Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dendritische Dornen aus peralen Neuronen abzubilden, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen stammen, und sie dreidimensional zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Deckgläser in Sechs-Well-Platten mit Polyurethan und Laminin für die Kultivierung neuraler Stammzellen behandelt werden. Als nächstes werden neurale Stammzellen in Kultur verdünnt.

Die Medien werden mit einer sanft rotierenden Pipettenbewegung plattiert und dürfen bis zu 70 Tage in Kultur differenziert werden. Durch regelmäßiges Erneuern des Mediums werden die Zellen mit GFP-Lentiviren transduziert, mit Anti-GFP-Antikörpern gefärbt und sichtbar gemacht. Schließlich werden die Kulturen fixiert und die dendritischen Dornen mit Hilfe der Konfokalmikroskopie abgebildet.

Letztendlich werden die Bilddaten der menschlichen dendritischen Dornen in 3D rekonstruiert, um sie zu klassifizieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zur Gewinnung glutamaterger Neuronen der Schichten zwei bis vier der menschlichen Hirnrinde. Dabei werden neurale Stammzellen verwendet, die aus humanen induzierten präpotenten Stammzellen gewonnen wurden, die aus menschlichen Fibroblasten stammen, basierend auf der zuvor veröffentlichten Methode.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden besteht darin, dass sie die automatische Segmentierung von DON rechts und PY in 3D ermöglicht. Dies mit einem spürbaren Zeitgewinn gegenüber bestehender Software, die in der Regel nur auf der Grundlage von 2D-Analysen erstellt. Der Donr und Spion in Klassifizierungen ist sehr praktisch und auch einfach zu bedienen.

Um neuronale Kulturen vorzubereiten, legen Sie Glasdeckel in sechs Well-Kulturschalen und fügen Sie Poly-Ornithin-Inkubation über Nacht unter einer Strömungshaube am nächsten Tag hinzu. Waschen Sie die Deckgläser mit DPBS dreimal und fügen Sie Laminin hinzu, das mindestens 10 Stunden lang unter einer Strömungshaube inkubiert wird. Bereiten Sie den Nährboden vor, der die folgenden Komponenten enthält.

Verwenden Sie dann das Medium, um neurale Stammzellen oder NSCS mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu plattieren und zu versenden. Pipettieren mit langsamen rotierenden Bewegungen, um die Zellclusterbildung zu reduzieren und menschliche IPSC-abgeleitete Neuronen zu transduzieren. Bei jedem Reifungsschritt wird ein Mikroliter einer Stammlösung mit 40 Nanogramm GFP-Lentivirusvektor pro Kulturvertiefung mit frischem Kulturmedium hinzugefügt und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Um die Zellen auf die Immunfluoreszenz vorzubereiten, entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die transduzierten Zellen mit 4 % Formaldehyd 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen dann mit einem XPBS dreimal für jeweils 10 Minuten. Tauchen Sie dann die Deckgläser in PBS, ergänzt mit 0,05 % Triton x 110 % Pferdeserum und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Deckgläser dann mit PBS dreimal.

Geben Sie einen 1000. GFP-Primärantikörper in 100 Mikrolitern PBS 4%-Pferdeserum auf jeden Deckglas. Inkubieren Sie über Nacht in einer dunklen Box bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie nun den konjugierten Antikörper Alexa Fluor 4 88 eins zu 200 in PBS 0,5%tween 20 und inkubieren Sie die Zellen mit der Antikörperlösung bei Raumtemperatur für eine Stunde, nachdem Sie PBS verwendet haben, um die Objektträger dreimal zu waschen.

Verwenden Sie ein Eindeckmedium, um die Objektträger für die Fluoreszenzmikroskopie zu montieren. Wählen Sie unter einem konfokalen Mikroskop mindestens 10 gesunde Neuronen pro Zustand mit einer Parametallmorphologie und einer gefalteten dendritischen Arborisierung aus, um 60 bis 100 Mikrometer pro Dendrit zu quantifizieren. Nehmen Sie Bilder mit einem 40 x na, 1,3 Ölobjektiv und einem 488-Nanometer-Laser mit einer typischen Spitzenleistung auf Probenebene von etwa 20 Mikrowatt auf, stellen Sie die Pixelgröße auf etwa 80 Nanometer ein, um die dendritischen Stacheln korrekt abzutasten.

