Name: Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung von Membranpotentialen mit genetisch kodierten Spannungssensoren für die Neurophysiologie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung neuronaler Aktivität in HEK293-Zellen und primären Neuronen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das World Class Institute (WCI) Programm der National Research Foundation of Korea, finanziert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie von Korea Grant WCI 2009-003 und das Korea Institute of Science and Technology Institutional Program Project 2E24210. Sungmoo Lee wurde durch das Global Ph.D. Fellowship-Programm (NRF-2013H1A2A1033344) der National Research Foundation (NRF) beim Bildungsministerium (MOE, Korea) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Nervensystem verwendet Spannung auf mehrere verschiedene Arten, Hemmung verursacht eine leichte Hyperpolarisation, synaptischen Eingangs bewirkt eine leichte Depolarisation und ein Aktionspotential führt zu einer relativ großen Spannungsänderung. Die Fähigkeit von GeViS Änderungen des Membranpotentials zu messen bietet das vielversprechende Potential von gleichzeitig mehreren Komponenten neuronaler Schaltkreise analysieren. In diesem Bericht zeigen wir eine grundlegende Methode zur Bildgebung Änderungen des Membranp...

Der Schwerpunkt dieses Aufsatzes ist das optische Abbildungsveränderungsmembranpotentiale in vitro zu zeigen, unter Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen. Imaging Änderungen des Membranpotentials bietet die aufregende Möglichkeit, die Aktivität von neuronalen studieren. Wenn Änderungen des Membranpotentials führen zu einer Veränderung der Fluoreszenzintensität, wird jedes Pixel der Kamera ein Surrogat Elektrode eingriffsfreien Messung der neuronalen Aktivität ermöglicht. Seit über vierzig Jahren, organische spannungsabhängigen Farbstoffen wurden zur Beobachtung der Veränderungen des Membranpotentials 4.1 nützlich. Jedoch fehlt diesen Farbstoffen zelluläre Spezifität. Darüber hinaus sind einige Zelltypen schwierig zu färben. Genetisch kodierte Spannungsanzeigen (GeViS) überwinden diese Einschränkungen durch die Zellen spezifisch ausdrücken die fluoreszierende spannungsempfindliche Sonde untersucht werden müssen. Es gibt drei Klassen von GeViS. Die erste Klasse von GEVI verwendet die vorsorgungs--Sensing-Domain von der Spannungsfühl Phosphatase entweder mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein (FP) 5-9 oder ein Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Paar 10-12. Die zweite Klasse von Sensoren verwendet mikrobiellen Rhodopsin als Fluoreszenzindikator direkt 13-15 oder über elektrochromen FRET 16,17. Die dritte Klasse verwendet zwei Komponenten, die genetische Komponente eine Membran verankert FP und eine zweite Komponente, die eine membrangebundene Abschrecken Farbstoff ist 18-20 ist. Während die zweiten und dritten Klassen, die für in vitro und Scheibe Experimente sind 19,20, nur die erste Klasse von Sensoren liegen noch nützlich für die in vivo 6 analysiert. In diesem Bericht werden wir die Darstellung von Membranpotential unter Verwendung der ersten Klasse von GeViS (Abbildung 1) in vitro zeigen. Diese erste Klasse von Spannungssensoren ist am einfachsten zu in-vivo-Bildgebung übergeht. Seit GeViS utilizing eine Spannung fühlenden Domain auf einen FP verschmolzen sind etwa 50-fach heller als das Rhodopsin Klasse von Sensoren, können sie eher als einen extrem leistungsfähigen Laser erfordern mit Bogenlampe Beleuchtung abgebildet werden. Eine weitere Folge der Unterschiede in der Helligkeit ist, dass die erste Klasse von GeViS leicht die Autofluoreszenz des Gehirns übersteigen kann. Die Rhodopsin-basierte Sonden kann es nicht. Die dritte Klasse von Sensor ist ebenso hell wie die erste Klasse erfordert aber die Zugabe eines chemischen Quencher, die schwierig in vivo zu verabreichen. Wir werden daher zeigen die Übernahme einer Sonde mit einem einzigen FP (Bongwoori) 8 und eine Sonde, bestehend aus einem FRET-Paar (Nabi 2) 12. Die FRET-Konstrukte in diesem Bericht sind Schmetterling Versionen VSFP-CR (spannungssensitiven Fluoreszenzproteine ​​- Klee-mRuby2) 11, bestehend aus einem grün fluoreszierenden Spender, Klee, und ein rot fluoreszierendes Akzeptor, mRuby2 namens Nabi 2.242 und 2.244 Nabi <sbis&gt; 12. Die Einführung auf diese Arten von Aufnahmen sollten Forscher geben ein besseres Verständnis der Art der Informationen GeViS bereitstellen kann. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Abbildung 1. Zwei Arten von genetisch kodierte Spannungsanzeiger (GeViS) abgebildet in diesem Bericht (A) ein FP Mono basierend GEVI ein Transmembranspannung-Sensing-Domäne und ein fluoreszierendes Protein mit. (B) Ein FRET basierten GEVI bestehend aus einem Transmembranspannung-Sensing-Domäne, einer FRET-Donor und Akzeptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X Objektiv (numerische Apertur = 1,35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Anregungsfilter</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td><td>Für die Spannungsabbildung von Super-Ekliptik pHluorin im dichroitischen Spiegel von Bongwoori</td></tr><tr><td></td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emissionsfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Xenon-Bogenlampe</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>LEDs und Laser sind ebenfalls effektive Lichtquellen</td></tr><tr><td>CCD-Kamera mit langsamer Geschwindigkeit</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Port-Kameraadapter</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Bildsplitter</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Anregungsfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>Für die Spannungsabbildung von FRET-Paar-basierten GEVI bestehend aus Clover und mRuby2)</td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Emissionsfilter</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Emissionsfilter</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Schwingungsisolationssystem</td><td>Kinetic systems</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Patching-Kammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Mikro-Deckglas (22 x 40 mm)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - Glasdeckglas mit 10 mm Durchmesser</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektionsmittel</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Calciumphosphat-Reagenz</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Verstärker</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB-Verstärker</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanal-Datenerfassungssoftware</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassungs- und -analysesoftware</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet-Anwendungssoftware</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Datenanalyse-Software</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lupe</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem Standard Kamerakoppler 0,38x SC38 J Klemme</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R Konfokales Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging membrane potential mit zwei arten von genetisch kodierten fluorescent spannungssensoren

