Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die einfache Herstellung, Manipulation und Montage von modularen Hydrogelplatten für ein 3D-Zellkultursystem zu demonstrieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Tissue Engineering zu beantworten, z. B. wie man in vivo ähnlichere, funktionellere künstlich hergestellte Gewebe mit kultivierten Mikroumgebungen herstellen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass zelluläre Hydrogelkonstrukte ohne kostspieligen Zuwachs erzeugt werden können.

Die Bedingungen für die 3D-Zellkultur hängen von der jeweiligen modularen Hydrogelfolie ab. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf verbesserte zellbasierte Assays und biologische Studien, da die Technik verschiedene Geometrien und Zusammensetzungen von zellulären 3D-Mikro- und Makroumgebungen liefern kann. Obwohl diese Methode Einblicke in zellbasierte In-vitro-Assays geben kann, kann sie auch auf ein anderes System angewendet werden, z. B. auf ein transplantierbares Gerüst eines 3D-Gewebemodells.

Beginnen Sie mit der Herstellung der gewünschten mikroskaligen Muster mit Standard-Fotolithographietechniken. Das in diesem Video gezeigte Beispiel verwendet ein leberläppchenartiges Maschenmuster wie das hier gezeigte. Wiegen Sie anschließend 2,5 Gramm PDMS und 2,5 Gramm der Härterlösung ab und mischen Sie die Komponenten gründlich miteinander.

Entgasen Sie die Lösung in einer Vakuumkammer und verteilen Sie dann die gemischte Lösung gleichmäßig auf der Mikrostrukturoberfläche des Siliziumwafers in einer Foliengießschale. Härten Sie dann das PDMS aus, indem Sie das Gericht 90 Minuten lang auf die flache Oberfläche einer bei 65 Grad Celsius erhitzten Platte stellen. Nach dem Aushärten nehmen Sie das PDMS aus der Gießschale und ziehen es vorsichtig vom Siliziumwafer ab.

Schneiden Sie die Ränder des PDMS ab und legen Sie den gemusterten Teil so auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern, dass die Mikromusterseite nach oben zeigt. Waschen Sie dann das mikrostrukturierte PDMS mit 70 % Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser, zur Primärsterilisation. Anschließend trocknest du das Setup 10 Minuten lang komplett im Backofen bei 65 Grad Celsius.

Legen Sie anschließend die mikrostrukturierte PDMS-Form in einen Plasmareiniger und reinigen Sie sie eine Minute lang, um eine hydrophile Oberfläche zu erzeugen. Dies erleichtert das Laden von wässrigen Flüssigkeiten. Beschichten Sie dann die Oberfläche des PDMS mit 100 Millilitern der in der Materialtabelle aufgeführten Tensidlösung.

Inkubieren Sie die Proben mindestens drei Stunden lang auf einer Laborwippe. Waschen Sie anschließend die Tensidlösung aus den PDMS-Formen mit sterilem Wasser und trocknen Sie sie 10 Minuten lang vollständig in einem Ofen bei 65 Grad Celsius. Sterilisieren Sie dann jede mikrostrukturierte Form, indem Sie sie 30 Minuten lang ultravioletter Strahlung aussetzen.

Beginnen Sie mit der Kultivierung von hepg2-Zellen mit Standardtechniken. Sobald die Zellen zu 70 % bis 80 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Ernten Sie dann die Zellen, indem Sie einen Millileter 05%Tripsin edta hinzufügen und sie vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach dem Lösen werden die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen gesammelt und drei Minuten lang mit 250 g pelletiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Millileter PBS. Zählen Sie die Anzahl der einzelnen verteilten Zellen in PBS mit einem automatisierten Zellzähler.

Pelletieren Sie die Zellen dann erneut drei Minuten lang bei 250 g. Entfernen Sie den PBS-Überstand und geben Sie so viel von einer einprozentigen Natriumalginatlösung in die Zellen, dass die endgültige Aussaatdichte zwischen fünf und zehn Millionen Zellen pro Millileter liegt. Mischen Sie die Zelllösung vorsichtig mit einer Pipette und inkubieren Sie dann die Zellhydrogel-Suspension in einem mit fünf Prozent CO2 befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Während die Zellen inkubieren, legen Sie die mikrostrukturierten PDMS-Formen in einen Plasmareiniger und reinigen Sie sie eine Minute lang bei 85 Watt, um eine hydrophile Oberfläche zu erzeugen. Mischen Sie die Zellhydrogel-Suspension, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren und dann gleichmäßig 7,2 Mikroliter der Suspension am Rand des Mikromusters in die Form laden. Dann gelieren Sie die Zellhydrogel-Suspension, indem Sie mit dem Luftbefeuchter einen Nebel des Vernetzungsreagenzes mit einer Geschwindigkeit von 250 Millilitern pro Stunde erzeugen und ihn fünf Minuten lang auf den Hydrogel-Vorläufer sprühen.

