Name: Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung modularer Hydrogel-Blätter für 3D-Zellkultursysteme im Gewebeengineering. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Erstellung funktioneller, in vivo-ähnlicher Zellmikroumgebungen.

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Diese Forschung wurde durch ein National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) von der National Research Foundation of Korea unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung finanziert wurde. Die Autoren würdigen auch ein KAIST Systems Healthcare Programm.

1. Herstellung der mikrostrukturierten Formen und Hydrogele <ol><li> Die gewünschten Mikrostufenmuster mit Su-8 auf der Oberfläche eines Silizium-Wafers über eine Standard zweistufige photolithographischen Technik 15,17 zum Gießen PDMS Schimmelpilze. Das gezeigte Beispiel verwendet eine Leberläppchens artigen Maschenmuster (1). </li><li> Abwiegen PDMS und einer Härterlösung mit einem Verhältnis von 1: 5 (das heißt, 12,5 g PDMS und 2,5 g Härter). </li><li> Mischen Sie die 15 g der Lösung gründlich, entgast die Blasen in einer Vakuumkammer, und dann verbreiten die gemischte Lösung auf einen mikrostrukturierten Oberfläche der Silizium-Wafer gleichmäßig innerhalb einer Foliengießen Gericht. </li><li> Setzen Sie den Silizium-Wafer auf eine 65 ° C erhitzt Platte für 90 min auf eine ebene Fläche, um die PDMS zu heilen. </li><li> Entfernen Sie die ausgehärtete PDMS aus der Gussschale und dem Silizium-Wafer. </li><li> Schneiden Sie die Kanten der PDMS und legen Sie sie auf eine Petrischale von 100 mm Durchmesser mitdie mikro Seite nach oben. </li><li> Auf der Petrischale unter Verwendung von 70% Ethanol und destilliertes Wasser für die primäre Sterilisations Waschen der Mikromuster gehärtet PDMS. Dann trocknet sie vollständig für 10 min in einem Ofen bei 65 ° C. </li><li> Auflösen und mischen O / N 3 g eines pulverförmigen nichtionischen Tensid in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, wodurch eine 3% (w / v) Beschichtungslösung. </li><li> Platzieren der mikro PDMS Formen in einer Plasmareiniger und reinigen sie für 1 min (85 W, 0,73 mbar), um eine hydrophile Oberfläche zu schaffen, um die Zugabe von wässrigen Flüssigkeiten zu erleichtern. Dann Beschichten der Oberfläche der PDMS mit 100 ml Tensidlösung für mindestens 3 hr (ORO / N) unter Verwendung eines Labor Wippe. </li><li> Waschen Sie die Tensidlösung aus PDMS Formen und trocknet sie vollständig in einem Ofen bei 65 ° C für 10 min. Dann sterilisiert jede mikrostrukturierte Form durch Belichtung mit ultravioletter Strahlung (UV) über 30 min. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Zellsuspension in einem Hydrogel-Vorläufer <ol><li> ZuHydrogel-Vorläufer herzustellen, werden in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Man löst 0,1 g Natrium-Alginat Pulver, wodurch eine 1% (w / v) Alginat Vorläufers. Um das Pulver vollständig aufzulösen, Inkubation und mischen sie O / N. </li><li> Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Filter in eine 1 ml Spritze verbunden. </li><li> Kultur die HepG2-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin auf einer herkömmlichen Gewebekulturschale bis 70% ergänzt - 80% Konfluenz in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C . </li><li> Die Zellen einmal mit PBS zu waschen, und dann trypsinize sie durch Zugabe von 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 4 min in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Zentrifugation der Zellen von der Kulturschale für 3 min und resuspendieren mit 1 ml PBS nach der Entfernung des Überstands bei 250 × g geerntet. </li><li> Zählen die Anzahl von einzelnen verteilten Zellen in PBS unter Verwendung eines automatisierten ZellZähler. </li><li> Nach der Zentrifugation bei 250 × g für 3 min und PBS Entfernung, 1 ml der 1% (w / v) Natriumalginatlösung zu der verbleibende Zellpellet und mischen sie sanft mit Pipettieren. 