Name: Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: Lernen Sie die modifizierte schnelle Golgi-Methode zur Visualisierung dendritischer Dornenfortsätze im Hippocampus und präfrontalen Kortex von Ratten. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare neuronale Markierung für neuroanatomische Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Sacred Heart University Undergraduate Research Initiative unterstützt.

Alle experimentellen Verfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sacred Heart University genehmigt und entsprechen dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren.
1. Isolierung und Infiltration von Hirngewebe
<ol><li>Premixen Sie die Lösungen A und B des Golgi Färbesets 24 h vor Gebrauch und bewahren Sie sie in dunklen Flaschen und/oder im Dunkeln auf. Machen Sie ungefähr 80 ml Lösung A und B Mischung, die ausreicht, um die Lösung nach 24 h zu wechseln. In luftdichten Flaschen aufbewahren. HINWEIS: Eine Perfusion mit Kochsalzlösung oder Paraformaldehyd ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Opfere Ratten nach Kohlendioxid-Euthanasie mit der Guillotine und entferne Gehirne innerhalb von Sekunden. Spülen Sie Gehirne in Kochsalzlösung, wenn erforderlich, aber nicht notwendig.<ol>
<li>Platzieren Sie das Gehirn, den Kortex nach unten, so dass der Hypothalamus sichtbar ist, da die Schnitte vor und nach ihm auf einer nicht porösen Oberfläche erfolgen. Geschnitten in einen vorderen (enthält den präfrontalen Kortex) und hinteren (enthält den Hippocampus) Block, wie in Abbildung 1 gezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren Sie Blöcke in den vorgemischten Lösungen von A und B und stellen Sie sicher, dass sie gut in die Lösung eingetaucht sind. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Lösungen A und B ausreicht, um in die Blöcke einzutauchen. Lagern Sie Blöcke entweder in braunen Flaschen oder durchsichtigen Flaschen, die mit Folie bedeckt sind (um Licht draußen zu halten), im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Lösung nach 24 h und halten Sie sie für weitere 13 Tage bei Raumtemperatur im Dunkeln. HINWEIS: Bei Verwendung mit Mäusegehirnen besteht keine Notwendigkeit zu blockieren, und das gesamte Gehirn kann in die Lösung eingebracht werden. Wenn Gehirnareale gefärbt werden, die unterschiedlich groß sind, muss die Zeit in den Lösungen A und B möglicherweise durch Versuch und Irrtum bestimmt werden.</li>
	<li>Nach zwei Wochen wird das Gewebe mit den Lösungen A und B gut infiltriert, die Blöcke in die Kryoprotektionslösung (Lösung C im Golgi-Färbeset) überführt und 48-72 h bei 4 °C stehen gelassen. HINWEIS: Nach dem Kryoschutz können Blöcke bis zur Weiterverarbeitung eingefroren werden. Beachten Sie auch, dass alle Lösungen aus dem Kit gesammelt und als gefährlicher Abfall entsorgt werden.</li>
	<li>Gehirn einfrieren, Kortex runter, auf einem Glasschieber auf Trockeneis. Nach dem Einfrieren entweder auf dem Kryostaten schneiden oder bei -80 °C lagern, bis es mit einem Kryostaten geschnitten wird. HINWEIS: Nicht in flüssigem Stickstoff einfrieren, da dies zu Rissen im Gewebe führt.</li>
</ol>2. Schnitt von Hirngewebe
<ol><li>Legen Sie eine kleine Menge Gewebemedium auf ein vorgekühltes Kryostatenfutter. Montieren Sie Blöcke auf Kryostatenfuttern, indem Sie eine Seite des Blocks leicht in der Hand auftauen (behandschuht) und auf das Gewebemedium legen. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, das Gewebe einzubetten. Der Block, der den Hippocampus enthält, ist etwas leichter zu schneiden als der Block mit dem präfrontalen Kortex, da dieser vor dem Corpus callosum liegt und die beiden Hälften getrennt sind.</li>
