Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex
3. Dezember 2021
Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.
Obwohl relativ einfach, hat die Golgi-Imprägniertechnik einige knifflige Schritte und wenn sie nicht richtig ausgeführt werden, führt dies zu Zellen, die für die Analyse ungeeignet sind. Diese Technik ermöglicht eine schnelle, reproduzierbare Markierung von Golgi-imprägnierten Neuronen. Und darüber hinaus ermöglicht der kleine Standardfehler des Mittelwerts einen Vergleich zwischen Experimenten.
Der schwierigste Teil dieser Technik ist das Schneiden der Kryostatenabschnitte, da es eine ungewöhnliche Konsistenz und Fixierung gibt, und daher ist es eine Herausforderung, sie auf die Rutsche zu bringen. Legen Sie zuerst eine kleine Menge Gewebemedium auf ein vorkühles Kryostatenfutter. Montieren Sie die Gehirnblöcke auf Kryostatenfutter, indem Sie eine Seite des Blocks leicht in einer behandschuhten Hand auftauen und auf das Gewebemedium legen.
Verwenden Sie ein Gefrierspray auf das Messer und den Block. Verwenden Sie entweder die Antirollplatte oder den Pinsel, um den Abschnitt beim Schneiden flach zu halten. Schneiden Sie 100 Mikrometerschnitte an einem Kryostaten bei minus 22 Grad Celsius.
Auftauen, wenn möglich, mit einem Raumtemperaturschieber und schnell gegen den Abschnitt anlegen. Alternativ können Sie die Folien im Kryostaten aufbewahren, damit sie einfrieren. Übertragen Sie den Abschnitt mit einer kalten Pinzette oder einem kalten Pinsel und ziehen Sie ihn dann auf.
Montieren Sie drei bis vier koronale Abschnitte auf Absenkungen. Reinigen Sie das Messer mit Papiertüchern zwischen den Scheiben. Wenn das Messer weiter gereinigt werden muss, verwenden Sie 100% Ethanol und trocknen Sie, bevor Sie die nächste Scheibe schneiden.
Platzieren Sie Folien in Racks, die weit genug voneinander entfernt sind, um den Zugriff der Lösung auf Abschnitte zu ermöglichen. Legen Sie Abschnitte zweimal für vier Minuten in destilliertes Wasser, bevor Sie sie für 10 Minuten in die Golgi-Imprägnierlösung geben. Trennen Sie die Deckblätter, um sicherzustellen, dass nur ein Deckblatt auf die Abschnitte gelegt wird.
Decken Sie die Glasschienen mit einer großzügigen Menge an Montagemedium ab, bevor Sie einen Glasdeckel auf den Schlitten legen. Sobald die Abdeckung verrutscht war, markierten Trockenrutschen drei bis fünf Tage lang auf jedem nicht porösen Papier und bewegten sie leicht, besonders nach dem ersten Tag, um ein Anhaften zu vermeiden. Übertragen Sie die Objektträger später mindestens drei Wochen lang auf Diahalter und idealerweise auf Trockenobjektträger, bevor Sie sie untersuchen.
Um die dendritische Wirbelsäulendichte in pyramidalen Neuronen sowohl des medialen präfrontalen Kortex als auch der CA1-Region des Hippocampus zu analysieren, messen Sie die dendritische Länge mit einem Bildanalyseprogramm. Zählen Sie die Stacheln auf den Dendriten mit einem Handzähler und notieren Sie sowohl die Länge als auch die Anzahl der Stacheln. Für die Analyse wählen Sie Neuronen mit Zellkörpern und Dendriten, während sie imprägniert sind, und Dendriten, die kontinuierlich und von den benachbarten Zellen unterscheidbar sind.
Die Abbildung zeigt Beispiele von Golgi-imprägnierten Zellen in der CA1-Region des Hippocampus mit geringer und hoher Leistung. Die Abbildung zeigt ein Experiment, bei dem die basale dendritische Wirbelsäulendichte auf Pyramidenzellen bei jugendlichen männlichen und weiblichen Ratten nach einer Umweltanreicherung in CA1 und dem medialen präfrontalen Kortex erhöht wurde. Es ist eine Herausforderung, die Abschnitte beim Schneiden kalt genug zu halten, und dafür verwenden wir viel Gefrierspray.
