Name: Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Synthese superparamagnetischer Eisenoxid-Nanopartikel zur Zellmarkierung und magnetischen Steuerung. Diese Methode ermöglicht präzises Targeting und Sortieren von Zellen für biomedizinische Anwendungen.

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Die Autoren danken der Danksagung für die Finanzierung durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung – FNUSA-IKRK (Nr. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), dem American Heart Association Scientist Development Grant (AHA #06-35185N) und den National Institutes of Health (NIH #T32HL007111).

1. Synthese von Magnetit Gel <ol><li> Durch Verwendung konzentrierter Salzsäure gefolgt von entionisiertem Wasser, gefolgt von Ethylalkohol Waschen Sie alle Glaswaren. Trocknen lassen O / N, vorzugsweise in einem Trockenofen. VORSICHT! Chlorwasserstoffsäure ist schädlich - persönliche Schutzausrüstung tragen und die Arbeit in einer Abzugshaube; Ethylalkohol schädlich ist - persönliche Schutzausrüstung tragen. </li><li> Verwenden Sie einen Dreschelflasche durch sanft blubbernden N 2 -Gas 30 Minuten entgasen 500 ml entionisiertem H 2 O. </li><li> Set-up die Magnetit Synthesevorrichtung in einem Chemieabzug benutzen. <ol><li> Legen Sie einen 500 ml Dreihalsrundkolben, der innerhalb einer Heizhaube Heizung und sichern Sie den Mittelhals mit einer Schelle und Ständer. </li><li> Installieren einer Gummimembran in eine der Seitenhälse des Rundkolben und einem Rückflußkühler mit einem Gummiseptum in den verbleibenden Seitenhals. Dauerbetrieb Kaltwasser durch die Rückflusskühler. </li><li> Puncture the Rundkolben von Gummiseptum mit einer Nadel mit einem N 2 -Gas-Leitung verbunden und Durchstoß der Rückflußkühler Gummiseptum mit einer Nadel mit einer Gasleitung laufen, um eine Waschflasche verbunden (dh Kolben mit Wasser), um Gasaustritt zu visualisieren. </li><li> Installieren Sie ein Stechpaddel ins Zentrum Hals des Rundkolben, der über ein Paddel-Adapter. Bringen Sie die Klinge Paddel die Welle auf einem Rührwerk auf ein Stativ montiert. </li></ol></li><li> Spülen Rundkolben, der mit N 2 -Gas und verlassen N 2 -Gas bei einem niedrigen, aber nachweisbaren Rate fließt. </li><li> Entfernen Sie die Rückflusskühler aus dem Rundkolben und fügen 1,000 g Eisen (III) -chlorid, 0,6125 g Eisen (II) -chlorid-Tetrahydrat, und 50 ml entgastem H 2 O. VORSICHT! Eisen (III) -chlorid und Eisen (II) -chlorid-Tetrahydrat schädlich sind - persönliche Schutzausrüstung tragen. </li><li> Ersetzen Sie die Rückflusskühler und rühren bei 1000 Upm unter Erwärmen auf 50° C. Rühren unter diesen Bedingungen produziert 10 nm Durchmesser Magnetit-Nanopartikel. </li><li> Einmal bei 50 ° C, mit 10 ml 28% iger Ammoniumhydroxidlösung durch Einspritzen durch das Gummiseptum in den Rundkolben gegeben, während noch gerührt. VORSICHT! Ammoniumhydroxid ist schädlich - persönliche Schutzausrüstung tragen. HINWEIS: Die Ammoniumhydroxidlösung verwendet, um die Magnetit ausgefällt und die Lösung sollte schwarz. </li><li> Die Gummischeidewand und N 2 Gasleitung aus dem Rundkolben und Erhitzen auf 90 ° C zum Sieden aus dem Ammoniakgas während noch gerührt. Anmerkung: Es ist optional, um den Fluss von N 2 in den Rundkolben durch Punktieren der Rückflußkühler Gummiseptum beizubehalten, jedoch ist die Oxidation von Magnetit Maghemit während dieser Stufe vernachlässigbar. </li><li> Nachdem bei 90 ° C, 1 ml der Ölsäure zu dem Rundkolben, während immer noch gerührt. Die Ölsäure wird zum Beschichten der Magnetit napartikel Magnetit Gels. VORSICHT! Ölsäure ist schädlich - persönliche Schutzausrüstung tragen. </li><li> Ersetzen Sie die Gummimembran und N 2 Gasleitung auf den Rundkolben, und nehmen Sie die Rückflusskühler. </li><li> Schalten Sie die Hitze und rühren bei 500 Upm für 2 Stunden. </li><li> Den Rundkolben zu entfernen aus dem Isomantel Heizung und dekantieren restliche Flüssigkeit, während mit