Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Obwohl relativ einfach, hat die Golgi-Imprägniertechnik einige knifflige Schritte und wenn sie nicht richtig ausgeführt werden, führt dies zu Zellen, die für die Analyse ungeeignet sind. Diese Technik ermöglicht eine schnelle, reproduzierbare Markierung von Golgi-imprägnierten Neuronen. Und darüber hinaus ermöglicht der kleine Standardfehler des Mittelwerts einen Vergleich zwischen Experimenten.

Der schwierigste Teil dieser Technik ist das Schneiden der Kryostatenabschnitte, da es eine ungewöhnliche Konsistenz und Fixierung gibt, und daher ist es eine Herausforderung, sie auf die Rutsche zu bringen. Legen Sie zuerst eine kleine Menge Gewebemedium auf ein vorkühles Kryostatenfutter. Montieren Sie die Gehirnblöcke auf Kryostatenfutter, indem Sie eine Seite des Blocks leicht in einer behandschuhten Hand auftauen und auf das Gewebemedium legen.

Verwenden Sie ein Gefrierspray auf das Messer und den Block. Verwenden Sie entweder die Antirollplatte oder den Pinsel, um den Abschnitt beim Schneiden flach zu halten. Schneiden Sie 100 Mikrometerschnitte an einem Kryostaten bei minus 22 Grad Celsius.

Auftauen, wenn möglich, mit einem Raumtemperaturschieber und schnell gegen den Abschnitt anlegen. Alternativ können Sie die Folien im Kryostaten aufbewahren, damit sie einfrieren. Übertragen Sie den Abschnitt mit einer kalten Pinzette oder einem kalten Pinsel und ziehen Sie ihn dann auf.

Montieren Sie drei bis vier koronale Abschnitte auf Absenkungen. Reinigen Sie das Messer mit Papiertüchern zwischen den Scheiben. Wenn das Messer weiter gereinigt werden muss, verwenden Sie 100% Ethanol und trocknen Sie, bevor Sie die nächste Scheibe schneiden.

Platzieren Sie Folien in Racks, die weit genug voneinander entfernt sind, um den Zugriff der Lösung auf Abschnitte zu ermöglichen. Legen Sie Abschnitte zweimal für vier Minuten in destilliertes Wasser, bevor Sie sie für 10 Minuten in die Golgi-Imprägnierlösung geben. Trennen Sie die Deckblätter, um sicherzustellen, dass nur ein Deckblatt auf die Abschnitte gelegt wird.

Decken Sie die Glasschienen mit einer großzügigen Menge an Montagemedium ab, bevor Sie einen Glasdeckel auf den Schlitten legen. Sobald die Abdeckung verrutscht war, markierten Trockenrutschen drei bis fünf Tage lang auf jedem nicht porösen Papier und bewegten sie leicht, besonders nach dem ersten Tag, um ein Anhaften zu vermeiden. Übertragen Sie die Objektträger später mindestens drei Wochen lang auf Diahalter und idealerweise auf Trockenobjektträger, bevor Sie sie untersuchen.

Um die dendritische Wirbelsäulendichte in pyramidalen Neuronen sowohl des medialen präfrontalen Kortex als auch der CA1-Region des Hippocampus zu analysieren, messen Sie die dendritische Länge mit einem Bildanalyseprogramm. Zählen Sie die Stacheln auf den Dendriten mit einem Handzähler und notieren Sie sowohl die Länge als auch die Anzahl der Stacheln. Für die Analyse wählen Sie Neuronen mit Zellkörpern und Dendriten, während sie imprägniert sind, und Dendriten, die kontinuierlich und von den benachbarten Zellen unterscheidbar sind.

Die Abbildung zeigt Beispiele von Golgi-imprägnierten Zellen in der CA1-Region des Hippocampus mit geringer und hoher Leistung. Die Abbildung zeigt ein Experiment, bei dem die basale dendritische Wirbelsäulendichte auf Pyramidenzellen bei jugendlichen männlichen und weiblichen Ratten nach einer Umweltanreicherung in CA1 und dem medialen präfrontalen Kortex erhöht wurde. Es ist eine Herausforderung, die Abschnitte beim Schneiden kalt genug zu halten, und dafür verwenden wir viel Gefrierspray.

Und dann ist es dann schwierig, die Abschnitte auf die Dias zu bekommen und sie flach trocknen zu lassen. Diese Technik wird verwendet, um neuroanatomische Eigenschaften zu untersuchen. Es kann allein oder in Kombination mit anderen neuroanatomischen Tracing-Methoden verwendet werden.