Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Dornen von peralen Neuronen, die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen stammen, abzubilden und sie in drei Dimensionen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem Deckgläser in Sechs-Loch-Platten zuerst mit Polyurethan und Laminin behandelt werden, um neuronale Stammzellen zu kultivieren. Anschließend werden neuronale Stammzellen in Kultur verdünnt.

Die Zellen werden unter Verwendung einer sanften rotierenden Pipettierbewegung ausgesät und können bis zu 70 Tage lang in der Kultur differenzieren. Durch regelmäßige Erneuerung des Mediums werden die Zellen anschließend mit einem GFP-Lentivirus transduziert, mit anti-GFP-Antikörpern gefärbt und sichtbar gemacht. Abschließend werden die Kulturen fixiert und die dendritischen Dornen mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Schließlich werden die Bilddaten menschlicher dendritischer Dornen in 3D rekonstruiert, um sie zu klassifizieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Gewinnung glutamaterger Neuronen der Schichten zwei bis vier der menschlichen Großhirnrinde. Es beinhaltet die Verwendung von neuronalen Stammzellen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen stammen, welche wiederum von menschlichen Fibroblasten abgeleitet sind, basierend auf einer zuvor veröffentlichten Methode.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu unseren bestehenden Methoden liegt darin, dass sie die automatische Segmentierung von DON rechts und PY in 3D ermöglicht. Dies bringt eine erhebliche Zeitersparnis gegenüber bestehenden Softwarelösungen mit sich, die in der Regel nur auf 2D-Analysen basieren. Die DONR- und SPY-Klassifizierungen sind außerdem sehr praktisch und einfach zu bedienen.

Um neuronale Kulturen vorzubereiten, legen Sie Glas-Deckgläser in Sechs-Loch-Kulturschalen und geben Polyornithin zu. Inkubieren Sie über Nacht unter einem Flussbrüschrank. Am folgenden Tag waschen Sie die Deckgläser dreimal mit DPBS und geben Laminin hinzu. Inkubieren Sie unter einem Flussbrüschrank für mindestens 10 Stunden. Bereiten Sie das Kulturmedium mit den folgenden Bestandteilen vor.

Verwenden Sie dann das Medium, um neuronale Stammzellen oder NSCS mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu plattieren und zu versenden, wobei langsame rotierende Pipettierbewegungen durchgeführt werden, um Zellagglomerationen zu reduzieren, um humane aus iPSCs abgeleitete Neuronen zu transduzieren. In jedem Reifungsschritt ein Mikroliter einer Stammlösung, die 40 Nanogramm GFP-Lentiviralvektor pro Kulturmulde mit frischem Kulturmedium enthält, hinzufügen und 48 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Zellen für die Immunfluoreszenz vorzubereiten, entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die transduzierten Zellen mit 4 % Formaldehyd bei Raumtemperatur für 10 Minuten.

Verwenden Sie anschließend einmal XPBS, um die Zellen dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen. Danach tauchen Sie die Deckgläser in PBS, das mit 0,05 % Triton X-100 und 10 % Pferdeserum ergänzt wurde, und inkubieren sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS.

Geben Sie einen tausendstel GFP-Primärantikörper in 100 Mikroliter PBS mit 4 % Pferdeserum auf jede Deckglasprobe. Inkubieren Sie die Proben über Nacht in einer dunklen Box bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie nun den mit Alexa Fluor 488 markierten Antikörper im Verhältnis 1:200 in PBS mit 0,5 % Tween 20 und inkubieren Sie die Zellen nach dreimaligem Waschen der Objektträger mit PBS eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit der Antikörperlösung.

Verwenden Sie Eindeckmedium, um die Objektträger für die Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten. Wählen Sie am konfokalen Mikroskop pro Bedingung mindestens 10 gesunde Neuronen mit einer parametralen Morphologie und einer verzweigten dendritischen Baumstruktur aus, um 60 bis 100 Mikrometer pro Dendrit zu quantifizieren. Nehmen Sie die Aufnahmen mit einem 40×-Ölimmersionsobjektiv (NA 1,3) und einem 488-Nanometer-Laser auf, wobei die typische Spitzenleistung auf Probeniveau etwa 20 Mikrowatt beträgt; stellen Sie die Pixelgröße auf etwa 80 Nanometer ein, um die dendritischen Dornen korrekt abzutasten.

Um das gesamte Neuronenvolumen abzutasten, erfassen Sie einen Z-Stack mit einem Z-Abstand von 150 bis 300 Nanometern, wodurch 20 bis 30 Z-Schnitte entstehen, um eine 3D-Quantifizierung dendritischer Dornen durchzuführen. Verwenden Sie für die Vorverarbeitung die folgenden Einstellungen in der Analyse-Software. Wenden Sie eine Gaußsche Filterung an, indem Sie im Bildverarbeitungsmodul den Gaußschen Glättungsfilter auswählen.