	<li>Schneiden Sie 100 μm-Abschnitte auf einem Kryostaten bei -22 °C und montieren Sie sie auf Unterbettschienen. Es können Abschnitte mit einer Dicke von bis zu 150 μm verwendet werden. Versuchen Sie, 3-4 koronale Abschnitte pro Folie zu mounten, da dies die Anzahl der Folien verringert, die verarbeitet werden müssen. Verwenden Sie eine der folgenden Techniken, um die Abschnitte eingefroren zu halten, bis sie auf die Folie gelangen. HINWEIS: Diese Abschnitte sind nicht auf die übliche Weise fixiert und neigen daher dazu, schnell zu schmelzen. Lassen Sie die Abschnitte auf der Folie schmelzen. Wenn sie anfangen zu schmelzen, bevor sie auf die Rutsche gelegt werden, ist es unmöglich, sie dazu zu bringen, flach auf der Rutsche zu sein. Es gibt mehrere Techniken, um dies zu tun.<ol>
<li>Verwenden Sie ein Gefrierspray auf das Messer und den Block. Abhängig von der Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Raum kann dies für jeden Abschnitt erforderlich sein. Verwenden Sie entweder die Antirollplatte oder eine Bürste, um den Abschnitt beim Schneiden flach zu halten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Gefrierspray haben. Beim Schneiden von 20 Blöcken können mehrere Dosen verwendet werden.</li>
		<li>Taumontieren, wenn möglich, mit einer Raumtemperaturschiene und schnell auf den Abschnitt aufbringen. Mit etwas Übung kann man mehrere Abschnitte gleichzeitig montieren. Wenn dies nicht funktioniert, halten Sie die Dias im Kryostaten, so dass sie sehr kalt sind, und übertragen Sie den Abschnitt mit einer kalten Pinzette oder einem kalten Pinsel und dann die Auftaumontage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie das Messer mit Papiertüchern zwischen den Scheiben. Wenn das Messer mehr Reinigung benötigt, verwenden Sie 100% Ethanol (EtOH) und lassen Sie es trocknen, bevor Sie die nächste Scheibe schneiden.</li>
	<li>Nach der Montage auf dem Dia legen Sie den Schlitten flach auf Kartonschienen und lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur (für mehrere Stunden bis maximal 48 h) im Dunkeln trocknen. Decken Sie das Objektträgerfach nicht ab. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte vor der Golgi-Imprägnierung vollständig trocken sind. Flach, im Dunkeln, auf Schiebefächern bis zur Golgi-Imprägnierung aufbewahren. HINWEIS: Das Trocknen der Abschnitte verursacht keine Schäden.</li>
</ol>3. Färbung und Austrocknung des Hirngewebes
<ol><li>Führen Sie das Färben in Glasfärbeschüsseln durch. Mischen Sie die Lösungen D und E unmittelbar vor dem Färben. Gemäß dem Protokoll fügen Sie einen Teil der Lösung D, einen Teil der Lösung E und zwei Teile destilliertes Wasser hinzu. Für Glasfleckenschüsseln stellen Sie eine 200-ml-Lösung her, um die Abschnitte vollständig einzutauchen. Für Koplin-Gläser erfordert dies weniger Volumen.</li>
	<li>Platzieren Sie die Folien in Racks, die weit genug voneinander entfernt sind, um der Lösung den Zugriff auf Abschnitte zu ermöglichen.</li>
	<li>Legen Sie Abschnitte für 4 min (2x) in destilliertes Wasser, bevor Sie sie für 10 min in die Golgi-Imprägnierlösung geben. Ändern Sie die Färbelösung alle 70 Abschnitte. Wechseln Sie das destillierte Wasser, wenn es gelb wird. HINWEIS: Das Timing für den Färbeschritt ist entscheidend. Zu kurz lässt nicht genügend Färbung zu und zu lange Ursachen für eine Färbung, wodurch die Dendriten bei der Analyse schwer zu trennen sind. Sobald Sie die Färbelösung verlassen haben, ist das Timing weniger kritisch.