Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Potentialänderungen der Membran mit einem genetisch kodierten Spannungsindikator optisch darzustellen. Diese Methode soll die Stärken und Schwächen der Bildgebung mit verschiedenen genetisch kodierten Fluoreszenzsonden der Spannung beschreiben. Zum Beispiel bieten FRET-basierte Sonden den Vorteil der ratiometrischen Bildgebung, liefern aber ein geringeres Signal.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die neuronale Aktivität in Echtzeit visualisieren können. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Signal-Rausch-Verhältnis nicht sehr groß ist und es mehrere Rauschquellen und mehrere Schritte gibt, die schief gehen können. Neue Benutzer sind oft verwirrt und Störungen werden als echte Signale angesehen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Gültigkeit der verwendeten Sonden und ihre tatsächliche Anzeige zu ermitteln. Für den Aufbau wird zwischen der langsamen und der schnellen CCD-Kamera ein Bildsplitter für die Abbildung von FRET-basierten GEVI installiert. Setzen Sie vor dem Experiment einen Filterwürfel mit einem dichroitischen Spiegel und zwei Emissionsfiltern in den Bildsplitter ein.

Entfernen Sie diesen zweiten Filterwürfel, wenn Sie ein GEVI mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein abbilden. Um das Experiment zu beginnen, lokalisieren Sie eine gesunde HEK293-Zelle, die im Vergleich zur internen Fluoreszenz eine starke, lokalisierte Membranfluoreszenz zeigt, und vermeiden Sie das Patchen kreisförmiger Zellen, wenn sie sich entweder teilen oder absterben. Legen Sie dann einen Testimpuls an, um die aktuelle Reaktion zu überprüfen.

Senken Sie anschließend die Pipette der Patch-Klemme direkt über die Zelloberfläche ab. Senken Sie dann die Pipette langsam ab, bis sie die Zellmembran sanft berührt. Der Membranwiderstand sollte auf ein bis zwei Megaohm ansteigen.

Stellen Sie danach eine Gigaohm-Versiegelung her, indem Sie vorsichtig Unterdruck durch die Pipette ausüben. Sobald eine Gigaohm-Dichtheit erreicht ist, stellen Sie das Pipettenpotential auf ein gewünschtes Haltepotenzial ein. Fokussieren Sie anschließend die Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera auf den Zellkörper.

Passen Sie für die FRET-basierte GEVI-Aufnahme die Größe der geteilten Bilder an, um eine gleichmäßig verteilte Ansicht für jede Emissionswellenlänge zu erhalten, indem Sie die Knöpfe am Bildsplitter verwenden. Dann wird die Zellmembran durch Anlegen von Unterdruck aufgebrochen, um die gesamte Zellkonfiguration zu bilden. Öffnen Sie nun die Imaging-Software.

Klicken Sie dann auf das Menü "SciMeasure-Kamera erfassen", um die CCD-Erfassungsseite zu öffnen. Erstellen Sie als Nächstes eine neue Datendatei, um die Aufzeichnung zu speichern. Klicken Sie auf Analogausgang und lesen Sie dann eine ASCII-Datei, um eine Pulsprotokolldatei zu öffnen und das Imaging durchzuführen.

Klicken Sie anschließend auf den Durchschnitt der internen Wiederholungen, um die Anzahl der Versuche zu mitteln. Schließen Sie dann die Seite für den Analogausgang. Legen Sie die spezifischen Erfassungsparameter auf der CCD-Erfassungsseite fest.

Geben Sie danach die spezifischen Werte für die Anzahl der Frames für die Erfassung und die Anzahl der Versuche ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Datenoptik plus BNC aufnehmen, um die Aufnahme zu starten. Überwachen Sie während der Spannungsabbildung das Oszilloskop, um eine stabile Ganzzellenkonfiguration während der gesamten Aufzeichnung zu gewährleisten.

Um die fraktionierte Fluoreszenz zu berechnen, klicken Sie auf Datei und dann auf Datendatei lesen, um eine Datendatei zu öffnen, die im vorherigen Schritt aufgezeichnet wurde. Das Zellbild in seiner Ruhelichtintensität sollte auf der rechten Seite zu sehen sein. Klicken Sie anschließend auf BNCs anzeigen, um die aktuellen Endspannungswerte anzuzeigen.

