Rohfluoreszenzdaten subtrahieren, dann die resultierenden Photobleichintensitätsdaten blockieren und die Höhe jedes Schritts manuell oder mit einem Algorithmus quantisieren. Dieser Vorgang sollte für mehrere Zellen mit insgesamt mehr als 100 Schritten wiederholt werden, um eine genaue Schätzung der durchschnittlichen Stufenhöhe zu erhalten, dieser Wert entspricht der einheitlichen Fluorvierintensität aufgrund des Ausbleichens eines einzelnen Fluorviers.

Schließlich kann die Anzahl der internalisierten Moleküle pro Zelle berechnet werden, indem die subtrahierte Zellintensität der Basislinie zum Zeitpunkt gleich Null durch das unitäre Fluor dividiert wird. Vier Intensitäten für dieses Elektroporationsprotokoll. Die Menge an fluoreszenzmarkierter DNA oder Protein, die in Bakterien oder Hefen internalisiert werden kann, kann durch Anpassen der Menge an DNA-Sonden im Elektroporationspuffer gesteuert werden.

Wenn die biomolekulare Internalisierungsrate hoch ist, gibt die Photobleichlebensdauer des markierten Biomoleküls, die ermittelt werden kann, indem zuerst die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit aufgetragen und dann seine exponentielle Zeitkonstante extrahiert wird, Informationen über die Photostabilität der Farbstoffe in vivo. Im Falle niedriger Inkorporationsraten bietet die Quantisierung der Fluoreszenzintensität ein Mittel zur Annäherung an die Gesamtzahl der Biomoleküle innerhalb einer gegebenen Zelle. Die Elektroporation kann auch verwendet werden, um Proteine in Bakterien oder Hefen einzubauen.

Im Fall von fluoreszenzmarkiertem Protein. Da freie Fluorophore selbst sehr effizient internalisiert werden können, ist es wichtig, alle überschüssigen freien und nicht kovalent gebundenen Fluorophore aus dem Proteinbestand zu entfernen. Schließlich können auch doppelt markierte Moleküle mit unserer Methode internalisiert werden, um die Beobachtung einzelner Moleküle in lebenden Zellen über mehrere Sekunden zu ermöglichen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, auch daran zu denken, die Kontrollproben vorzubereiten und zu analysieren, wie z. B. Nicht-Elektrozellen, die mit einem markierten Biomolekül inkubiert werden, oder leere Zellen, die weder elektroporiert noch mit einem markierten Molekül inkubiert sind. Diese Kontrollen ermöglichen es uns, den Grad der Zellautofluoreszenz und den Mangel an Waschschritten zu bewerten, und sind daher notwendig, um zu beurteilen, ob das Elektroporationsexperiment nach seinen Entwicklungen erfolgreich war. Diese Technik eröffnete Forschern auf dem Gebiet der Biophysik und der dritten Biologie neue Wege, um die Diffusion und das dynamische Verhalten von markierten Biomolekülen in lebenden Mikroorganismen zu erforschen.

Und das auf einer Zeitskala, ein bis zwei Größenordnungen länger als bei autofluoreszierenden Proteinen wie GFPs. Es übertrug die Flexibilität der organischen d-Markierung in vivo und machte Einzelmolekül-Bedrohungsexperimente für die Untersuchung der intra- und intermolekularen Dynamik in lebenden Zellen viel praktikabler.