Stellen Sie sicher, dass dieses Verfahren die topografische Oberfläche des PDMS-Werkzeugs in einem Bereich von fünf Zentimetern abdeckt. Schalten Sie nach dem Vernetzungsprozess den Luftbefeuchter aus und füllen Sie die PDMS-Form mit PBS. Geben Sie PBS mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig um den Rand der ausgehärteten Hydrogelplatten herum ab, um jedes der Hydrogele abzulösen.

Nehmen Sie dann jedes schwimmende Hydrogelblatt mit einer am Ende abgeschnittenen 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze auf. Übertragen Sie jede Schicht des Hydrogels in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Platte, die einen Millileter vorgewärmtes DMEM enthält, so dass sie auf der Oberfläche des Mediums schwimmen. Kultivieren Sie die Zellen eine Woche lang auf diese Weise, wobei das Kulturmedium jeden zweiten Tag ausgetauscht wird.

Erstellen Sie als Nächstes einen PDMS-Rahmen, der an der Unterseite 170 Mikrometer hohe Säulenstrukturen enthält, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie während der Herstellung eine spezielle Polycarbonat-Form auf dem Siliziumwafer für den PDMS-Rahmen, um einen Innenrahmen mit einer Breite von acht Millimetern, einer Höhe von neun Millimetern und einer Tiefe von zwei Millimetern zu erstellen. Legen Sie nach der Sterilisation den PDMS-Rahmen auf ein Viertel eines Stücks Nylonfilterpapier, das in einer 60-Millimeter-Petrischale eingesetzt wird.

Entnehmen Sie die Hydrogelplatten aus dem Inkubator und überführen Sie die erste der modularen Hydrogelplatten mit einer abgeschnittenen 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze in das Innere des PDMS-Rahmens. Richten Sie die Kante der modularen Hydrogelplatte mit einer leeren 200-Mikroliter-Pipettenspitze am PDMS-Rahmen aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit zusätzlichen Hydrogelplatten, bis ein Stapel von vier bis sechs Schichten erreicht ist.

Entfernen Sie anschließend das Kulturmedium, indem Sie es durch die Säulenstrukturen am unteren Rand des PDMS-Rahmens fließen lassen. Fügen Sie dann zwei Mikroliter einer zweiprozentigen Alginatlösung an einer Ecke des mehrschichtigen Konstrukts hinzu. Sprühen Sie mit einem Luftbefeuchter dreißig Sekunden lang einen Nebel des Vernetzungsreagenzes mit einer Geschwindigkeit von 250 Millitern pro Stunde auf das mehrschichtige Konstrukt, um die Kanten jeder Schicht miteinander zu verbinden.

Spülen Sie dann den mehrschichtigen Aufbau vorsichtig mit 400 Mikrolitern DMEM ab und entfernen Sie den PDMS-Rahmen mit einer Pinzette. Fügen Sie dann weitere vier Milliliter DMEM hinzu. Lösen Sie das mehrschichtige Konstrukt mit dem Filterpapier, indem Sie es vorsichtig mit einem Zellheber abwischen, und übertragen Sie es dann mit Filterpapier auf eine Sechs-Well-Platte, die drei Milliliter DMEM enthält.

Kultivieren Sie die Zellen schwimmend mit einem Hydrogel-Konstrukt als multiskaliges zelluläres Gerüst in der Sechs-Well-Platte für mindestens eine Woche. Tauschen Sie das Nährmedium jeden zweiten Tag aus. Das Ergebnis einer schichtweisen Assemblierung von Leberläppchen-ähnlichen mikrogemusterten Hydrogelschichten ist hier dargestellt, bei der grün fluoreszierende humane Leberkarzinomzellen und rot fluoreszierende NIH-3T3-Fibroblasten in Co-Kultur auf einem kombinierten Netz zusammen gezüchtet wurden.

Unter Verwendung der hier vorgestellten Technik können viele Mustervariationen erzeugt werden, einschließlich sechseckiger Säulen, dünner Maschen, ganzer Arrays und mehrerer mikrokammartiger Mikrofasern in Form eines dünnen Hydrogelkonstrukts in der Größenordnung von 100 bis 200 Mikrometern. Diese Strukturen bieten eine reichhaltige 3D-Kulturumgebung für viele verschiedene Zelltypen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelluläre Hydrogelschichten für die Entwicklung von In-vivo-ähnlichen 3D-Kultursystemen von Grund auf erstellt.