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetisch kodierte Spannungsindikatoren (GEVIs) haben sich bis zu dem Punkt verbessert, an dem sie beginnen, für In-vivo-Aufzeichnungen nützlich zu sein. Während das ultimative Ziel darin besteht, die neuronale Aktivität in vivo abzubilden, muss man in der Lage sein, die Aktivität einer einzelnen Zelle abzubilden, um eine erfolgreiche In-vivo-Vorbereitung zu gewährleisten. In diesem Verfahren wird beschrieben, wie das Membranpotenzial in einer einzelnen Zelle abgebildet werden kann, um eine Grundlage für die spätere Abbildung in vivo zu schaffen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren zur Bildgebung von GEVIs, die aus einer spannungsmessenden Domäne bestehen, die entweder mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein (FP) oder zwei fluoreszierenden Proteinen fusioniert ist, die in vitro zum Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) fähig sind. Die Verwendung eines Bildsplitters ermöglicht die gleichzeitige Projektion von Bildern, die mit zwei verschiedenen Wellenlängen erzeugt wurden, auf dieselbe CCD-Kamera (Charge-Coupled Device). Der Bildsplitter positioniert einen zweiten Filterwürfel im Strahlengang. Dieser zweite Filterwürfel besteht aus einem dichroitischen und zwei Emissionsfiltern zur Trennung der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzwellenlängen in Abhängigkeit von den FPs des GEVI. Dieser Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung des Akzeptor- und des Donor-Fluoreszenzpartners, während das Membranpotential über die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration manipuliert wird. Bei Verwendung eines GEVI, das aus einem einzigen FP besteht, kann der zweite Filterwürfel entfernt werden, so dass die Spiegel im Bildsplitter ein einzelnes Bild auf die CCD-Kamera projizieren können.