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Abschnitte wie folgt: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), Clearing Agent (5 min; 3x). Wechseln Sie häufig alle Lösungen, insbesondere das 100% EtOH und das Clearingmittel, um sicherzustellen, dass die Abschnitte wasserfrei bleiben. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, einen 50% EtOH-Schritt zu durchlaufen. Eine Gegenfärbung ist für die Zellvisualisierung nicht erforderlich, da die Golgi-Imprägnierung einen ausreichenden Kontrast bietet. Die Verwendung anderer Verrechnungsmittel hat nicht so gut funktioniert wie die hier verwendete (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Deckglas mit Glasabdeckungen, die 60 mm lang sind und eine großzügige Menge an Montagemedium enthalten. Stellen Sie sicher, dass es so wenig Luftblasen wie möglich gibt. Entfernen Sie bei Bedarf vorsichtig das Deckblatt und wiederholen Sie es (kann auch Wochen später durchgeführt werden). Tun Sie dies sehr langsam, um den Abschnitt nicht zu beschädigen (kann aufgrund der großen Menge an Montagemedium durchgeführt werden). HINWEIS: Eine große Menge an Montagemedium ist etwas unordentlich, aber immer noch notwendig, da genügend Montagemedium verwendet werden muss, um die dicken 100-μm-Abschnitte abzudecken.</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass nur ein Deckglas auf den Abschnitten angebracht wird, trennen Sie die Deckgläser vor dem Prozess.</li>
	<li>Sobald die Abdeckung verrutscht ist, rutscht der Trockenraum 3-5 Tage lang flach auf jedem nicht porösen Papier und bewegt sie leicht, besonders nach dem ersten Tag, um ein Verkleben zu vermeiden. Nach 3-5 Tagen werden die Objektträger mindestens 3 Wochen lang auf Diahalter und idealerweise auf Trockenschienen übertragen, bevor sie untersucht werden. Halten Sie die Folien flach, um die Möglichkeit der Bildung von Luftblasen zu verringern.</li>
</ol>4. Bestimmung der dendritischen Wirbelsäulendichte
<ol><li>Zur Analyse der dendritischen Wirbelsäulendichte in pyramidalen Neuronen sowohl der mPFC- als auch der CA1-Region des Hippocampus sind die meisten lateralen sekundären basalen Dendriten und die meisten lateralen tertiären apikalen Dendriten zu untersuchen, wie in Schritt 4.1.1 beschrieben (Abbildung 2).<ol>
<li>Wählen Sie einen Dendriten, messen Sie die Länge des Dendriten mit einem Bildanalyseprogramm, zählen Sie die Stacheln auf den Dendriten mit einem Handzähler und zeichnen Sie sowohl die Länge als auch die Anzahl der Stacheln auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Untersuchen und analysieren Sie sechs Zellen pro Region (mPFC, CA1) pro Gehirn. Quantifizieren Sie mindestens sechs Gehirne pro Gruppe, wie zuvor beschrieben 7,8. Wählen Sie Neuronen, die die folgenden Analysekriterien erfüllen: Zellkörper und Dendriten sind gut imprägniert; Dendriten sind von benachbarten Zellen unterscheidbar und kontinuierlich.</li>
	<li>Zählen Sie die Stacheln bei 1000x (Öl-Immersion) durch Handzählung mit einem Lichtmikroskop und messen Sie die dendritische Länge mit einem Bildanalyseprogramm. Berechnen Sie die Wirbelsäulendichte, indem Sie die Wirbelsäulenzahl durch die Länge des Dendriten dividieren und die Daten als Anzahl der Stacheln / 10 μm Dendrit ausdrücken. HINWEIS: Es gibt weitaus ausgefeiltere Methoden zur Unterscheidung von Wirbelsäulensubtypen und dendritischer Architektur, die verwendet werden können, aber die Handzählung mit einem Lichtmikroskop bei 1000x kann ein schnelles Ergebnis liefern, das dann feststellen kann, ob weitere Untersuchungen erforderlich sind. Obwohl alle Anstrengungen unternommen werden, um ähnliche Dendriten konsistent zu beproben, gibt es Variationen in der Dicke, die die Zählung beeinflussen können.</li>
</ol>

