Name: Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie die dreidimensionale Quantifizierung dendritischer Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht präzise morphologische Analysen neuronaler Synapsenstrukturen.

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Diese Arbeit wurde gefördert durch das Institut Pasteur, die Bettencourt-Schueller-Stiftung, das Centre National de la Recherche Scientifique, die Universität Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), der Conny-Maeva Charitable Foundation, der Cognacq Jay Foundation, der Orange Foundation und der Fondamental Foundation. L.G. wird durch ein Stipendium des Gesundheitsministeriums unterstützt. Wir danken BitPlane, insbesondere Georgia Golfis, für die Hilfe in der Anfangsphase dieser Arbeit.

1. Neuronale Kultur Hinweis: Fibroblast Umprogrammierung in pluripotente Stammzellen, die Verpflichtung zu der dorsalen Telencephalon Abstammung, Abstammung, Amplifikation und Banken der späten kortikalen Vorläuferzellen (LCP) wurden in BOISSART et al 4 beschrieben. Neuronale Differenzierung von LCP-ähnlichen Zellen wurde ebenfalls nach BOISSART et al 4 mit leichten Modifikationen durchgeführt. Andere Verfahren sind für direkten Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen gefolgt von deren Differenzierung in Neuronen entwickelt. Dieses Protokoll wurde beibehalten, da es die selektive Herstellung von pyramiden glutamatergen Neuronen. <ol><li> Gönnen 6-Well-Kulturplatten mit Deckgläschen mit Poly-Ornithin (1/6 in DPBS verdünnt, Lager-Konzentration 0,01%) O / N gefolgt von drei Wäschen in DPBS. Dann fügen Laminin (Stammkonzentration 1 mg / ml, in DPBS verdünnt 500 mal) für mindestens 10 Stunden unter der Flow-Haube<html> . </li><li> Platte und Versand NSC bei niedriger Dichte (50.000 Zellen / cm 2) in 6-Well-Kulturplatten mit Deckgläschen in 3 ml Kulturmedium, bestehend aus DMEM / F12 (500 ml), 2 Fläschchen (je 5 ml) von N2 zu ergänzen, 2 Fläschchen (jeweils 10 ml) von B27 Supplement, 10 ml Pen-Streptomycin (Penicillin = 10.000 Einheiten / ml und Streptomycin = 10.000 Einheiten / ml), 1 ml 2-Mercaptoethanol (Stammlösung: 50 mM) und Laminin (1 / 500) ohne Wachstumsfaktoren. Entscheidender Schritt: Führen Sie diesen Schritt vorsichtig durch Zugabe von Zellen, die mit langsamen Drehbewegungen um Zellclusterbildung zu reduzieren. </li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium. Add frischen N2B27 Medium, das 2 &amp; mgr; g / ml frischem Laminin-Lösung, um das Neuron auf den Deckgläsern befestigt zu halten und Klumpenbildung zu vermeiden. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage. Halten einige der verbleibenden Medium (200 ul) vor der Zugabe von frischem Medium, um die Zelle vor dem Trocknen zu verhindern. Alternativ gehen Sie schnell und ändern Sie das Gesamtvolumen (3 ml). </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. Lentivirale Transduction Hinweis: GFP lentiviralen Vektoren wurden freundlicherweise von Dr. Uwe Maskos Labor am Institut Pasteur (Paris) zur Verfügung gestellt und nach der veröffentlichten Protokoll 5 hergestellt. GFP-Expression durch die Maus Phosphoglyceratkinase (PGK) Promotor angetrieben. Für diese Studie wurde von 400 ng / ul (Stammlösung in PBS 1x) Virustiter. <ol><li> Transduktion menschlicher iPSC abgeleiteten Neuronen in jeder Stufe der Reifung von Viruspartikeln durch Zugabe von 1 ul der Stammlösung, die 40 ng des GFP lentiviralen Vektor pro Kulturvertiefung (6-Well-Platten) und Inkubation für 48 Stunden in frischem Kulturmedium. Hinweis: Bei diesem Protokoll