einem starken Magneten gegen den Boden des Kolbens, um die Magnetit-Gel zu behalten statt. VORSICHT! Griff der starken Magneten mit äußerster Vorsicht, um Schäden oder Verletzungen zu vermeiden. </li><li> Erlauben Magnetit-Gel an der Luft trocknen O / N (optional). </li></ol> 2. Reinigung von Magnetit Gel <ol><li> In 40 ml Hexan in den Rundkolben, um die Magnetit-Gel auflösen VORSICHT! Hexan schädlich ist - persönliche Schutzausrüstung tragen und die Arbeit in einem Abzug. </li><li> Verwenden einen Scheidetrichter mit 40 ml entgastem H 2 O, um restliches H 2 O zu entfernen from die Magnetit-Lösung. <ol><li> Gießen Sie langsam die Magnetit-Lösung auf die H 2 O im Scheidetrichter und schwenken Sie die Zwei-Phasen-Flüssigkeit für 5 Minuten. </li><li> Ablassen und entsorgen Sie die untere wässrige Fraktion. </li><li> Langsam 40 ml entgastem H 2 O in die Trenntrichter, so dass er siedelt unter dem Magnetit-Lösung und leicht schwenken und Drain wie zuvor. </li><li> Wiederholen, um ein drittes Mal zu waschen. </li></ol></li><li> Bringen Magnetit-Lösung, um einen Erlenmeyerkolben, fügen Sie ein paar Spatel im Wert von wasserfreiem Natriumsulfat, und wirbeln, um alle verbleibenden Rest H 2 O aus dem Magnetit-Lösung zu entfernen. </li><li> Filtern der Magnetit-Lösung durch 1 &amp; mgr; m-Filterpapier in einem Filtertrichter, um das Natriumsulfat und restliches H 2 O zu entfernen HINWEIS: Vakuum-Unterstützung empfohlen. </li><li> Übertragen des Magnetits Lösung auf eine 50 ml Verdampferkolben und mit einem Rotationsverdampfer, um das Hexan zu verdampfen2 h unter den folgenden Bedingungen: moderate Drehzahl, Vakuum angelegt, Verdampferkolben in einem 50 ° C Wasserbad, und 24 ° C Wasserzirkulations durch den Kondensator. HINWEIS: Wahlweise speichern die Magnetit-Gels vor der mit PLGA Beschichtung. </li></ol> 3. Beschichtung von Magnetit-Nanopartikel mit PLGA Shell <ol><li> Aufzulösen 3,60 g PLGA (75/25 Gemisch) in 240 ml Ethylacetat, um eine 1,5% (m / v) Lösung zu schaffen. ACHTUNG: Ethylacetat schädlich ist - persönliche Schutzausrüstung tragen und die Arbeit in einem Abzug. </li><li> Aufzulösen 25,00 g Pluronic F-127 in 500 ml entgastem H 2 O unter Verwendung eines Magnetrührers, um eine 5,0% (m / v) Lösung zu schaffen. HINWEIS: Pluronic F-127 ist ein nicht-ionisches amphiphiles Blockcopolymer, das als biokompatibles Tensid wirkt. Es hilft, die Öl-in-Wasser-Emulsion in Schritt 3.3.2 stabilisieren. </li><li> Unter Verwendung eines Mikros, sammeln die Magnetit-Gel in sechs 0,040 g-Proben im gewogenen Glasfläschchen. Perform die folgende Beschichtung und Waschprozess für jedes Aliquot. HINWEIS: Die Aliquots erforderlich, effiziente Handhabung und magnetisches Dekantieren, die Reinheit und die Ausbeute zu maximieren, wird bei gleichzeitiger Minimierung Abbau vor der Gefriertrocknung der in Schritt 4 zu gewährleisten. <ol><li> Fügen Sie ein 0.040 g Aliquot der Magnetit-Gel und 40 ml des PLGA-Lösung, um einen Kunststoffbecher und beschallen in einem Ultraschall-Reiniger für 10 Minuten. </li><li> 80 ml der Pluronic Lösung der Kunststoffbecher gegossen und sofort mit einem Labormischer emulgieren bei der höchsten Einstellung für 7 Minuten, um die PLGA-Beschichtung auf den magnetischen Nanopartikel als eine Öl-in-Wasser-Emulsion zu bilden. </li><li> Unmittelbar verdünnen SPION-Lösung in 1 l deionisiertem H 2 O und beschallen 1 h in einer chemischen Abzugshaube, um das Ethylacetat zu verdampfen. </li><li> Legen Sie einen starken Magneten neben dem SPION-Lösung und rühren Sie bis bräunlich SPIONs am Magnet zu sammeln. Hinweis: Es kann notwendig sein, um Unterbrechungen für mehrere Stunden rührens vor der Lösung wird weißlich anzeigt, dass die meisten der SPIONs wurden gesammelt. </li><li> Man dekantiert die wäßrige Lösung unter Beibehaltung der SPIONs in das Becherglas mit den Magneten. </li><li> Wie folgt dreimal waschen Sie die SPIONs. <ol><li> Suspendieren die SPIONs in 1 l deionisiertem