10 7 Zellen / ml - die endgültige Saatdichte der Zellen sollte 5 x 10 6 ist. Inkubieren der Zell / Hydrogel-Suspension in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> 3. Laden und Vernetzung von Cell / Hydrogel Federung <ol><li> Aufzulösen 1,47 g Calciumchlorid zu dehydratisieren in 100 ml ddH 2 O zu einer vernetzenden Reagens (dh 100 mM CaCl 2 · 2H 2 O in ddH 2 O). </li><li> Spülen Sie das Innere eines Luftbefeuchter mit Ultraschall-Wandler mit 70% Ethanol, und füllen Sie es mit 200 ml Vernetzungsreagenz. Der Befeuchter ist 110 mm breit, 300 mm lang und 170 mm tief (dh 110 mm x 300 mm x 170 mm (B x H x T)). </li><li> Legen Sie die mikrostrukturierten PDMSFormen in einem Plasmafilter und reinigen sie für 1 min bei 85 W, um eine hydrophile Oberfläche zu schaffen. </li><li> 7,2 ul des gut vermischten Zell / Hydrogel-Suspension kontinuierlich geladen am Rand des Mikromusters auf der Form. Das gezeigte Beispiel verwendet eine Leberläppchens artigen Maschenmuster (1). Das Volumen der Suspension ist abhängig von der topographischen Muster. </li><li> Um die Gelierung der Zelle / Hydrogel-Suspension zu erreichen, schalten Sie den Luftbefeuchter und überprüfen, dass der Luftbefeuchter erzeugt einen Nebel des Vernetzungsreagens. Spray das Vernetzungsreagenz auf das Hydrogel-Vorläufer für 5 min, für den topographischen Oberfläche des PDMS Formen in einem Bereich von 5 cm. Hinweis: Entfernungen länger und kürzer als 5 cm konnte unvollständige und ungleichmäßige Gelierung zu bewirken sind. Sicherzustellen, dass der Befeuchter mit einer Sprührate von 250 ml / h, wodurch 20 ml Nebel des Vernetzungsreagens in 5 min. </li><li> Nach der Vernetzungsprozess, schalten Sie den Luftbefeuchter und füllen Sie die PDMS-molds mit PBS. </li></ol> 4. Handhabung des Einzel Modular Hydrogel Blätter <ol><li> Nehmen Sie jede gehärtete Hydrogelfolie von den mikrostrukturierten Formen über Pipettieren PBS sanft um das Hydrogel Blatt unter Verwendung eines 200 ul Pipettenspitze. </li><li> Pick up jede schwimm Hydrogelfolie mit einer End-zu schneiden 1.000 ul Pipettenspitze Ende. Jedes Leberläppchens förmige Netz Hydrogelfolie hat Abmessungen von 8 mm x 8,7 mm und ist 100 bis 200 &amp; mgr; m dick. </li><li> Übertragen Sie eine einzelne Schicht des Hydrogels Blatt in 1 ml DMEM in einer 12-Well-Platte, und die Kultur der Zellen in vitro in einer schwimmenden Weise mit der Hydrogel-Konstrukt als eine Einheit Komponente im 12-Well-Platte über eine Woche in einem 5 % CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Tauschen Sie jeden zweiten Tag des Kulturmediums. </li></ol> 5. Montage von mehrschichtigen Hydrogel Blätter <ol><li> Die Schritte 1.1 bis 1.5, ein PDMS-Rahmen mit Abmessungen von 18 mm x 18 mm x 4 mm zu erzeugen (W xH x T), und die 170 &amp; mgr; m hohen Säulenstrukturen an der unteren Fläche enthält. Verwenden von 42 g der Mischung von PDMS und Härter, mit dem gleichen Verhältnis, wie in Schritt 1.2. Legen Sie eine spezielle Polycarbonatform auf dem Siliziumwafer für die PDMS-Rahmen, um eine Innenrahmen mit Abmessungen von 8 mm x 9 mm x 2 mm zu erstellen (B x H x T). </li><li> Sterilisieren der PDMS Rahmen und 180 &amp; mgr; m Porennylonfilterpapiere in destilliertem Wasser und einer Pinzette in einem Autoklaven unter Wasser für 15 min bei 121 ° C. </li><li> Legen Sie die sterilisiert PDMS Rahmen auf ein Viertel der ein Stück Nylon-Filterpapier (mit einem Durchmesser von 5 cm) in einem 60-mm-Petrischale. </li><li> Übertragen einer modularen Hydrogelfolie in das Innere des PDMS-Rahmen unter Verwendung einer End-zu schneiden 1.000 &amp; mgr; l-Pipettenspitze. Die Hydrogelfolien zur Montage verwendet werden, sollten für mindestens einen Tag, nachdem sie hergestellt wurden, kultiviert werden. </li><li> Richten Sie die Kante jeder modularen Hydrogelfolie mit dem PDMS-Rahmen mit einem leeren 200 ul Pipettenspitze. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.4 und 5.5 unter Verwendung modularer Hydrogelfolien um einen Stapel von 4 bilden - 6 Schichten. </li><li> Entfernen des Kulturmediums durch Fließen ihn durch die Säulenstrukturen am Boden des PDMS-Rahmen. Es werden nun 2 ul Alginatlösung (2% w / v) an einer Ecke des Mehrschichtkonstrukts. </li><li> Sprühen eines Nebels des Vernetzungsreagenz für 30 s auf dem Mehrschichtkonstrukt, um die Kanten der einzelnen Schichten mit denen einer anderen zu befestigen. Ein 2-ml Nebel des Vernetzungsreagenz (mit einer Sprührate von 250 ml / h). </li><li> Spülen Sie die mehrschichtige Aufbau vorsichtig mit 400 ul DMEM und entfernen Sie die PDMS-Rahmen mit einer Pinzette. </li><li> Nehmen Sie das mehrschichtige Aufbau aus dem Filterpapier durch vorsichtiges Abwischen mit einem Zellheber nach der Zugabe von 4 ml DMEM. </li><li> Übertragen Sie die mehrschichtige Aufbau zu einer 6-Well-Platte, die 3 ml DMEM mit Filterpapier, und Kultur die Zellen in vitro in einer schwimmenden Weise mit dem Hydrogel-Konstrukt, wieeine Multiskalenzellgerüst in 6-Well-Platte über eine Woche in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Tauschen Sie jeden zweiten Tag des Kulturmediums. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll liefert ein einfaches Verfahren zur Herstellung von modularen Hydrogelfolien und der Zusammensetzung und der 3D-Zellgerüste bilden. Um eindeutige gemustert Alginat Strukturen in kurzer Zeit zu bauen, sollten wir eine Vernetzung Prozess, der ausreichend steif Strukturen erstellen können, die komplexen Mikrostrukturen aus der Form zu halten, sowie Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und den Stoffwechsel zu identifizieren. Wir haben ein Vernetzungsverfahren entwick...

Hydrogele sind besonders vielversprechender Biomaterialien und sollen in grundlegende Biologie, pharmakologischen Tests und der Medizin wichtig. 1 Biofabrication von Hydrogel-basierten zellularen Konstrukte wurde vorgeschlagen, um die Verwendung von Tierversuchen zu reduzieren, 2,3 ersetzen transplantierbaren Geweben, 4 und verbessern zellbasierte Assays. 5,6 Wasser enthaltende (hydro-) viskoelastische Materialien (Gele) ermöglichen eine große Anzahl von Zellen, die eingekapselt und in einer Gerüststruktur, die 3D-zelluläre Mikroumgebung steuern aufrechterhalten werden. In Verbindung mit der Führung des mikrofluidischen oder Mikrostrukturierungstechniken kann die Geometrie der Hydrogel-Konstrukte genau auf zellulärer Ebene gesteuert werden. Bis heute sind eine Vielzahl von Formen von Hydrogelen, einschließlich Teilchen, 7-9 Fasern, 10 - 12 und Blatt, von 13 bis 15 wurden als Bausteine ​​in von unten nach oben ange verwendetSchmerzen auf die Herstellung von Makromaßstab mehrzelligen Architekturen. Beide Hydrogel-basierte Partikel und Fasern sind für Anwendungen wie Mikromaßstab zellulären Umgebungen war leicht und schnell hergestellt, mit fluidischen Steuerungen mit mikrofluidischen Vorrichtungen. Da jedoch die Grundeinheiten von technischen Geweben, würde es schwierig sein, um sie neu anzuordnen und um es zu vergrößern ihr Volumen als Makromaßstab Konstrukte. 