<ol><li>Pannese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi+Stain%3A+invention%2C+diffusion+and+impact+on+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+History+of+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences.</a> Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).</li>
<li>Bentivoglio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Original+Histological+Slides+of+Camillo+Golgi+and+His+Discoveries+on+Neuronal+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3(2019).</li>
<li>Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwanson%2C+LW+%22The+Beautiful+Brain%3A+The+Drawings+of+Santiago+Ramon+y+Cajal%22">The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal</a>. , Abrams. 208(2017).</li>
<li>Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bsingle-section%26%2334%3B+Golgi+method+adapted+for+formalin-fixed+human+brain+and+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The &#34;single-section&#34; Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27single%27+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+forebrain+astrocytes+are+sensitive+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone.</a> Glia. 3 (4), 283-292 (1990).</li>
<li>Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+steroids+regulate+dendritic+spine+density+in+hippocampal+pyramidal+cells+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood.</a> Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).</li>
<li>Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+fluctuation+in+dendritic+spine+density+on+adult+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons.</a> Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).</li>
<li>Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+alters+dendritic+spine+density+in+cortical+and+subcortical+brain+regions+of+the+postpartum+and+virgin+female+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat.</a> Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).</li>
<li>Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+dendritic+spines+and+memory%3A+Interaction%28s%29+with+estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol.</a> Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).</li>
<li>Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adolescent+bisphenol-A+exposure+decreases+dendritic+spine+density%3A+role+of+sex+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age.</a> Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).</li>
<li>Bowman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+exposure+during+adolescence+leads+to+enduring+alterations+in+cognition+and+dendritic+spine+density+in+adult+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats.</a> Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).</li>
<li>Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A+impairs+memory+and+reduces+dendritic+spine+density+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats.</a> Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).</li>
<li>Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-induced+memory+enhancements+are+blocked+by+acute+bisphenol+A+in+adult+female+rats%3A+role+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines.</a> Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Jacome, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+Hormones+Rapidly+Enhance+Spatial+Memory+and+Increase+Hippocampal+Spine+Density+in+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats.</a> Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).</li>
<li>Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol-A%3A+a+plastic+manufacturing+compound+disrupts+critical+brain+structures+and+impairs+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Features%22%5BJournal%5D)">Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory.</a> Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).</li>
<li>Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+rats+show+decreased+recognition+memory+and+spine+density+in+the+hippocampus+and+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex.</a> Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).</li>
<li>Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+recognition+memory+and+decreased+prefrontal+cortex+spine+density+in+aged+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).</li>
<li>Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adolescent+Bisphenol-A+exposure+on+memory+and+spine+density+in+ovariectomized+female+rats%3A+Adolescence+vs+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood.</a> Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).</li>
<li>Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+enrichment+prevents+acute+restraint+stress-induced+anxiety-related+behavior+but+not+changes+in+basolateral+amygdala+spine+density%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density.</a> Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).</li>
<li>Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Purkinje+cell+size+is+compatible+with+near+normal+morphology+and+function+of+the+cerebellar+cortex+in+a+mouse+model+of+spinocerebellar+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia.</a> Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).</li>
<li>Zemmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte-+and+Neuron-Specific+Nogo-A+Restrict+Dendritic+Branching+and+Spine+Density+in+the+Adult+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex.</a> Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der Golgi-Imprägnierung, die eine schnelle gleichzeitige Verarbeitung vieler Abschnitte ermöglicht. Es ist eine Verbesserung gegenüber zuvor beschriebenen5 arbeitsintensiveren Methoden und liefert durchweg imprägnierte Neuronen für die Analyse. Darüber hinaus ist die Exposition gegenüber giftigen Chemikalien, die bei der Golgi-Imprägnierung verwendet werden, geringer. Der schwierigste Teil des Prozesses besteht darin, die Abschnitte auf den Folien ...