Und dann ist es dann schwierig, die Abschnitte auf die Dias zu bekommen und sie flach trocknen zu lassen. Diese Technik wird verwendet, um neuroanatomische Eigenschaften zu untersuchen. Es kann allein oder in Kombination mit anderen neuroanatomischen Tracing-Methoden verwendet werden.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt eine modifizierte schnelle Golgi-Methode zur Färbung von Neuronen speziell im Hippocampus und im medialen präfrontalen Cortex von Ratten. Die Technik ermöglicht eine effektive Markierung von Neuronen und erlaubt die Analyse neuroanatomischer Merkmale.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neuroanatomie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Die Golgi-Imprägnierungstechnik ist eine etablierte Methode zur Färbung von Neuronen.
- Die Anwendung ermöglicht die Untersuchung der dendritischen Struktur und der Dornendichte.
- Die Methode kann an verschiedene Regionen des Nervensystems angepasst werden.
- Es bestehen Schwierigkeiten beim Schneiden von Schnitten am Kryostaten aufgrund der Gewebekonsistenz.
Zweck der Studie
- Verbesserung der bestehenden Golgi-Methode zur effektiveren Markierung von Neuronen.
- Untersuchung der Dendritenspinnendichte in spezifischen Hirnregionen.
- Untersuchung der Auswirkungen umweltbedingter Faktoren auf die neuronale Morphologie.
Verwendete Methoden
- Schnelle Golgi-Impregnationstechnik in Rattengehirngewebe.
- Hohe Präzision beim Schneiden von 100 Mikrometer dicken Kryostatschnitten.
- Tauverfahren zum korrekten Aufbringen der Schnitte auf Objektträger.
- Inkubation in Golgi-Lösung zur effektiven Färbung der Neurone.
- Die Analyse umfasste die Messung der dendritischen Länge und die Zählung der Dornfortsätze mithilfe einer Bildanalyse-Software.
Hauptergebnisse
- Die Technik führte zu einer reproduzierbaren Markierung von Neuronen, die für die Analyse geeignet war.
- Die Ergebnisse zeigten eine erhöhte Dornendichte in pyramidalförmigen Neuronen bei Umweltanreicherung.
- Es wurde eine erfolgreiche Identifizierung von Veränderungen in der Dornendichte der basalen dendritischen Spines bei männlichen und weiblichen jugendlichen Ratten festgestellt.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bestätigt die modifizierte Golgi-Methode als zuverlässige Methode für die neuroanatomische Analyse.
- Erkenntnisse zur Dendriten-Spinndichte tragen zum Verständnis der neuronalen Plastizität bei.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Bewertung umweltbedingter Einflüsse auf die Gehirnmorphologie umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese schnelle Golgi-Färbemethode bietet einen reproduzierbaren, geringe Variabilität aufweisenden Ansatz zur Visualisierung der dendritischen Dornendichte in wichtigen Hirnregionen, die für neuropsychiatrische Krankheitsmodelle relevant sind. Indem sie eine konsistente Quantifizierung synaptischer Strukturen im Hippocampus und präfrontalen Cortex ermöglicht, unterstützt die Technik die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in Programmen zur Wirkstoffentwicklung für das zentrale Nervensystem. Ihre Verträglichkeit mit der Lagerung von gefrorenem Gewebe und die geringe Variabilität zwischen Experimenten erhöhen die Zuverlässigkeit des Assays für longitudinale präklinische Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Bezug auf synaptische Plastizität und dendritische Morphologie in krankheitsrelevanten neuronalen Schaltkreisen.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, quantitative Messungen der Dornendichte pro 10 µm Dendrit zur zuverlässigen Vergleichbarkeit zwischen Experimenten.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem strukturelle Neuroanatomie mit funktionellen Ergebnissen in Modellen zur Umweltanreicherung und pharmakologischen Behandlungen verknüpft wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt konsistent gut imprägnierte Neuronen mit minimalem Hintergrund an Artefakten, wodurch eine zuverlässige Visualisierung und Zählung dendritischer Dornen ermöglicht wird.