16 Es ist schwieriger makro skaliert Konstrukte zu erreichen, als mikrometergroße Grundmodule zu produzieren. Blattartigen Einheiten Hydrogelbasis Konstrukte können verwendet werden, um das Volumen der Gerüste durch einen einfachen Montageprozess zu erhöhen. Folgerichtig gestapelten Schichten Hydrogelfolien bieten nicht nur eine Volumenvergrößerung, sondern auch eine geometrische Ausdehnung in einem 3D-Raum. Wir haben bereits berichtet, ein Verfahren zur Herstellung mikro Hydrogelfolien, 13 - 15 zusammen mit ihrer Anordnung in mehreren LegeEred Zellarchitekturen. Die Technik ermöglicht komplexe Mikrostrukturierung und der modulare Aufbau von Zellkonstrukten über einen Stapelvorgang von mehrschichtigen Strukturen. Durch die Herstellung von gestapelten modularen Hydrogelfolien, die mikrostrukturiert sind, kann ein 3D-Zellkultursystem mit einer gesteuerten Makromaßstab zelluläre Mikroumgebung realisiert werden. Dieses Video-Protokoll beschreibt ein einfaches, aber leistungsfähiges Herstellungsverfahren, das verwendet werden kann, um modulare Hydrogelfolien konstruieren, auf der Grundlage der menschlichen Leberzelllinie (HepG2). Wir zeigen hier einfache Manipulation dieser gemusterten modularen Hydrogelfolien und deren Anordnung in eine Mehrschichtstruktur.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Pulverförmiges nichtionisches Tensid&nbsp;</td></tr><tr><td>Alginsäure-Natriumsalz, niedrige Viskosität</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Luftbefeuchter</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Modifizierte Ausrüstung, Maximale Sprühmenge: 250 ml/h</td></tr><tr><td>Nylon-Netzfilter hydrofilisch, 180 &mu; m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Form</td><td></td><td></td><td>Kundenspezifische Form zur Herstellung eines PDMS-Rahmenmusters</td></tr></tbody></table>

bau von modular hydrogel blätter für mikrostrukturierten makro skaliert 3d cellular architektur

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogele können auf der Mikrowaage unter Verwendung von Mikrofluid oder Mikrostrukturierungstechniken, um eine in vivo-ähnliche dreidimensionale (3D) Gewebegeometrie bereitzustellen strukturiert werden. Die erhaltenen 3D Hydrogelbasis zellulären Konstrukte wurden als Alternative zu Tierversuchen zur weitgehenden biologischen Studien, pharmakologischen Tests und Organtransplantationsanwendungen eingeführt. Obwohl auf Hydrogel-Basis und Fasern können leicht hergestellt werden, ist es schwierig, sie zum Wiederaufbau von Gewebe zu manipulieren. In diesem Video, beschreiben wir ein Herstellungsverfahren für mikro Alginat-Hydrogel Blättern, zusammen mit deren Montage ein Makro angelegte 3D-Zellkultursystem mit einem kontrollierten zellulären Mikroumgebung bilden. 200 um und mit präzisen Mikro - unter Verwendung einer Nebelform des Calcium-Geliermittel werden dünne Hydrogelfolien leicht mit einer Dicke im Bereich von 100 erzeugt. Zellen können dann mit der geometrischen Führung der Hydrogelfolien in gezüchtet werdenfreistehenden Bedingungen. Weiterhin kann die Hydrogelfolien leicht manipuliert werden mit einer Mikropipette mit einem End-Schnittspitze und kann durch Stapeln unter Verwendung einer gemusterten Polydimethylsiloxan (PDMS) Rahmen in mehrschichtigen Strukturen aufgebaut werden. Diese modularen Hydrogelfolien, die mit einem einfachen Verfahren hergestellt werden kann, gibt es Anwendungsmöglichkeiten der in vitro-Wirkstoffassays und biologische Untersuchungen, einschließlich funktionelle Studien von Mikro- und Makrostruktur und Geweberekonstruktion.

Wir haben die Herstellung und Manipulation von freistehenden Mobil Hydrogel Blättern beschrieben. Wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt wir mikro PDMS Schimmelpilze und zellhaltige Hydrogel wurde auf die hydrophile Oberfläche dieser Formen und geladen vernetzt mit einem Luftbefeuchter, um eine aerosolierte Nebel von Geliermittel zu erzeugen. Nach der Freigabe aus den Formen wurden HepG2-Zellen in freistehender Hydrogelfolien mit verschiedenen Mustern (Abbildung</st...