Die Methode, Kaliumdichromat und Silbernitrat zur Markierung von Neuronen zu verwenden, wurde zuerst von Camillo Golgi1,2 beschrieben und anschließend von Santiago Ramon y Cajal verwendet, um eine immense Arbeit zur Unterscheidung neuronaler und glialer Subtypen zu produzieren. Ein kürzlich erschienenes Buch mit seinen Illustrationen ist jetzterhältlich 3. Nach den Studien von Ramon y Cajal, die vor mehr als 100 Jahren veröffentlicht wurden, wurde nur sehr wenig Golgi-Imprägnierung verwendet. Die Golgi-Imprägnierung ist ein mühsamer Prozess, der die dreidimensionale Visualisierung von Neuronen mit einem Lichtmikroskop ermöglicht. Es gab im Laufe der Jahre zahlreiche Modifikationen der Golgi-Methode, um die Methode zu erleichtern und die Färbung konsistenterzu machen 4. 1984 beschrieben Gabbott und Somogyi5 das einteilige Golgi-Imprägnierverfahren, das eine schnellere Verarbeitung ermöglichte. Diese Golgi-Imprägniermethode erfordert eine Perfusion mit 4% Paraformaldehyd und 1,5% Picrinsäure, gefolgt von der Vibratom-Schnitt in ein Bad aus 3% Kaliumdichromat. Abschnitte werden auf Glasobjektträger montiert, die vier Ecken der Deckgläser so verklebt, dass beim Eintauchen in Silbernitrat die Diffusion allmählich erfolgt. Anschließend werden Deckgläser abgenommen, Abschnitte dehydriert und schließlich mit Montagemedium dauerhaft verrutscht. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um Neuronen und Glia 6,7,8 im Hippocampus zu markieren. Die hier beschriebene schnelle Golgi-Methode ist eine Verbesserung, da sowohl Kaliumdichromat als auch Silbernitrat weitaus geringer ausgesetzt sind und kein Paraformaldehyd und keine Pikrinsäure verwendet werden. Obwohl Zellen, die mit Modifikationen der Gabbott- undSomogyi-5-Methode imprägniert wurden, analysiert werden konnten, waren die Abschnitte während des Dehydratisierungsschritts oft über- oder unterbelichtet oder fielen von den Objektträgern und im Allgemeinen mussten mehrere Experimente gepoolt werden, um genügend Zellen für die Analyse zu haben.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung des Golgi-Färbesets (siehe Materialtabelle) zur Kennzeichnung von Dendriten und dendritischen Stacheln im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex (mPFC) der Ratte. Die Vorteile dieser Methode gegenüber früheren sind, dass sie schnell ist, es weniger Exposition gegenüber schädlichen Chemikalien für den Forscher gibt und es eine konsistente Färbung von Neuronen gibt. Das unten beschriebene Protokoll wurde mit geringfügigen Modifikationen verwendet, um die dendritische Wirbelsäulendichte im Hippocampus und mPFC der Ratte in vielen Studien 9,10,11,12,13,14,15 zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>Dias aus Pappe Tabletts</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24 x 60mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>FD Rapid GolgiStain Kit</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PK 401</td><td>Monatelang stabil bei RT im Dunkeln; Golgi Färbeset</td></tr><tr><td>Gefrierspray</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-022524</td><td></td></tr><tr><td>HISTO-CLEAR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td>Clearingmittel</td></tr><tr><td>NCSS Software</td><td>Kaysville, UT, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP-15-100</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek CTYO OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Wird verwendet, um Gehirne auf einem Kryostat-Futter zu montieren</td></tr></tbody></table>