- Reproduzierbarkeit: Zeigt äußerst geringe Abweichungen in der Dornendichte zwischen Experimenten auf, was die Präzision des Assays und statistische Aussagekraft unterstützt.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Ansammlung von Gehirngewebe und dessen Einlagerung bei Gefriertemperatur bis zur Verarbeitung, wodurch die Batch-Verarbeitung und Effizienz des Arbeitsablaufs in Entdeckungs-Pipelines erleichtert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar auf hippocampale und präfrontale Cortexareale, die in kognitive Funktionen, Depression und Schizophreniemodelle involviert sind.
- Translationskontinuität: Ermöglicht die Analyse der Dornendichte als biomarkerbasierte Messgröße zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die neuronale Struktur.
- Mechanistische Entwicklungsrisikominimierung: Verbindet strukturelle Veränderungen (z. B. Zunahme der Dornendichte nach stimuliierender Umgebung) mit funktioneller Plastizität und stärkt damit das Vertrauen in Zielstrukturen bei ZNS-Programmen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Target-Validierung bis zum präklinischen phänotypischen Screening ein, insbesondere für zentralnervensystembezogene Programme, die Neuroplastizität und synaptische Integrität bewerten.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur dendritischen Struktur und Dornendichte als Indikatoren für synaptische Gesundheit und neuronale Vernetzung.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse (Anzahl der Dornen pro 10 µm Dendrit), die für die Analyse mit hohem Informationsgehalt und den Vergleich von Substanzeffekten geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich der Dornendichte zwischen verschiedenen Bedingungen mittels Bildanalyse und manueller Zählung, wobei ein geringer Standardfehl des Mittelwerts das Vertrauen in die Daten erhöht.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Validierung, indem strukturelle Endpunkte bereitgestellt werden, die mit funktionellen Ergebnissen in Modellen des Lernens und Gedächtnisses korrelieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine standardisierte, wiederverwendbare neuroanatomische Plattform dar, die auf verschiedene Hirnregionen und Krankheitsmodelle anwendbar ist.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unschärfen bei der Beurteilung synaptischer Plastizität verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch gleichmäßige Imprägnierung, geringes Hintergrundrauschen und minimale Varianz zwischen Experimenten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem zuverlässige neuroanatomische Daten bereitgestellt werden, um Wirkstoffe mit nachweisbaren Effekten auf die dendritische Struktur zu priorisieren.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem strukturelle zentrale Nervensystem-Biomarker quantifiziert werden, die mit kognitiven und verhaltensbezogenen Endpunkten verknüpft sind.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kryostatschnittechnik und im Umgang mit Gewebe, um die Ebenheit und Integrität der Schnitte während des Schneidens bei -22 °C zu bewahren.
- Hängt von geeigneten Auftau-Montage-Techniken sowie der Verwendung einer Anti-Roll-Platte oder eines Pinsels ab, um Schäden an den Schnitten während der Übertragung auf den Objektträger zu vermeiden.
- Setzt standardisierte Färbedauern (10 Minuten in Golgi-Lösung) und die Anwendung des Montagemediums voraus, um eine konsistente Neuronenmarkierung sicherzustellen.
- Beinhaltet längere Trocknungsphasen (zunächst 3–5 Tage, danach ≥3 Wochen) vor der Bildaufnahme, was eine sorgfältige Planung des Arbeitsablaufs erfordert.
- Beruht auf geschultem Personal für die genaue Zählung dendritischer Dornen und die Längenmessung mithilfe von Bildanalysewerkzeugen und manuellen Zählern.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Sectioning of Brain Tissues and Mounting
2:04
Staining and Dehydration of Brain Tissue
3:06
Determination of Dendritic Spine Density
3:48
Results: Observation of Hippocampus and Effect of Environmental Enrichment on CA1 and mPFC
4:23
Conclusion