Transient transfizierten Zellen können signifikante Veränderung in der Fluoreszenzintensität zeigen und den Grad der Plasmamembranexpression. Auch auf dem gleichen Deckglas haben einige Zellen Ebenen der inneren Fluoreszenz variiert. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Menge an Transfektionsmittel von der Zelle absorbiert. Gelegentlich zuviel Ausdruck der Zelle bewirkt, dass die entfaltete Protein-Reaktion, was zu Apoptose 27 zu erfahren (helle, runde Zellen mit hohen intern...

Es wird ein Verfahren zur Abbildung von Änderungen des Membranpotentials unter Verwendung genetisch kodierter Spannungsindikatoren beschrieben.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Änderungen des Membranpotentials optisch mittels eines genetisch kodierten Spannungsindikators darzustellen. Diese Methode beschreibt die Stärken und Schwächen der Bildgebung mit verschiedenen genetisch kodierten fluoreszierenden Spannungsproben. So bieten beispielsweise auf FRET basierende Proben den Vorteil der verhältnisbestimmten Bildgebung, liefern jedoch ein geringeres Signal.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die neuronale Aktivität in Echtzeit visualisieren können. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Signal-Rausch-Verhältnis nicht sehr hoch ist und es mehrere Rauschquellen sowie mehrere Schritte gibt, die fehlerhaft ablaufen können. Neue Anwender sind oft verwirrt, und Störungen werden fälschlicherweise als echte Signale interpretiert.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Gültigkeit der verwendeten Sonden und deren tatsächliche Aussagekraft zu überprüfen. Für den Versuchsaufbau wird ein Bildteiler zwischen den langsamen und schnellen CCD-Kameras zur Abbildung von FRET-basierten GEVI installiert. Vor dem Experiment muss

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Äußeres elektrisches Feld induziert eine Spannung an der Membran einer Zelle, bezeichnet die induzierte Membran-Spannung (ΔΦ). Mit Hilfe der potentiometrischen Farbstoff di-8-ANEPPS, ist es möglich, die ΔΦ-invasiv messen. Dieses Video zeigt das Protokoll für die Messung ΔΦ mit di-8-ANEPPS.

Messung der induzierten Spannung Membran mit Di-8-ANEPPS

Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Hier präsentieren wir eine Methode, um optisch Bild Aktionspotentiale, insbesondere ventrikuläre erinnernden induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Kardiomyozyten. Die Methode basiert auf der Projektträger-gesteuerte Ausdruck eines Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins.

Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet ventrikuläre Kardiomyozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Wir stellen die Methodik zur Isolierung von murinen Myozyten vor und wie Spannungs- oder Kalziumspuren gleichzeitig mit Sarcomere-Verkürzungsspuren mittels Fluoreszenzphotometrie mit gleichzeitigen Messungen der digitalen Zellgeometrie erhalten werden können.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

Hier beschreiben wir die optische Erfassung und Charakterisierung von Aktionspotentialen aus induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen Hochgeschwindigkeits-Photometriesystem.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

Zur Untersuchung der Reaktionen erregbarer Zellen in vitro beschreibt das Protokoll die optische Überwachung von Änderungen der Aktionspotentialerzeugung aufgrund der Elektroporation an einem einfachen erregbaren Zellmodell von gentechnisch veränderten Tet-on-Spiking-HEK-Zellen sowie von Änderungen der Transmembranspannung mit automatisierter Extraktion relevanter Parameter.

Überwachung von Elektroporations-induzierten Veränderungen der Aktionspotentialbildung in gentechnisch veränderten Tet-On-Spiking-HEK-Zellen

Lernen Sie die Bildgebung von Membranpotentialen mit genetisch kodierten Spannungssensoren für die Neurophysiologie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung neuronaler Aktivität in HEK293-Zellen und primären Neuronen.

Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

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