schneller golgi-fleck für die visualisierung der dendritischen wirbelsäule im hippocampus und im präfrontalen kortex

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Die Golgi-Imprägnierung unter Verwendung des Golgi-Färbesets mit geringfügigen Anpassungen wird verwendet, um dendritische Stacheln im Hippocampus der Ratte und im medialen präfrontalen Kortex zu imprägnieren. Diese Technik ist eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Methoden der Golgi-Imprägnierung, da die vorgemischten Chemikalien sicherer zu verwenden sind, Neuronen durchweg gut imprägniert sind, es viel weniger Hintergrundablagerungen gibt und für eine bestimmte Region extrem kleine Abweichungen in der Wirbelsäulendichte zwischen den Experimenten auftreten. Darüber hinaus können Gehirne ab einem bestimmten Punkt akkumuliert und bis zur Weiterverarbeitung eingefroren gehalten werden. Mit dieser Methode kann jede interessierende Hirnregion untersucht werden. Nach der Färbung und dem Verrutschen der Abdeckung wird die dendritische Wirbelsäulendichte bestimmt, indem die Anzahl der Stacheln für eine Länge von Dendrit gezählt und als Wirbelsäulendichte pro 10 μm Dendrit ausgedrückt wird.

Mit der schnellen Golgi-Methode werden Zellen durchweg gut imprägniert, so dass genügend Zellen zu analysieren sind. Dies ist eine deutliche Verbesserung gegenüber früheren Methoden, bei denen Experimente gepoolt werden mussten, um genügend Daten für die Analyse zu erhalten. Daher können mehr Proben auf einmal verarbeitet werden und Gehirne können bis zur Verarbeitung eingefroren gelagert werden. Beispiele für Golgi-imprägnierte Zellen in der CA1-Region des Hippocampus sind in Abbildung 3 be...

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial ...

Obwohl relativ einfach, hat die Golgi-Imprägniertechnik einige knifflige Schritte und wenn sie nicht richtig ausgeführt werden, führt dies zu Zellen, die für die Analyse ungeeignet sind. Diese Technik ermöglicht eine schnelle, reproduzierbare Markierung von Golgi-imprägnierten Neuronen. Und darüber hinaus ermöglicht der kleine Standardfehler des Mittelwerts einen Vergleich zwischen Experimenten.Der schwierigste Teil dieser Technik ist das Schneiden der Kryostatenabschnitte, da es eine ungewöhnliche Konsistenz und Fixierung gibt, und daher ist es eine Herausforderung, sie auf die Rutsche zu bringen. Legen Sie zuerst eine kleine Menge Gewebemedium auf ein vorkühles Kryostatenfutter. Montieren Sie die Gehirnblöcke auf Kryostatenfutter, indem Sie eine Seite des Blocks leicht in einer behandschuhten Hand auftauen und auf das Gewebemedium legen.Verwenden Sie ein Gefrierspray auf das Messer und den Block. Verwenden Sie entweder die Antirollplatte oder den Pinsel, um den Abschnitt beim Schneiden flach zu halten. Schneiden Sie 100 Mikrometerschnitte an einem Kryostaten bei minus 22 Grad Celsius.Auftauen, wenn möglich, mit einem Raumtemperaturschieber und schnell gegen den Abschnitt anlegen. Alternativ können Sie die Folien im Kryostaten aufbewahren, damit sie einfrieren. Übertragen Sie den Abschnitt mit einer kalten Pinzette oder einem kalten Pinsel und ziehen Sie ihn dann auf.Montieren Sie drei bis vier koronale Abschnitte auf Absenkungen. Reinigen Sie das Messer mit Papiertüchern zwischen den Scheiben. Wenn das Messer weiter gereinigt werden muss, verwenden Sie 100% Ethanol und trocknen Sie, bevor Sie die nächste Scheibe schneiden.Platzieren Sie Folien in Racks, die weit genug voneinander entfernt sind, um den Zugriff der Lösung auf Abschnitte zu ermöglichen. Legen Sie Abschnitte zweimal für vier Minuten in destilliertes Wasser, bevor Sie sie für 10 Minuten in die Golgi-Imprägnierlösung geben. Trennen Sie die Deckblätter, um sicherzustellen, dass nur ein Deckblatt auf die Abschnitte gelegt wird.Decken Sie die Glasschienen mit einer großzügigen Menge an Montagemedium ab, bevor Sie einen Glasdeckel auf den Schlitten legen. Sobald die Abdeckung verrutscht war, markierten Trockenrutschen drei bis fünf Tage lang auf jedem nicht porösen Papier und bewegten sie leicht, besonders nach dem ersten Tag, um ein Anhaften zu vermeiden. Übertragen Sie die Objektträger später mindestens drei Wochen lang auf Diahalter und idealerweise auf Trockenobjektträger, bevor Sie sie untersuchen.Um die dendritische Wirbelsäulendichte in pyramidalen Neuronen sowohl des medialen präfrontalen Kortex als auch der CA1-Region des Hippocampus zu analysieren, messen Sie die dendritische Länge mit einem Bildanalyseprogramm. Zählen Sie die Stacheln auf den Dendriten mit einem Handzähler und notieren Sie sowohl die Länge als auch die Anzahl der Stacheln. Für die Analyse wählen Sie Neuronen mit Zellkörpern und Dendriten, während sie imprägniert sind, und Dendriten, die kontinuierlich und von den benachbarten Zellen unterscheidbar sind.Die Abbildung zeigt Beispiele von Golgi-imprägnierten Zellen in der CA1-Region des Hippocampus mit geringer und hoher Leistung. Die Abbildung zeigt ein Experiment, bei dem die basale dendritische Wirbelsäulendichte auf Pyramidenzellen bei jugendlichen männlichen und weiblichen Ratten nach einer Umweltanreicherung in CA1 und dem medialen präfrontalen Kortex erhöht wurde. Es ist eine Herausforderung, die Abschnitte beim Schneiden kalt genug zu halten, und dafür verwenden wir viel Gefrierspray.Und dann ist es dann schwierig, die Abschnitte auf die Dias zu bekommen und sie flach trocknen zu lassen. Diese Technik wird verwendet, um neuroanatomische Eigenschaften zu untersuchen. Es kann allein oder in Kombination mit anderen neuroanatomischen Tracing-Methoden verwendet werden.