Stellen Sie die Filterbreite gleich der Pixelgröße in der XY-Ebene ein, um eine halbautomatische Verfolgung der Dendriten über das Filament-Verfolgungsmodul durchzuführen. Nutzen Sie im Reiter „Slice“ das Abstandswerkzeug, um den Dendritendurchmesser zu schätzen. Danach wechseln Sie im Reiter „Surpassed“ zum Filament-Werkzeug und wählen Sie im Zeichnungsreiter „Automatische Erstellung überspringen“, um eine bessere Robustheit zu erzielen.

Wählen Sie nun „Select Auto Path“ als Methode, „Dendrite“ als Typ aus und geben Sie den geschätzten Dendritendurchmesser ein. Nutzen Sie den Auswahlmodus des Zeigers, um den Cursor in eine Box umzuwandeln, und halten Sie die Umschalttaste gedrückt, während Sie mit der rechten Maustaste auf den Startpunkt des Dendriten klicken. Die Software führt daraufhin die ersten Berechnungen durch.

Bewegen Sie nun den Zeiger entlang des Dendriten ausgehend vom Startpunkt. Eine gelbe Linie, die den wahrscheinlichsten Dendritenverlauf darstellt, wird angezeigt. Drücken Sie Umschalttaste und links.

Klicken Sie auf den Dendriten-Endpunkt, um die automatisierte Spinen-Segmentierung in der Modulschnittstelle durchzuführen. Klicken Sie auf den Erstellungstab in der Dropdown-Liste „Rekonstruktion“. Wählen Sie „Dendritendurchmesser rekonstruieren“ und aktivieren Sie das Kontrollkästchen „Daten beibehalten“.

Dann auf „Rebuild“ klicken. Die Schwelle so einstellen, dass das segmentierte Volumen dem tatsächlichen Dendritenvolumen entspricht. Als Algorithmus „kürzeste Entfernung aus der Abstandskarte“ auswählen.

Danach klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“ unter der Registerkarte „Slice“ und bestimmen Sie den kleinsten Dorn, den Kopfdurchmesser und die maximale Länge. Danach wechseln Sie zur Registerkarte „Surpass“ und geben Parameterwerte von etwa 200 bis 300 Nanometern für den Mindestdurchmesser und vier Mikrometern für die maximale Länge ein, die gute Ausgangspunkte darstellen. Ohne das Kästchen „Spines erlauben“ anzukreuzen, klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“. Als Nächstes passen Sie die Schwellenwerte für die Startpunkte an, sodass die blauen Punkte, die die Dornen darstellen, tatsächlich auf den Dornenköpfen lokalisiert sind.

Klicken Sie dann auf Weiter. Die Hauptberechnung wird nun durchgeführt und kann einige Zeit in Anspruch nehmen. Wechseln Sie im Modulinterface zum Reiter „Tools“ und klicken Sie dort auf „Classify Spine“, um die Dornen zu klassifizieren. Nachdem überprüft wurde, dass vier Klassen gemäß dem schriftlichen Protokoll vorliegen, erzeugt das Modulinterface vier neue Filament-Objekte mit den Ergebnissen der Klassifizierung.

Schließlich exportieren Sie die statistischen Daten über den Statistik-Tab, indem Sie auf „Alle Statistiken in Datei exportieren“ klicken. Diese Abbildung zeigt die Kultur menschlicher Neuronen, die mit einem Anti-Beta-3-Tubulin-Antikörper markiert wurden. Die Neigung zur Zellclustering ist hier ebenfalls erkennbar.

Hier gezeigt ist ein GFP-markiertes parametadulares Neuron, 40 Tage nach der Differenzierung von einem späten kortikalen Vorläufer. Aus den oberflächlichen kortikalen Schichten. Die Einlage zeigt eine geringere Vergrößerung mit dem sichtbaren Zellkörper.

Diese Panels zeigen die 3D-Rekonstruktion von Abschnitten dendritischer Dornfortsätze in verschiedenen Reifestadien. Die quantitative Analyse der Dornfortsatzdichte und des Dornfortsatzkopfvolumens ist hier dargestellt. Wie erwartet nehmen diese beiden Parameter über die Kulturzeit hinweg zu.

Während des Kultivierungsverfahrens ist es wichtig, die neuronalen Stammzellen vorsichtig zu plattieren und zu versenden, indem die Zellen langsam unter sanfter Rotationsbewegung zugegeben werden, um die Zellcholine zu reduzieren. Tatsächlich erfordert diese Methode die Identifizierung einzelner Neuronen.