Wir beschreiben die Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogelplatten mit einem einfachen Prozess, der in einer freistehenden Form zusammengesetzt und manipuliert werden kann. Unter Verwendung dieser modularen Hydrogel-Platten kann ein einfaches makroskaliertes 3D-Zellkultursystem mit einer kontrollierten zellulären Mikroumgebung erzeugt werden.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die einfache Herstellung, Handhabung und Montage modularer Hydrogelschichten für ein 3D-Zellkultursystem zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Gewebeingenieurwesens zu beantworten, beispielsweise, wie man funktionellere, in-vivo-ähnliche konstruierte Gewebe mithilfe kultivierter Mikroumgebungen erzeugt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass zelluläre Hydrogel-Konstrukte ohne zusätzliche kostspielige Aufwendungen generiert werden können.Die 3D-Zellkulturbedingungen hängen von jedem einzelnen modularen Hydrogelsheet ab. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zu verbesserten zellbasierten Assays und biologischen Studien, da die Technik verschiedene Geometrien und Zusammensetzungen von 3D-zellulären Mikro- und Makroumgebungen bereitstellen kann. Obwohl diese Methode Einblicke in zellbasierte In-vitro-Assays ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf transplantierbare Gerüste von 3D-Gewebemodellen.Beginnen Sie mit der Herstellung der gewünschten mikroskaligen Muster unter Verwendung standardmäßiger Photolithographietechniken. Das in diesem Video gezeigte Beispiel verwendet ein netzartiges Muster, das einem Leberazinus ähnelt, wie hier dargestellt. Wiegen Sie anschließend 2,5 Gramm PDMS und 2,5 Gramm der Härterlösung ab und mischen Sie die Komponenten gründlich miteinander.Entgasen Sie die Lösung in einer Vakuumkammer und verteilen Sie die gemischte Lösung anschließend gleichmäßig auf der mikrostrukturierten Oberfläche des Siliziumwafers in einer Gießschale aus Folie. Danach härten Sie das PDMS, indem Sie die Schale für 90 Minuten auf eine beheizte Platte mit einer Temperatur von 65 Grad Celsius stellen. Nach der Aushärtung entfernen Sie das PDMS vorsichtig aus der Gießschale und lösen es behutsam vom Siliziumwafer.Schneiden Sie die Ränder des PDMS ab und platzieren Sie den strukturierten Teil auf eine Petrischale mit 100 mm Durchmesser, sodass die mikrostrukturierte Seite nach oben zeigt. Anschließend waschen Sie das mikrostrukturierte PDMS mit 70 % Ethanol und danach mit destilliertem Wasser, um eine erste Sterilisation durchzuführen. Danach trocknen Sie die Probe vollständig für 10 Minuten in einem Ofen bei 65 Grad Celsius. Als Nächstes das mikrostrukturierte PDMS-Formteil in einen Plasma-Reiniger geben und eine Minute lang reinigen, um eine hydrophile Oberfläche zu erzeugen. Dies erleichtert das Befüllen mit wässrigen Flüssigkeiten. Anschließend die Oberfläche des PDMS mit 100 Milliliter der in der Materialtabelle aufgeführten Tensidlösung beschichten.Die Proben mindestens drei Stunden lang auf einem Laborr&uuml;ttler inkubieren. Anschlie&szlig;end die Tensidl&ouml;sung mithilfe von steriler Wasser von den PDMS-Formen abwaschen und diese vollst&auml;ndig im Ofen bei 65 Grad Celsius f&uuml;r 10 Minuten trocknen. Danach jede mikrostrukturierte Form sterilisieren, indem sie 30 Minuten lang UV-Strahlung ausgesetzt wird.Kultivieren Sie HepG2-Zellen zunächst mit standardisierten Techniken. Sobald die Zellen zu 70 % bis 80 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Anschließend lösen Sie die Zellen durch Zugabe von einem Milliliter 0,5 %iger Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren sie vier Minuten bei 37 °C.Nach dem Ablösen sammeln Sie die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie bei 250 g für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen anschließend in einem Milliliter PBS. Zählen Sie die Anzahl der einzeln verteilten Zellen in PBS mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts.Anschießend pelletieren Sie die Zellen erneut bei 250 g für drei Minuten. Entfernen Sie das PBS-Überstand und geben Sie so viel einer einprozentigen Natriumalginatlösung zu den Zellen, dass die endgültige Aussaatdichte zwischen fünf und zehn Millionen Zellen pro Milliliter liegt. Mischen Sie die Zelllösung vorsichtig mit einer Pipette und inkubieren Sie die Zellhydrogelsuspension dann in einem feuchten Inkubator mit fünf Prozent CO2 bei 37 Grad Celsius.Während die Zellen inkubieren, die mikromustergeprägten PDMS-Formen in einen Plasma-Reiniger geben und eine Minute lang