In vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Mikrogliadynamik im Hippocampus der Maus

Nehmen wir eine anästhesierte transgene Maus, die fluoreszierende Proteine in Mikroglia exprimiert. Befestigen Sie es auf einem stereotaktischen Rahmen mit einem motorisierten Tisch unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop.

Der Schädel ist mit einem Metallrohr mit Glasboden ausgestattet, das die Alveus über der Region des Hippocampus cornu ammonis 1 oder CA1 sanft abflacht und so eine klare optische Schnittstelle ohne

übermäßigen Druck auf das darunter liegende Gewebe gewährleistet.

Füllen Sie das Metallrohr mit Wasser, um die optische Transmission zu optimieren.

Aktivieren Sie den gepulsten Laser bei der Anregungswellenlänge.

Passen Sie mithilfe der Fluoreszenz aus dem Hirnparenchym und des reflektierten Lichts aus der Metallröhre den Fokus auf die CA1-Region an.

Positionieren Sie den Kopf der Maus so, dass der Glasboden parallel zur Bildebene ausgerichtet ist, um eine gleichmäßige Fokussierung über das gesamte Sichtfeld zu gewährleisten.

Passen Sie das Objektiv für eine optimale Auflösung an und beobachten Sie die In-vivo-Dynamik der Mikroglia in der CA1-Region.

Als nächstes bilden Sie den Gyrus dentatus ab, wo fluoreszierende Mikroglia die CA1-Integrität bestätigen.

Setzen Sie die Maus in die Kopfhaltevorrichtung unter die Objektivlinse des Zwei-Photonen-Mikroskops und auf den motorisierten XY-Scantisch. Füllen Sie dann den Raum zwischen dem Glasboden und der Objektivlinse mit Wasser, ohne dass Luftblasen entstehen. Der Fokus wird unter Anleitung der vom Hirnparenchym emittierten Fluoreszenz und des vom Rand des Metallrohrs reflektierten Lichts unter ständiger Beleuchtung durch den gepulsten Laser auf CA1 eingestellt.

Stellen Sie den Winkel des Mauskopfes ein, indem Sie die Kopfhalterung so neigen, dass der Glasboden parallel zur Bildebene verläuft. Passen Sie dann den Korrekturkragen des Objektivs an, um die höchste Auflösung in einer Tiefe der Zielstruktur in der CA1 zu erreichen. Bestätigen Sie als nächstes, dass die fluoreszierenden Zellen in der Molekülschicht des Gyrus dentatus (DG) in einer Tiefe von 500 Mikrometern über dem Glasboden im gesamten Sichtfeld abgebildet werden. Nur im Falle einer erfolgreichen Operation können die DG-Signale sofort erkannt werden.

Stellen Sie sicher, dass die Mikroglia ihre verzweigte Morphologie wiedererlangt haben. Führen Sie dann eine In-vivo-Bildgebung auf der interessierenden Schicht im CA1 durch.