H 2 O. </li><li> Beschallen den SPION-Lösung für 20 Minuten. </li><li> Legen Sie einen starken Magneten neben dem SPION-Lösung und rühren Sie bis bräunlich SPIONs am Magnet zu sammeln. Es kann notwendig sein, um intermittierend rühre mehrere Stunden, bevor die Lösung klar wird das anzeigt, daß die meisten der SPIONs wurden gesammelt. </li><li> Man dekantiert die wäßrige Lösung unter Beibehaltung der SPIONs in das Becherglas mit den Magneten. </li></ol></li></ol></li><li> Sammeln Sie die SPIONs aus jeder der sechs Magnetit-Gel-Aliquoten synthetisiert in einem einzigen gewogenen Glasfläschchen als wässrige Suspension. Optional dekantieren überschüssiges Wasser magnetisch, wie gebraucht. </li></ol> 4. Freeze--TROCKENTUNNEL der SPIONs <ol><li> Frieren Sie den SPION-Lösung. </li><li> Gefrierzutrocknen den SPION Lösung O / N in einer Gefriertrocknungsanlage. </li><li> Wiegen die gefriergetrockneten SPIONs. Gefriergetrocknete SPIONs kann bei -20 ° C gelagert, bis sie zur Markierung von Zellen verwendet werden. HINWEIS: Lagerung bei -20 ° C drastisch reduziert Abbaukinetik und erhöht die Haltbarkeit. </li></ol> 5. Markierung von Zellen mit SPIONs <ol><li> Aussetzung eines Aliquots SPIONs in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einer Konzentration von 40 mg / ml und mit Ultraschall 30 Min. </li><li> Fügen SPION Lösung auf eine fast konfluente Kolben mit Zellen bei einer Konzentration von 5 &amp; mgr; l / ml Zellkulturmedium. Stellen Sie sicher, gleichmäßige Verteilung durch sanftes Schütteln der Flasche. </li><li> Die Zellen für 16 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Vorsichtig absaugen Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. </li><li> Sammeln magnetisch markierten Zellen und verwenden für Experimente. </li><li> Unbenutzte SPION Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden und sollte unsinnerhalb von wenigen Monaten ed. Beschallen 30 Minuten vor jedem Gebrauch. </li></ol>

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<li>Sun, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+labeling+of+endothelial+progenitor+cells+isolated+from+peripheral+blood+with+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro labeling of endothelial progenitor cells isolated from peripheral blood with superparamagnetic iron oxide nanoparticles.</a> Mol Med Rep. 6 (2), 282-286 (2012).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+viability+of+transplanted+beta+cells+labeled+with+a+novel+contrast+agent+-+polyvinylpyrrolidone-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Detection of viability of transplanted beta cells labeled with a novel contrast agent - polyvinylpyrrolidone-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by magnetic resonance imaging.</a> Contrast Media Mol Imaging. 7 (1), 35-44 (2012).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+efficacy+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+to+human+neural+stem+cells%3A+comparison+of+ferumoxides%2C+monocrystalline+iron+oxide%2C+cross-linked+iron+oxide+%28CLIO%29-NH2+and+tat-CLIO%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Labeling efficacy of superparamagnetic iron oxide nanoparticles to human neural stem cells: comparison of ferumoxides, monocrystalline iron oxide, cross-linked iron oxide (CLIO)-NH2 and tat-CLIO.</a> Korean J Radiol. 8 (5), 365-371 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wie bei jedem Nanopartikelsynthese-Protokoll, die Reinheit der Reaktionschemikalien ist kritisch zur Erzielung einer hohen Qualität SPIONs das minimale zytotoxische Effekte haben wird. Es ist daher wichtig, um sehr reine Reagenzien einschließlich Ölsäure (≥99%), Eisen (II) -chlorid-Tetrahydrat (≥99.99%), Eisen (III) -chlorid (≥99.99%), Ethylacetat kaufen (HPLC-Qualität, ≥99.9% ), Hexan (HPLC grade, ≥97.0%) Ammoniumhydroxid (≥99.99%) und Natriumsulfat (≥99.0%). Es ist von besonderer Bedeutung für sehr reine und hochwerti...