rapid-golgi-stain-for-dendritic-spine-visualization-hippocampus

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

FRAP wurde verwendet, um die Mobilität von grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierter Proteine ​​in kultivierten Zellen zu quantifizieren. Wir untersuchten die mobile / immobile Fraktionen der GFP durch die Analyse der Fluoreszenz-Recovery-Anteil nach Ausbleichen. In dieser Studie wurde FRAP am Rücken von Hippocampus-Neuronen durchgeführt.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Quelle: McLeod, F., et al. Bewertung der Synapsendichte in Hirnschnitten von Hippocampus-Nagetieren. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video demonstriert eine Methode zur Visualisierung synaptischer Marker in hippokampalen Hirnschnitten mittels konfokaler Immunfluoreszenzanalyse. Die Scheiben werden mit primären Antikörpern immungefärbt, die auf präsynaptische und postsynaptische Marker abzielen, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern. Die markierten Marker werden dann mit Hilfe der...

Mikroskopische Analyse von Synapsen in Hippocampusschnitten der Maus mittels Immunfluoreszenz

Die Lokalisation und Verteilung von Proteinen liefern wichtige Informationen für das Verständnis ihrer zellulären Funktionen. Die überlegene Ortsauflösung der Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung eines bestimmten Antigens nach Immunohistochemie bestimmen. Für Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), Erhaltung strukturelle Integrität während Antigenität war besonders schwierig im EM-Studien. Hier nehmen wir ein Verfahren, das verwendet wurde, um Strukturen und...

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Dieser Beitrag beschreibt die Verfahren für die taktile Stimulation von Rattenjungen und anschließende Golgi-Cox-Färbung der neuronalen Morphologie. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die in der Perinatalperiode durch Streicheln Welpen mit einem Haushalts duster verwaltet wird. Golgi-Färbung cox ist ein zuverlässiges Verfahren ermöglicht die Visualisierung der gesamten Neuronen.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Lernen Sie die modifizierte schnelle Golgi-Methode zur Visualisierung dendritischer Dornenfortsätze im Hippocampus und präfrontalen Kortex von Ratten. Diese Technik ermöglicht reproduzierbare neuronale Markierung für neuroanatomische Analysen.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Weitere Videos entdecken