wird die Dauer der Inkubation ermöglicht eine gute Kennzeichnung von Wirbelsäulenstrukturen. </li></ol> 3. Immunfluoreszenz Anmerkung: Um die Kennzeichnung der gesamten Wirbelsäule Morphologie zu verbessern, wurde Immunfluoreszenz-Markierung unter Verwendung eines anti-GFP-Antikörper in permeabilisierten Bedingungen. </p&gt; <ol><li> Entfernen Kulturmedium und fixieren transduzierten Zellen auf Deckgläsern in 4% Paraformaldehyd für 10 min bei RT, dann waschen 3 Mal in 1x PBS (jeweils 10 Minuten). </li><li> Immerge Deckgläser in PBS, ergänzt mit 0,05% Triton (100x) und 10% Pferdeserum, 1 h bei RT, dann 3 x waschen in 1x PBS. </li><li> 100 ul 1x PBS, ergänzt mit 4% Pferdeserum und primärem Antikörper (1 / 1.000) gegen GFP angehoben und um einen Faktor von 1,000 auf jedem Deckglas verdünnt. Inkubieren in einer dunklen Box O / N bei 4 ° C, dann waschen 3 Mal mit 1x PBS. </li><li> Verdünnter Alexa Fluor 488-konjugiertem Antikörper (1/200) in PBS, ergänzt mit 0,5% Tween 20 und Inkubation für 1 h bei RT. Dann waschen 3 Mal in 1x PBS und montieren Deckgläser auf Glasobjektträger mit Eindeckmittel für die Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol> 4. dendritischen Dorn Imaging <ol><li> Führen konfokale Bildgebung durch ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. </li><li> Wählen Sie gesunde Neuronen mit pyramidenförmigen Morphologie einnd eine vollständige dendritischen Verzweigung, und zu quantifizieren, mindestens 10 Neuronen pro Bedingung aus getrennten Versuchen. Quantifizierung von 60 bis 100 &amp; mgr; m pro Dendriten. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit einem 40x Öl NA = 1.3 Objektiv und eine 488 nm Laserlinie für die GFP-Anregung mit einer typischen Spitzenleistung auf Sample-Ebene etwa 20 &amp; mgr; W. Set Pixelgröße etwa 80 nm, um richtig zu probieren dendritischen Dornen. Hinweis: Die nachfolgende Analyse Forderung nach einem Bild, in dem der Lärm nicht die richtige Segmentierung von Dendriten und Dornen zu kompromittieren. Mit den genannten räumlichen Abtastung und Leistungseinstellung, haben wir beobachtet, dass ein Pixel-Verweilzeit von 3,15 &amp; mgr; s ist ausreichend, um genügend Photonen auf ein solches Bild aufbauen zu sammeln. Für trübe Proben, kann die Bildqualität durch Mittelung 2-4 Scans verbessert werden. Die Übernahme von mehreren XY Fliesen erforderlich sein, um den interessierenden Bereich, die dann vor der Verarbeitung zusammengenäht werden, zu decken. </li><li> Zur Probe das gesamte Neuronenvolumen, eine Z-Stapel zu erwerben, miteine Z Abstand im Bereich von 150 nm bis 300 nm, wodurch 20 bis 30 Z-Scheiben. Hinweis: Die laterale räumliche Auflösung mit diesen Einstellungen wird erreicht, 234 nm und die axiale Auflösung von 591 nm. Die hier gewählte Abtastrate ist ausreichend, aber die axiale Auflösung größer ist als die kleinste Größe der Stacheln abzubildenden die Analyse begünstigt die Stacheln, die sich seitlich von den Dendriten erstrecken. </li></ol> 5. 3D-Quantifizierung von dendritischen Dornen Anmerkung: Die folgenden Abschnitte beschreiben speziell die Verwendung des Imaris Software für die Analyse. Alternative Implementierungen gibt, einschließlich NeuronStudio 15 oder Metamorph 8, die ähnliche Ergebnisse liefern kann. Verwenden Sie die folgenden Tasteneinstellungen: <ol><li> Als Vorverarbeitungsstufe, verwenden Gauss-Filterung durch die Bildverarbeitungseinrichtungen von der Software angeboten. Führen Gauss-Filterung über die Bildverarbeitung&gt; SmooSache&gt; Gauß-Filter. Stellen Sie die Filterbreite gleich der Pixelgröße in