Die gezielte Abgabe und das Einfangen von Zellen an bestimmte Stellen im Körper ist für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen wünschenswert. Die Abgabe von neuralen Stammzellen an das Gehirn mittels MRT-gesteuertem fokussiertem Ultraschall wurde als mögliche Behandlungsoption für neurodegenerative Erkrankungen, traumatische Hirnverletzungen und Schlaganfälle vorgeschlagen1. Mesenchymale Stammzellen werden aufgrund ihrer natürlichen tumortropischen Eigenschaften auf ihre Fähigkeit untersucht, Krebsmedikamente an Tumore zu verabreichen2,3. Kardiale Stammzellen wurden als mögliche Behandlung des Myokardinfarkts an das Herz abgegeben4,5. Vaskuläre Stents wurden mit CD34-Antikörpern entwickelt, um zirkulierende Vorläuferzellen einzufangen6. Diese Zell-Targeting-Ansätze sind zwar vielversprechend, weisen aber auch Nachteile auf, darunter mangelnde Zellspezifität, inkonsistente Zellretention und Off-Target-Zellabgabe.
Das übergeordnete Ziel der aktuellen Methode ist es, das magnetisch gerichtete Targeting von Zellen für eine Vielzahl von Zellzufuhr- und Sortieranwendungen zu ermöglichen. Magnetic Targeting ermöglicht die kontrollierte Verabreichung spezifischer Zellen an einen bestimmten Zielort mit minimalen Off-Target-Effekten7. Die Magnetfelder können durch implantierte oder externe Vorrichtungen erzeugt werden, um die Bewegung magnetisch markierter Zellen innerhalb des Körpers sicher zu lenken8. Zahlreiche Forschungsbemühungen konzentrierten sich auf das magnetisch gerichtete Targeting von Stammzellen auf verletzte Gewebe wie das Herz9-14, die Netzhaut15, die Lunge16, die Haut17, das Rückenmark18,19, den Knochen20, die Leber21 und den Muskel22,23, um die Regenerationsergebnisse zu verbessern.
Das magnetische Targeting von Zellen wurde auch ausgiebig als Mittel zur Endothelisierung implantierbarer kardiovaskulärer Geräte untersucht. Ein gleichmäßiges und vollständiges Endothel bildet eine Barriere zwischen dem Gerät und den zirkulierenden Blutelementen, um Thrombosen und Entzündungen zu mildern. Endothelzellen können entweder vor der Implantation oder über das Gefäßsystem nach der Implantation an das Gerät abgegeben werden. In beiden Fällen werden Magnetfelder verwendet, um Zellen an der Oberfläche des Geräts einzufangen und die Zellen zu halten, wenn sie der Scherbelastung ausgesetzt sind, die durch zirkulierendes Blut erzeugt wird. Zu diesem Zweck wurden sowohl die magnetischen Gefäßstents24-27 als auch die Gefäßtransplantate28 hergestellt und getestet.
Das Targeting magnetischer Zellen erfordert eine Strategie zur Markierung von Zellen mit magnetischen Trägerpartikeln. Diese Partikel können über Antikörper oder Liganden-Rezeptor-Paare an die Oberfläche von Zellen gebunden oder in die Zellen endozytiert werden. Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) sind biologisch abbaubar, biokompatibel und können von einer Vielzahl von Zelltypen leicht endozytiert werden29. Diese Partikel machen eine Zelle effektiv reaktionsfähig für Magnetfelder und werden im Laufe der Zeit auf natürliche Weise abgebaut. SPIONs bieten eine einfache und sichere Möglichkeit zur magnetischen Markierung von Zellen in Kultur für eine Vielzahl von magnetischen Ziel- und Sortieranwendungen. Es wird ein Verfahren zur Synthese von SPIONs mit einem Magnetitkern (Fe3O4) und einer Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Hülle bereitgestellt. Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Markierung von Zellen in Kultur mit SPIONs bereitgestellt.