Um das gesamte Neuronenvolumen zu beproben, erfassen Sie einen Z-Stapel mit einem Z-Abstand von 150 bis 300 Nanometern, was 20 bis 30 Z-Schichten ergibt, um eine 3D-Quantifizierung der dendritischen Dornen durchzuführen. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Analysesoftware für die Vorverarbeitung. Verwenden Sie die Gaußsche Filterung, indem Sie den Gaußschen Filter für die Bildverarbeitungsglättung auswählen.

Stellen Sie die Filterbreite auf die Pixelgröße in der XY-Ebene ein, um eine halbautomatische Verfolgung von Dendriten vom Filament-Tracer-Modul aus durchzuführen. Verwenden Sie auf der Registerkarte "Schnitt" das Abstandswerkzeug, um den Dendritendurchmesser zu schätzen. Klicken Sie anschließend auf der Registerkarte "Übertroffen" auf das Filamente-Werkzeug und wählen Sie "Automatische Erstellung überspringen", um die Robustheit zu verbessern Auf der Registerkarte "Zeichnen".

Wählen Sie nun den automatischen Pfad als Methode und den Dendriten als Typ aus und geben Sie den geschätzten Dendritendurchmesser ein. Drehen Sie den Cursor im Auswahlmodus des Zeigers in ein Feld, wählen Sie die Umschalttaste und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Startpunkt des Dendriten. Die Software führt erste Berechnungen durch.

Bewegen Sie nun den Zeiger vom Startpunkt aus entlang des Dendriten. Eine gelbe Linie, die den wahrscheinlichsten Dendritenweg darstellt, ist dargestellt. Drücken Sie die Umschalttaste und links.

Klicken Sie auf den Dendritenendpunkt, um eine automatische Spine-Segmentierung in der Moduloberfläche durchzuführen. Klicken Sie auf die Registerkarte "Erstellung" in der Dropdown-Liste "Erstellen". Wählen Sie Dendritendurchmesser neu aufbauen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Daten behalten.

Klicken Sie dann auf Neu erstellen. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass das segmentierte Volumen dem tatsächlichen Dendritenvolumen entspricht. Wählen Sie als Algorithmus die kürzeste Entfernung aus der Entfernungskarte aus.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Weiter unter dem Reiter Slice, bestimmen Sie die kleinste Wirbelsäule, den Kopfdurchmesser und die maximale Länge. Geben Sie dann auf der Registerkarte "Übertreffen" die Parameterwerte um 200 bis 300 Nanometer für den minimalen Durchmesser und vier Mikrometer für die maximale Länge ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter", ohne das Kontrollkästchen "Spines zulassen" zu aktivieren. Passen Sie als Nächstes den Schwellenwert für Kernpunkte so an, dass die blauen Punkte, die Spines darstellen, an den tatsächlichen Spine-Köpfen lokalisiert sind.

Klicken Sie dann auf Weiter. Die Kernberechnung wird nun durchgeführt und es kann einige Zeit dauern, bis die Wirbelsäulen klassifiziert sind. Klicken Sie auf der Registerkarte "Werkzeuge" der Moduloberfläche auf "Wirbelsäule klassifizieren". Nachdem überprüft wurde, ob es vier Klassen gibt, wie im Textprotokoll beschrieben, generiert die Modulschnittstelle vier neue Filamentobjekte mit den Ergebnissen der Klassifizierung

Exportieren Sie abschließend die statistischen Daten unter der Registerkarte Statistiken, indem Sie auf Alle Statistiken in Datei exportieren klicken. Diese Abbildung veranschaulicht die Kultur menschlicher Neuronen, die als Anti-Beta-3-Tubulin-Antikörper gekennzeichnet sind. Auch hier zeigt sich die Tendenz zur Zellclusterbildung.

Hier ist ein GFP-markiertes Parametall-Neuron 40 Tage nach der Differenzierung von einem späten kortikalen Vorläufer zu sehen. Von den oberflächlichen kortikalen Schichten. Der Einsatz zeigt eine geringere Vergrößerung mit dem scheinbaren Zellkörper.

Diese Tafeln stellen die 3D-Rekonstruktion von Segmenten dendritischer Dornen in verschiedenen Reifungsstadien dar. Die quantitative Analyse der Wirbelsäulendichte und des Wirbelsäulenkopfvolumens ist hier dargestellt. Erwartungsgemäß nehmen diese beiden Parameter über den Kulturzeitraum zu.

Während des Versuchs des Kulturverfahrens ist es wichtig, die Neurostammzellen sehr sorgfältig zu plattieren und zu versenden, indem die Zellen langsam mit einer sanften rotierenden Bewegung hinzugefügt werden, um das Zellcholin zu reduzieren. Diese Methode erfordert nämlich die Identifizierung einzelner Neuronen.