XY sein. </li><li> Führen Sie eine halbautomatische Rückverfolgung von Dendriten, mit dem Filament Tracer-Modul der Software. <ol><li> Zunächst schätzen den Dendriten Durchmesser, durch eine Distanz Tool auf der Registerkarte Scheibe der Software. </li><li> In der Registerkarte Surpass, klicken Sie auf den Fäden Werkzeug. Für eine bessere Robustheit, stützt sich dieses Protokoll auf halbautomatischen Spurhaltung; klicken Sie auf Weiter automatische Erstellung. Die Modulschnittstelle zeigt nun die Registerkarte ziehen. Wählen Sie hier AutoPath als eine Methode, Dendrite als eine Art, und geben Sie die geschätzten Dendriten Durchmesser. </li><li> Verwenden Sie den Auswahlmodus des Zeigers, drehen Sie den Cursor in eine Box. Umschalt-Rechtsklick auf den Dendriten Ausgangspunkt. Hinweis: Die Software führt ersten Berechnungen. </li><li> Bewegen Sie den Mauszeiger entlang der Dendriten. Vom Ausgangspunkt (vertretened als blaue Kugel), eine gelbe Linie, die die wahrscheinlichste Dendriten Pfad gezeigt. Umschalt-Linksklick auf den Dendriten Endpunkt. </li></ol></li><li> Führen Sie die automatische Stacheln Segmentierung. Hinweis: Die Stacheln auf dem Dendriten zurückzuführen sind, die von der Modulschnittstelle automatisch gefunden. <ol><li> In der Modulschnittstelle, klicken Sie auf die Registerkarte Erstellen. In der Rebuild der Dropdown-Liste, wählen Sie Rebuild Dendrite Durchmesser und überprüfen Sie die Fried Feld. Klicken Sie dann auf Neu erstellen. </li><li> Stellen Sie den Schwellenwert, so dass der segmentierte Volumen entspricht dem aktuellen Dendriten Volumen. Als ein Algorithmus, wählen Kürzeste Entfernung Entfernung Karte. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. </li><li> Bestimmen Sie die kleinste Wirbelsäule Kopfdurchmesser und die maximale Länge, erneut unter Verwendung des Abstands Tool auf der Registerkarte Scheibe der Software, dann wieder auf die Registerkarte Surpass kommen und geben Sie die Parameter. Foder dieses Protokoll, Werte um 200 bis 300 nm für minimale Durchmesser und 4 &amp; mgr; m für die maximale Länge sind gute Ausgangspunkte. Aktivieren Sie das Allow Niederlassung Spines Feld. Klicken Sie auf Weiter. </li><li> Stellen Sie die Seed-Punkte Threshold so dass die blauen Punkte, die Stacheln zu lokalisieren, um tatsächlichen Wirbelsäule Köpfe. Klicken Sie auf Weiter. Hinweis: Die Eckpunkte für die Berechnung ist nun fertig und kann langwierig sein. </li></ol></li><li> Klassifizieren Stacheln, indem Sie auf der Registerkarte Extras der Modulschnittstelle. Klicken Sie auf Classify Spines. In der Sie dazu aufgefordert Benutzeroberfläche, stellen Sie sicher, dass es vier Klassen, von ihrer Morphologie wie folgt definiert: Stubby: Länge &lt;1 &amp; mgr; m; Pilz: Länge (Wirbelsäule)&gt; 3 und Max Breite (Kopf)&gt; bedeuten Breite (Hals) x 2; Lange dünne: Mittlere Breite (Kopf) ≥ mittlere Breite (Hals); Filopodien artig: Länge ≤ 4 &amp; mgr; m (ohne Kopf). Hinweis: Die modul Schnittstelle erzeugt vier neuen Filament Objekte enthält die Ergebnisse der Klassifizierung. </li><li> Export Statistische Daten: auf jeder dieser vier Objektschnittstellen, auf die Registerkarte Statistik zu gehen. Klicken Sie auf die Export Alle Statistiken to Datei. Hinweis: Weitere statistische Werte können für Dendriten exportiert werden (. ZB Länge, Fläche, mittlerer Durchmesser, Zweigtiefe, Verzweigungswinkel, Lautstärke, etc.) Und für die Stacheln (zB Geradheit, Bereich der Befestigung, Länge und Volumen der verschiedenen Wirbelsäulenteile, Wirbelsäule Durchmesser, Dichte, etc.) </li></ol>