<table><tbody><tr><td>Ammoniumhydroxidlösung, 28 % NH3 in H2O, &ge; 99,99% Spurenmetallbasis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818-100ML&nbsp;</td><td>Schädliches Reagenz - tragen Sie persönliche Schutzausrüstung</td></tr><tr><td>Dreschel Flasche, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>5516-16</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat, CHROMASOLVR Plus, für HPLC, 99,9%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650528-1L</td><td>Schädliches Reagenz - persönliche Schutzausrüstung tragen und im Abzug</td></tr> arbeiten <tr><td>Ethylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Schädliches Reagenz - persönliche Schutzausrüstung tragen</td></tr><tr><td>Verdampferkolben, 50 ml, 24/40 Schliff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z515558</td><td>Zur Verwendung mit Rotoverdampfer</td></tr><tr><td>Filterpapier, Ø 3 cm, Klasse 1</td><td>Fisher</td><td>09-805P</td><td>Zur Verwendung mit Glasfiltertrichter</td></tr><tr><td>Glasbecher, 1 L</td><td>Fisher</td><td>FB-101-1000</td><td>Zum Waschen von SPIONs</td></tr><tr><td>Glasfiltertrichter, Vakuumschlauchadapter, passend für 24/40, 30 mL</td><td>Fisher</td><td>K954100-0344&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchenkappen</td><td>Fisher</td><td>03-391-46</td><td>Zur Verwendung mit Glasfläschchen</td></tr><tr><td>Glasfläschchen, 2 ml</td><td>Fisher</td><td>03-391-44</td><td>Zum Sammeln von Magnetitgel & SPIONs</td></tr><tr><td>Hexan, CHROMASOLVR, für HPLC, &ge; 97.0% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34859-1L&nbsp;</td><td>Schädliches Reagenz - tragen Sie persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie im Abzug</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Schädliches Reagenz - tragen Sie persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie im Abzug</td></tr><tr><td>Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat &ge; 99,99 % Spurenmetallbasis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024-5G</td><td>Schädliches Reagenz - tragen Sie persönliche Schutzausrüstung</td></tr><tr><td>Eisen(III)-chlorid wasserfrei, Pulver, &ge; 99,99% Spurenmetallbasis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451649-1G</td><td>Schädliches Reagenz - tragen Sie persönliche Schutzausrüstung</td></tr><tr><td>Isomantle-Heizer, 500 mL</td><td>Voight Global</td><td>EM0500/CEX1</td><td></td></tr><tr><td>Labormischer</td><td>Silverson</td><td>L5M-A</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisator</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospatel</td><td>Fisher</td><td>21-401-25A</td><td>Zum Übertragen von Magnetit </td></tr><tr><td>Gel NdFeB Magnet, 1 Zoll x 1 Zoll x 1 Zoll</td><td>Amazing Magnets</td><td>C1000H-M</td><td>Sehr starker Magnet, vorsichtig mit</td></tr><tr><td>Ölsäure umgehen &ge; 99% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G&nbsp;</td><td>Im Gefrierschrank aufbewahren; Schädliches Reagenz - persönliche Schutzausrüstung tragen</td></tr><tr><td>Überkopfrührer</td><td>IKA</td><td>2572201</td><td></td></tr><tr><td>Überkopfrührklemme</td><td>IKA</td><td>2664000</td><td>Zur Verwendung mit Überkopfrührer Überkopfrührer</td></tr><tr><td>H-Ständer</td><td>IKA</td><td>1412000</td><td>Zur Verwendung mit Überkopfrührer</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbecher, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>02-591-28</td><td></td></tr><tr><td>PLGA PURASORB PDLG (75/25 Mischung)</td><td>Purac</td><td>PDLG 7502</td><td>PDLG 7502A kann ebenfalls verwendet werden; </td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Pulver, BioReagenz, geeignet für Zellkultur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PTFE expandierbares Schaufelpaddel, 8 mm</td><td>Ø SciQuip</td><td>SP4018</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Gefäßadapter, passend für 24/40, 8 mm Durchmesser</td><td>Paddel Monmouth Scientific</td><td>PTFE