bei 85 Watt reinigen, um eine hydrophile Oberfläche zu erzeugen. Die Zellhydrogel-Suspension durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mischen und dann kontinuierlich 7,2 Mikroliter der Suspension am Rand des Mikromusters in der Form auftragen. Anschließend die Zellhydrogel-Suspension verfestigen, indem mit dem Luftbefeuchter fünf Minuten lang ein Nebel des Vernetzungsreagenz mit einer Rate von 250 Milliliter pro Stunde erzeugt und auf den Hydrogel-Vorläufer gesprüht wird.Stellen Sie sicher, dass dieses Verfahren die topographische Oberfläche der PDMS-Form innerhalb eines Bereichs von fünf Zentimetern abdeckt. Nach dem Vernetzungsprozess schalten Sie den Luftbefeuchter aus und füllen die PDMS-Form mit PBS. Geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig PBS entlang der Ränder der gehärteten Hydrogelschichten ab, um jedes der Hydrogele zu lösen.Pipettieren Sie dann mithilfe einer abgeschnittenen Pipettenspitze für 1.000 µL jede schwimmende Hydrogelschicht auf und überführen Sie jede Hydrogelschicht in einzelne Mulden einer 12-Mulden-Platte, die jeweils ein Milliliter vorgewärmtes DMEM enthalten, sodass sie auf der Oberfläche des Kulturmediums schwimmen. Kultivieren Sie die Zellen eine Woche lang unter diesen Bedingungen und wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag.Als Nächstes stellen Sie einen PDMS-Rahmen her, der an der unteren Oberfläche 170&nbsp;Mikrometer hohe Säulenstrukturen aufweist, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Während der Herstellung wird eine spezielle Polycarbonatform auf das Siliziumwafer für den PDMS-Rahmen platziert, um einen Innenrahmen mit einer Breite von acht Millimetern, einer Höhe von neun Millimetern und einer Tiefe von zwei Millimetern zu erzeugen. Nach der Sterilisation wird der PDMS-Rahmen auf ein Viertel eines Stückes Nylonfilterpapier gelegt, das in einer 60-Millimeter-Petri-Schale positioniert ist.Entfernen Sie die Hydrogelschichten aus dem Inkubator und übertragen Sie die erste der modularen Hydrogelschichten mit einer abgeschnittenen 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze in das Innere des PDMS-Rahmens. Richten Sie die Kante der modularen Hydrogelschicht mit dem PDMS-Rahmen mithilfe einer leeren 200-Mikroliter-Pipettenspitze aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit weiteren Hydrogelschichten, bis ein Stapel aus vier bis sechs Schichten erreicht ist.Als Nächstes entfernen Sie das Kulturmedium, indem Sie es durch die Säulenstrukturen am Boden des PDMS-Rahmens leiten. Fügen Sie dann zwei Mikroliter einer zweiprozentigen Alginate-Lösung an einer Ecke des mehrschichtigen Konstrukts hinzu. Sprühen Sie mithilfe eines Befeuchters dreißig Sekunden lang einen Nebel des Vernetzungsreagenz mit einer Rate von 250 Milliliter pro Stunde auf das mehrschichtige Konstrukt, um die Ränder jeder Schicht miteinander zu verbinden.Anschließend den mehrschichtigen Konstrukt vorsichtig mit 400 Mikrolitern DMEM spülen und den PDMS-Rahmen mit einer Pinzette entfernen. Danach weitere vier Milliliter DMEM hinzufügen. Den mehrschichtigen Konstrukt mithilfe des Filterpapiers vorsichtig mit einem Zellabheber abstreifen und dann mit dem Filterpapier in eine sechswellige Platte überführen, die drei Milliliter DMEM enthält.Kultivieren Sie die Zellen schwimmend mit einem Hydrogel-Konstrukt als mehrskaligem zellulärem Gerüst in der 6-Loch-Platte mindestens eine Woche lang. Wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag. Das Ergebnis einer schichtweisen Anordnung von leberlobulusähnlichen, mikrostrukturierten Hydrogel-Schichten wird hier gezeigt, wobei grün fluoreszierende humane Leberkarzinomzellen und rot fluoreszierende NIH-3T3-Fibroblasten gemeinsam in einer Kokultur auf einem kombinierten Netz gezüchtet wurden.Mithilfe der hier vorgestellten Technik können zahlreiche Musterabwandlungen erzeugt werden, darunter hexagonale Säulen, dünne Netze, vollständige Arrays sowie mehrfache mikrokammähnliche Mikrofasern in Form eines dünnen Hydrogel-Constructs im Bereich von 100 bis 200 Mikrometern. Diese Strukturen bieten eine vielseitige 3D-Kulturgelegenheit für viele verschiedene Zelltypen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie zelluläre Hydrogel-Schichten zur zellulären Konstruktion lebensechter 3D-Kultursysteme von unten nach oben hergestellt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

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Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

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