<ol><li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li>
<li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li>
<li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li>
<li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li>
<li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+beta+2%2A+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li>
<li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794(2011).</li>
<li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li>
<li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li>
<li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li>
<li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li>
<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Quantifizierung der morphologischen Merkmale der Pyramidenneuronen stützte sich auf die Software. Das Filament Tracer Oberfläche wurde für die Segmentierung von Neuronen und Dorne verwendet, und die XT-Modul wurde für die Analyse verwendet. Um die Genauigkeit der unsere Technik analysieren wir zunächst Vergleich der gemessenen morphologischen Parameter (Länge, Fläche, und die Gesamtmenge der Wirbelsäule, wenn zutreffend), mit denen veröffentlichte unter Verwendung von Ratten reife Pyrami...

Dendritischen Dornen kortikaler Pyramidenzellen sind klein und dünn Vorsprüngen, die entlang der basalen und apikalen Dendriten dieser neuronalen Subtypen in Nagetier, Primaten und menschliche Gehirn verteilt sind. Sie sind die Websites der meisten Synapsen und Anzeige Tastenfunktionen beim Lernen und kognitive Prozesse. Die detaillierten Strukturen der menschlichen dendritischen Dornen wurden technisch durch Elektronenmikroskopie 2 untersucht. Allerdings ist eine solche Vorgehensweise zeitaufwendig und stellt hohe Arbeitsbelastung. In jüngerer Zeit hat eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Morphologie der dendritischen Dornen in menschlichen Hirnrinde mit spezifischer Software kombiniert werden, um große manuelle Wirbelsäulenanalyse 3 gemeldet. Green Fluorescence Protein (GFP) Technologie, um Immun gekoppelt stellt ein genaues Werkzeug für die Wirbelsäulen Identifizierung und Formmessung durch Fluoreszenzmikroskopie. Diese Vorgehensweise kann leicht an kultivierten Neuronen angewendet werden. However, haben keine Angaben über die Analyse der Wirbelsäule Reifung und Morphologie auf die menschliche Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) abgeleitet gemeldet. Das Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll, das dendritischen Dorn Abbildungs ​​aus kultivierten menschlichen Nervenzellen in vitro ermöglicht beschreiben. GFP-Markierung, die konfokale Mikroskopie und 3D-Analyse mit dem Filament Tracer-Modul von Imaris Software wurden in dem vorliegenden Protokoll verwendet. Kultur Schritte, die erforderlich sind, um kortikale glutamatergen Neuronen der Schichten II bis IV von neuralen Stammzellen (NSC) zu erhalten sind, sind auch hier kurz beschrieben. Das gesamte Protokoll für den menschlichen NSC Produktion hat bereits an anderer Stelle 4 veröffentlicht.

<table><tbody><tr><td>D-PBS (1x), ohne Calcium, Magnesium und Phenol Rot</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Maus Laminin</td><td>Dutscher Dominique</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement ohne Vitamin A (50-fach)</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Med SFM</td><td>Gibco / Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco / Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Steptomycin</td><td>Gibco / Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GFP Kaninchenserum Polyklonaler Antikörper</td><td>Gibco / Life Technologies</td><td>A-6455</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen&nbsp;</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonales Anti-betaIII-Tubulin-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB9354</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 13 mm</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagenz mit DAPI</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20 Bioextra, viskose Flüssigkeit</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Humane Fibroblasten</td><td>Coriell Cell Line Biorepository</td><td>GM 4603 und GM 1869</td><td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss (Deutschland)</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane AG, Zürich</td><td>Version 6.4.0 Filament</td><td>Tracer und Imaris XT Module sind erforderlich</td></tr><tr><td>Huygens Software</td><td>Huygens Software, SVI, Niederlande</td><td>Pro-Version</td><td>Optional (für Dekonvolutionstests)</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale quantifizierung der dendritischen dornen von pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten stammzellen

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendriten sind kleine Vorsprünge, die mit den postsynaptischen Kompartimente von exzitatorischen Synapsen des zentralen Nervensystems zu entsprechen. Sie sind entlang den Dendriten verteilt sind. Ihrer Morphologie ist weitgehend abhängig von der neuronalen Aktivität, und sie dynamisch sind. Dendritenfortsätzen exprimieren glutamatergen Rezeptoren (AMPA und NMDA-Rezeptoren) auf ihrer Oberfläche und auf der Ebene der postsynaptischen Dichten. Jeder Dorn ermöglicht das Neuron seine staatlichen und lokalen Aktivität unabhängig zu steuern. Wirbelsäulen Morphologien wurden ausgiebig in glutamatergen Pyramidenzellen der Hirnrinde untersucht, wobei sowohl in-vivo-Ansätzen und neuronale Kulturen aus Nagetiergewebe erhalten. Neuropathologischen Bedingungen können zu veränderten Wirbelsäule Induktion und Reifung verbunden werden, weil in Nagetier kultivierten Neuronen und eindimensional quantitative Analyse. 1 gezeigt Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll für die 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien mit menschlichen Cortial Neuronen aus neuralen Stammzellen (späten kortikalen Vorläuferzellen) stammt. Diese Zellen wurden ursprünglich von pluripotenten Stammzellen erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der Wirbelsäule Morphologien bei unterschiedlichen Kulturperioden und mit möglichen Vergleich zwischen pluripotenten Stammzellen, die aus Kontroll-Individuen mit denen von Patienten mit psychiatrischen Erkrankungen erhalten wird.