Gefäßadapter A480</td><td>Zur Verwendung mit PTFE expandierbarem Schaufelpaddel</td></tr><tr><td>Umlaufkühler</td><td>Clarkson</td><td>696613</td><td>Zur Verwendung mit Rotoverdampfer</td></tr><tr><td>Reflux Kondensator, passend für 24/40, 250 mm</td><td>Ace Glass</td><td>5997-133</td><td></td></tr><tr><td>Rotoverdampfer</td><td>Clarkson</td><td>216949</td><td></td></tr><tr><td>Gummisepten, passend für 24/40</td><td>Ace Glass</td><td>9096-56</td><td></td></tr><tr><td>Scheidetrichter mit Stopfen, 250 ml</td><td>Fisher</td><td>10-438E</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfat ACS Reagenz, &ge; 99.0%, wasserfrei, granuliert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313-500G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dreihalsiger Rundkolben, abgewinkelt, 24/40 Schliffe, 500 ml</td><td>Ace Glass</td><td>6948-16</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger perforierte Pfanne</td><td>Fisher</td><td>15-335-20A</td><td>Zur Verwendung mit Ultraschallreiniger</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger, 2,8 L</td><td>Fisher</td><td>15-335-20</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumregler</td><td>Clarkson</td><td>216639</td><td>Zur Verwendung mit Rotationsverdampfer (optional)</td></tr><tr><td>Vakuum Pumpe</td><td>Clarkson</td><td>219959</td><td>Zur Verwendung mit Rotoverdampfer</td></tr></tbody></table>

zellmarkierung und targeting mit superparamagnetische eisenoxid-nanopartikel

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Die gezielte Abgabe von Zellen und therapeutische Mittel bei einer Vielfalt von biomedizinischen Anwendungen durch die Konzentration der therapeutischen Wirkung an der Zielstelle zu minimieren, während nachteilige Wirkungen auf off-Zielstellen zur Verfügung. Magnetischen Zell-Targeting ist eine effiziente, sichere und unkomplizierte Lieferung Technik. Superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel (SPION) sind bioabbaubar, biokompatibel, und kann in die Zellen durch Endozytose um sie auf Magnetfelder anspricht übertragen werden. Das Syntheseverfahren beinhaltet das Erstellen Magnetit (Fe 3 O 4) Nanopartikel durch Hochgeschwindigkeits-Emulgierung, gefolgt, um ein Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) Beschichtung zu bilden. Die PLGA-Magnetit SPIONs sind ca. 120 nm Durchmesser, einschließlich der etwa 10 nm Durchmesser Magnetitkernteilchen. Wenn in einem Kulturmedium platziert werden SPIONs natürlich von Zellen Endozytose und als kleine Cluster innerhalb zytoplasmatischen Endosomen gespeichert. Diese Partikel verleihen ausreichende magnetische Masse zu den Zellenum für die Ausrichtung im magnetischen Feldern zu ermöglichen. Zahlreiche Zellsortierung und Targeting-Anwendungen werden von Rendering verschiedenen Zelltypen auf Magnetfelder reagiert, aktiviert. SPIONs haben eine Vielzahl von anderen biomedizinischen Anwendungen sowie einschließlich der Verwendung als ein medizinisches Bildgebungskontrastmittel, gezielte Arzneimittel oder Genabgabe diagnostischen Assays und die Erzeugung von lokaler Hyperthermie zur Tumortherapie oder Gewebe Löten.

Magnetitnanopartikeln sind ungefähr 10 nm im Durchmesser infolge Rühren eine wässrige Lösung von Eisen (III) -chlorid und Eisen (II) -chlorid-tetrahydrat bei 50 ° C und 1000 rpm (Abbildung 1). Diese Ergebnisse zeigen, gelungene Synthese aus Magnetit-Nanopartikel. Es ist wichtig, die Größe und die Form der magnetischen Nanopartikel aus einer kleinen Probe der Charge entnommen, wenn man versucht, die Synthese zum ersten Mal zu überprüfen. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist die bevorzugte Methode...

Gezielte Zellverabreichung ist nützlich in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) zur Markierung von Zellen zu verwenden und dadurch magnetische Zell-Targeting-Ansätze für ein hohes Maß an Kontrolle über die Zellabgabe und -lokalisierung zu ermöglichen.

Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel herzustellen und diese Partikel zur Zellmarkierung für magnetische Anreicherung und Sortierungsanwendungen zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst 10 Nanometer durchmessende Magnetit-Nanopartikel synthetisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Magnetit-Nanopartikel mit einer 50 Nanometer dicken Hülle aus Polylactid-co-Glycolid (PLGA) zu beschichten.Anschließend werden die magnetischen Nanopartikel gewaschen und gefriergetrocknet. Der letzte Schritt besteht in der Markierung von Zellen mit magnetischen Nanopartikeln für Anwendungen in der Zellzielgerichtetheit und -sortierung. Schließlich wird die gezielte Anreicherung magnetisch markierter Zellen in magnetischen Feldern mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Antikörper-vermittelten Zellzielung besteht darin, dass die magnetische Zellzielung äußerst spezifisch und kontrollierbar ist. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie einer Vielzahl medizinischer Erkrankungen, da therapeutische Zellen gezielt an den Wirkort gebracht werden können, während nicht betroffene Bereiche geschont bleiben. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da eine sorgfältige Beachtung der Details erforderlich ist, um reine und hochwertige Nanopartikel zu erhalten.Wir wollten die gezielte Ansteuerung und Lokalisierung lebender Zellen im Körper verbessern. Beginnen Sie damit, mithilfe einer Dreßler-Flasche 500 Milliliter deionisiertes Wasser zu entgasen, indem Sie 30 Minuten lang vorsichtig Stickstoffgas durchperlen lassen. Um die Reaktionsapparatur aufzubauen, stellen Sie einen 500-Milliliter-Dreihals-Rundkolben in eine ISO-Mantelheizung.Danach eine Flaschenhals&ouml;ffnung mit einem Gummiseptum verschlie&szlig;en und in die andere einen R&uuml;ckflussk&uuml;hler einsetzen. K&uuml;hlwasser kontinuierlich durch den K&uuml;hler leiten, um eine inerte Atmosph&auml;re f&uuml;r die Reaktion zu schaffen. Zuerst das Gummiseptum des Kolbens mit einer Nadel durchstechen, die an eine Stickstoffgasleitung angeschlossen ist.Dann durchstechen Sie die Septe des Kondensators mit einer Nadel, die mit einem Blasenzähler verbunden ist, um den Gasaustritt sichtbar zu machen. Anschließend setzen Sie ein Rührflügel-Pedal mit einem Paddel-Adapter in den mittleren Hals ein. Um eine konstante Rührung der Reaktionsmischung aufrechtzuerhalten, verbinden Sie die Rührwelle mit einem über Kopf angebrachten Rührer, der an einem Stativ montiert ist.Spülen Sie das Kolben mit Stickstoffgas und lassen Sie Stickstoff mit einer niedrigen, aber nachweisbaren Rate in das Kolben strömen. Entfernen Sie dann den Rückflusskühler und geben Sie ein Gramm Eisen(III)-chlorid, 612,5 Milligramm Eisen(II)-chlorid-tetrahydrat und 50 Milliliter entgastes Wasser hinzu. Setzen Sie den Kühler wieder ein und rühren Sie die Reaktion bei 1000 U/min, während Sie auf 50 Grad Celsius erwärmen.Dadurch entstehen Magnetitpartikel mit einem Durchmesser von 10 Nanometern. Sobald die Reaktion 50 Grad Celsius erreicht hat, 10 Milliliter 28%ige Ammoniumhydroxidlösung mit einer Spritze durch das Septum des Kolbens injizieren. Während das Magnetit ausfällt, sollte sich die Lösung schwarz färben.Entfernen Sie die Gummiseptum und die Gasleitung und erhitzen Sie die Reaktion auf 90 Grad Celsius. Geben Sie anschließend ein Milliliter Ölsäure zum Kolben, um die Nanopartikel zu beschichten und das Magnetitgel zu bilden. Danach ersetzen Sie das Septum und die Gasleitung am Kolben und entfernen den Kühler.Schalten Sie die Heizung aus und rühren Sie die Reaktion zwei Stunden lang mit 500 U/min. Nach dem Rühren gießen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab, während Sie die Nanopartikel mit einem starken Magneten am Boden des Kolbens festhalten. Zum Beginn der Reinigung lösen Sie zunächst das Magnetitgel in 40 Milliliter Hexan auf.Geben Sie diese Lösung langsam in einen Trenntrichter, der 40 Milliliter entgastes Wasser enthält, und schwenken Sie den Trichter fünf Minuten lang vorsichtig. Nach dem Schwenken dekantieren Sie die untere wässrige Phase, und waschen Sie die Magnetit-Lösung anschließend noch zweimal auf die gleiche Weise mit entgastem Wasser. Überführen Sie danach die Magnetit-Lösung in einen Erlenmeyerkolben.Trocknen Sie die Lösung, indem Sie mehrere Spatelspitzen Natriumsulfat hinzufügen und die Mischung schwenken. Anschließend