Ändern Sie den Seitenmodus von RLI-Frame auf Frame-Subtraktion, um die Frame-Subtraktionsfunktion zur Identifizierung der Pixel mit responsiven optischen Signalen zu verwenden. Wählen Sie als Nächstes zwei Zeitpunkte für die Subtraktion aus und identifizieren Sie den Zellbereich, der Signale als Reaktion auf die Membranpotentialänderung zeigt. Legen Sie als Nächstes die Pixel fest, die analysiert werden sollen, indem Sie jedes Pixel ziehen oder anklicken.

Die grafische Darstellung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der ausgewählten Pixel sollte auf der linken Seite des Softwarefensters angezeigt werden. Dividieren Sie die subtrahierten Pixel durch die Ruhelichtintensität, indem Sie auf die Schaltfläche Durch RLI dividieren klicken, um die Werte für die fraktionierte Fluoreszenzänderung zu erhalten. Um die Daten zu exportieren, entfernen Sie die Diagramme der aktuellen Endspannung, indem Sie auf BNC-Menü anzeigen klicken.

Gehen Sie zur Ausgabe, speichern Sie die Leiterbahnen als angezeigtes ASCII, um die Fluoreszenzspur in einem ASCII-Dateiformat für die Kurvenanpassungsanalyse zu exportieren. Zeichnen Sie in diesem Verfahren das Diagramm der Fluoreszenzänderung gegen die Spannung, indem Sie die fraktionierten Fluoreszenzänderungen als Reaktion auf die Spannung in einem Datenanalyseprogramm darstellen. Danach passen Sie die Kurve an eine Boltzmann-Funktion an, um den Spannungsbereich des optischen Signals zu bestimmen, indem Sie auf Analyse, Anpassung, sigmoidale Anpassung klicken und dann den Dialog öffnen.

die normierten fraktionierten Fluoreszenzänderungen als Reaktion auf die Spannung mit dem Datenanalyseprogramm wieder her. Um die Geschwindigkeit der optischen Reaktion zu berechnen, öffnen Sie die ASCII-Datei und zeichnen Sie die Spur der fraktionalen Fluoreszenzänderung über die Zeit. Klicken Sie dann in der Datenanalysesoftware auf den Datenselektor und wählen Sie einen Zeitpunkt aus, der dem Beginn eines abgestuften Spannungsimpulses entspricht, und einen zweiten Zeitpunkt, an dem das optische Signal den stationären Zustand erreicht hat.

Passen Sie diesen Bereich sowohl an eine einfache als auch an eine doppelte exponentielle Zerfallsfunktion an, indem Sie auf Analyse, Anpassung, Exponentialanpassung klicken, dann das Dialogfeld öffnen und die bessere Anpassung melden. Diese Abbildung zeigt die Fluoreszenzänderung einer HEK-Zelle, die ein einzelnes FP-basiertes GEVI Bongwoori exprimiert. Dies ist eine typische Fluoreszenzänderung als Reaktion auf die abgestuften Spannungsimpulse.

Hier wurde eine HEK293-Zelle mit einer Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera abgebildet. Dieses Bild zeigt die Ruhelichtintensität einer Zelle, die Bongwoori exprimiert. Und dies ist ein Frame-Subtraktionsbild, das die Pixel anzeigt, in denen eine Fluoreszenzänderung beobachtet wurde.

Hier ist die optische Aufzeichnung der induzierten Aktionspotentiale der primären Neuronen des Hippocampus der Maus zu sehen, die Bongwoori exprimieren. Die Aktionspotentiale wurden unter dem Ganzzellstrom-Clamp-Modus evoziert. Die fraktionierte Fluoreszenzänderungsspur wurde aus den Pixeln ausgewählt, die mit dem Soma korreliert waren.

In dieser Abbildung zeigt die Fluoreszenzänderung einer HEK-Zelle, die FRET-basiertes GEVI exprimiert, die Reaktionen auf die abgestuften Spannungsimpulse in zwei Wellenlängen. Aufgenommen bei einem Kilohertz mit einer Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, variable Fluoreszenzwerte zu testen, da eine Überexpression der Fluoreszenz die Gesundheit der Zelle beeinträchtigen kann.

Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. Slicer-Kodierungen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, die die Aktivität von Neuronen verschiedener Schaltkreise betreffen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Membranpotenzial mit verschiedenen Sondentypen abgebildet werden kann.