<html> Die vorliegende Studie beschreibt ein standardisiertes Protokoll für die Wirbelsäule Quantifizierung der kultivierten Dendriten der Pyramidenzellen aus iPS abgeleitet. Dieses Protokoll erlaubt die Analyse der Wirbelsäule Reifung auf die menschliche Neuronen und ihre möglichen Vergleich mit der Reifung von Stacheln in Standard-Nagetier neuronalen Kulturen als auch in in vivo Tiermodellen. 1A stellt ein Schema der verschiedenen Schritte der Kultur, die die Produ...

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Dornen von peralen Neuronen, die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen stammen, abzubilden und sie in drei Dimensionen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem Deckgläser in Sechs-Loch-Platten zuerst mit Polyurethan und Laminin behandelt werden, um neuronale Stammzellen zu kultivieren. Anschließend werden neuronale Stammzellen in Kultur verdünnt.Die Zellen werden unter Verwendung einer sanften rotierenden Pipettierbewegung ausgesät und können bis zu 70 Tage lang in der Kultur differenzieren. Durch regelmäßige Erneuerung des Mediums werden die Zellen anschließend mit einem GFP-Lentivirus transduziert, mit anti-GFP-Antikörpern gefärbt und sichtbar gemacht. Abschließend werden die Kulturen fixiert und die dendritischen Dornen mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.Schließlich werden die Bilddaten menschlicher dendritischer Dornen in 3D rekonstruiert, um sie zu klassifizieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Gewinnung glutamaterger Neuronen der Schichten zwei bis vier der menschlichen Großhirnrinde. Es beinhaltet die Verwendung von neuronalen St

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Herstellung von Glasdeckgläsern, die mit Polyornithin und Laminin beschichtet sind, um die Adhäsion und das Wachstum von neuralen Stammzellen zu verbessern. Die Technik beinhaltet sequentielle Inkubationen und Waschungen, die die Bildung einer unterstützenden Matrix erleichtern, die das Wachstum und die Differenzierung der neuronalen Zellen fördert und die in den Neuronen gefundenen Strukturen nachahmt.

Generierung kortikaler Pyramidenneuronen aus humanen neuralen Stammzellen

Quelle: Gouder, et. al. Dreidimensionale Quantifizierung von dendritischen Dornen aus pyramidalen Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bildgebung und Analyse von dendritischen Dornen in transduzierten, immunmarkierten Pyramidenneuronen mittels konfokaler Mikroskopie. Hintergrundgeräusche werden reduziert und Dendriten werden durch Schätzung ihres Durchmessers und ihrer Länge verfolgt. Die automatisierte...

Quantifizierung dendritischer Dornen mittels konfokaler Mikroskopie

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Das Protokoll entwickelt ein dreidimensionales (3D) Modell eines dendritischen Segments mit dendritischen Stacheln zur Modellierung synaptischer Plastizität. Das konstruierte Netz kann zur rechnerischen Modellierung des AMPA-Rezeptorhandels in der langfristigen synaptischen Plastizität mit dem Softwareprogramm Blender mit CellBlender und MCell verwendet werden.

3D-Modellierung von Dendritischen Stacheln mit synaptischer Plastizität

Wir präsentieren ein Protokoll zur Kennzeichnung und Analyse pyramidaler Neuronen, das für die Bewertung potenzieller morphologischer Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln, die neurochemischen und verhaltensbedingten Anomalien zugrunde liegen können, entscheidend ist.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Dendritische Stacheln sind postsynaptische Kompartimente der meisten exzitatorischen Synapsen. Veränderungen der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule treten während der neurologischen Entwicklung, des Alterns, des Lernens und vieler neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen auf, was die Bedeutung einer zuverlässigen dendritischen Wirbelsäulenanalyse unterstreicht. Dieses Protokoll beschreibt die genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule...

Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Erfahren Sie die dreidimensionale Quantifizierung dendritischer Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht präzise morphologische Analysen neuronaler Synapsenstrukturen.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

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