vakuumieren. Filtern Sie die Mischung durch ein Filterpapier mit einer Porenweite von einem Mikrometer. Stellen Sie die Wassertemperatur eines Rotationsverdampfers auf 50 Grad Celsius ein, wobei 24 Grad Celsius kaltes Wasser durch den Kühler zirkuliert. Überführen Sie anschließend das Filtrat in einen 50-Milliliter-Verdampferkolben und verdampfen Sie das Hexan zwei Stunden lang bei mäßiger Rotationsgeschwindigkeit unter Vakuum. Sammeln Sie das Magnetitgel in sechs Glasgefäßen jeweils als 40-Milligramm-Aliquot; die Beschichtung und das Waschen erfolgen separat für jeden Aliquot. Geben Sie einen Aliquot des Gels zusammen mit 40 Millilitern PLGA in Ethylacetat in einen Plastikbecher und beschallen Sie die Mischung 10 Minuten lang. Fügen Sie anschließend 80 Milliliter onic F1 27 zum Becher hinzu und emulgieren Sie sofort sieben Minuten lang bei hoher Stufe mit einem Mixer. Diese Nanopartikel sind nun superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel oder SPION; verdünnen Sie die Lösung mit einem Liter entionisiertem Wasser und behandeln Sie sie eine Stunde lang im Abzug mit Ultraschall. Bringen Sie danach einen starken Magneten neben die Lösung und rühren Sie vorsichtig um, um die SPION am Magneten zu sammeln.Decantieren Sie die wässrige Lösung, wobei die S-Triebe im Becher zurückbehalten werden. Waschen Sie die S-Triebe dreimal mit Wasser, wobei jedes Mal gewaschen wird. Nachdem alle sechs Aliquote beschichtet und gewaschen wurden.Sammeln Sie die S-Triebe in einer einzelnen Glasvial. Gefriertrocknen Sie das Spy-on-Reagenz über Nacht in einem Lyophilisator, um die Zellmarkierung vorzubereiten. Suspendieren Sie zunächst Pyon in PBS mit einer Konzentration von 40 Milligramm pro Milliliter und behandeln Sie die Suspension 30 Minuten lang mit Ultraschall.Fügen Sie anschließend die Lösung einem Kolben mit nahezu konfluenten Zellen in einer Konzentration von fünf Mikrolitern pro Milliliter Zellkulturmedium hinzu. Schwenken Sie den Kolben, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen 16 Stunden lang.Bei 37 Grad Celsius. Das Kulturmedium vorsichtig abpipettieren und die Zellen anschließend zweimal mit PBS waschen. Die magnetisch markierten Zellen können nun für Experimente verwendet werden.Magnetit-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 10 Nanometern können konsistent hergestellt werden, indem man eine wässrige Lösung aus Eisen(III)-chlorid und Eisen(II)-chlorid-tetrahydrat bei 50 Grad Celsius und 1000 U/min umrührt. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Partikelgröße. Die Beschichtung der Magnetit-Nanopartikel mit PLGA unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Emulgiergeräts führt reproduzierbar zu PLGA-Magnetit-S-Kügelchen mit einem Durchmesser von 120 Nanometern. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) wird zur Visualisierung dieser Partikel verwendet. Die Inkubation von aus dem Blut stammenden endothelialen Zellen mit Pyon für 16 Stunden führt mittels TEM zu einer Endozytose der Nanopartikel. Die PLGA-Magnetit-Nanopartikel können in der Zelle sichtbar gemacht werden, wo sie innerhalb zytoplasmatischer Endosomen gespeichert sind.Die Aufnahme von Eisen in die Zellen ist ausreichend hoch, um eine magnetische Anreicherung lebensfähiger Zellen an ferromagnetischen implantierbaren medizinischen Geräten zu ermöglichen. Magnetsmarkierte Endothelzellen werden von einem ferromagnetischen Stent stärker angezogen als von einem nichtmagnetischen Stent. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jegliches Glas- und Gerätewerk gründlich zu waschen, um die Reinheit und Sicherheit der Nanopartikel nach diesem Verfahren zu maximieren.Andere Methoden wie das magnetische Zell-Targeting können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche medizinischen Therapien von einer gezielten und kontrollierten Zellabgabe profitieren können. Diese magnetische Targeting-Technologie soll die Entwicklung einer fokussierten Zellabgabe für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen ermöglichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man supraparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel synthetisieren und diese Partikel verwenden kann, um Zellen für Anwendungen des magnetischen Targetings zu markieren.

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Forschung

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