Imaging Membrane Potential mit zwei Arten von genetisch kodierten Fluorescent Spannungssensoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Änderungen des Membranpotentials optisch mittels eines genetisch kodierten Spannungsindikators darzustellen. Diese Methode beschreibt die Stärken und Schwächen der Bildgebung mit verschiedenen genetisch kodierten fluoreszierenden Spannungsproben. So bieten beispielsweise auf FRET basierende Proben den Vorteil der verhältnisbestimmten Bildgebung, liefern jedoch ein geringeres Signal.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die neuronale Aktivität in Echtzeit visualisieren können. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Signal-Rausch-Verhältnis nicht sehr hoch ist und es mehrere Rauschquellen sowie mehrere Schritte gibt, die fehlerhaft ablaufen können. Neue Anwender sind oft verwirrt, und Störungen werden fälschlicherweise als echte Signale interpretiert.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Gültigkeit der verwendeten Sonden und deren tatsächliche Aussagekraft zu überprüfen. Für den Versuchsaufbau wird ein Bildteiler zwischen den langsamen und schnellen CCD-Kameras zur Abbildung von FRET-basierten GEVI installiert. Vor dem Experiment muss ein Filterwürfel mit einem dichroitischen Spiegel und zwei Emissionsfiltern in den Bildteiler eingesetzt werden.

Entfernen Sie diesen zweiten Filterkubus, wenn Sie ein GEVI mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein abbilden. Um das Experiment zu beginnen, suchen Sie eine gesunde HEK293-Zelle, die eine starke, lokalisierte Membranfluoreszenz im Vergleich zur intrazellulären Fluoreszenz aufweist, und vermeiden Sie das Anlegen der Membran an runden Zellen, da diese sich entweder teilen oder absterben. Anschließend wenden Sie einen Testpuls an, um die Stromantwort zu überprüfen.

Anschließend senken Sie die Patch-Clamp-Pipette direkt über die Zelloberfläche ab. Dann verringern Sie langsam den Abstand, bis die Pipette sanft die Zellmembran berührt. Der Membranwiderstand sollte auf ein bis zwei Megaohm ansteigen.

Danach einen Gigaohm-Siegel durch vorsichtiges Anlegen von Unterdruck über die Pipette herstellen. Sobald ein Gigaohm-Siegel erreicht ist, die Pipettenpotential auf ein gewünschtes Haltepotential einstellen. Anschließend die Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera auf den Zellkörper fokussieren.

Stellen Sie für die FRET-basierte GEVI-Aufnahme mithilfe der Regler am Bildteiler die Größe der geteilten Bilder so ein, dass jede Emissionswellenlänge gleichmäßig angeordnet dargestellt wird. Dann wird die Zellmembran durch Anlegen von Unterdruck durchbrochen, um die Ganzzellkonfiguration zu erzeugen. Öffnen Sie nun die Bildgebungssoftware.

Klicken Sie anschließend im SciMeasure-Kameramenü auf „acquire“, um die CCD-Aufnahmeseite zu öffnen. Erstellen Sie danach eine neue Datendatei, um die Aufnahme zu speichern. Klicken Sie auf „analog output“ und anschließend auf „read an ASCII“, um eine Pulsprotokolldatei zu öffnen und die Bildaufnahme durchzuführen.

Klicken Sie anschließend auf „Average“, um die internen Wiederholungen zu mitteln und die Anzahl der Versuche zu durchschnittlichen. Schließen Sie dann die Seite für die analoge Ausgabe. Stellen Sie die spezifischen Erfassungsparameter auf der CCD-Erfassungsseite ein.

Geben Sie danach die spezifischen Werte für die Anzahl der Aufnahmeframes und die Anzahl der Versuche ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „take data optics plus BNC“, um die Aufnahme zu starten. Während der Spannungsbildgebung überwachen Sie das Oszilloskop, um sicherzustellen, dass die Ganzzell-Konfiguration während der gesamten Aufnahme stabil bleibt.

Um die Bruchänderung der Fluoreszenz zu berechnen, klicken Sie auf Datei und anschließend auf Daten-Datei öffnen, um eine in der vorherigen Stufe aufgezeichnete Daten-Datei zu öffnen. Das Zellbild in seiner Ruhehelligkeit sollte auf der rechten Seite zu sehen sein. Klicken Sie danach auf Zeige BNCs, um die aktuellen Endspannungswerte anzuzeigen.

Ändern Sie den Seitenmodus von RLI-Frames auf Frame-Subtraktion, um mithilfe der Frame-Subtraktionsfunktion die Pixel mit reaktiven optischen Signalen zu identifizieren. Wählen Sie anschließend zwei Zeitpunkte für die Subtraktion aus und identifizieren Sie den Zellbereich, der Signale als Reaktion auf die Änderung des Membranpotentials zeigt. Weisen Sie danach die zu analysierenden Pixel durch Ziehen oder Anklicken jedes einzelnen Pixels zu.

Die grafische Darstellung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der ausgewählten Pixel sollte auf der linken Seite des Softwarefensters erscheinen. Teilen Sie die subtrahierten Pixel durch die Ruheleuchtdichte, indem Sie auf die Schaltfläche „durch RLI teilen“ klicken, um die Werte für die relative Fluoreszenzänderung zu erhalten. Um die Daten zu exportieren, entfernen Sie die aktuellen Endspannungsdiagramme, indem Sie das Kontrollkästchen im Menü „BNC anzeigen“ deaktivieren.

Wechseln Sie zur Ausgabe und speichern Sie die Spuren als angezeigte ASCII-Datei, um die Fluoreszenzspur im ASCII-Dateiformat für die Kurvenanpassungsanalyse zu exportieren. Zeichnen Sie in diesem Verfahren den Graphen der Fluoreszenzänderung in Abhängigkeit von der Spannung, indem Sie die relativen Fluoreszenzänderungen als Reaktion auf die Spannung in einem Datenanalyseprogramm auftragen. Passen Sie anschließend die Kurve durch Klicken auf Analyse, Anpassung, sigmoidale Anpassung und dann Öffnen des Dialogs an eine Boltzmann-Funktion an, um den Spannungsbereich des optischen Signals zu bestimmen.

Stellen Sie die normalisierten relativen Fluoreszenzänderungen in Abhängigkeit von der Spannung mithilfe des Datenanalyseprogramms erneut grafisch dar. Um die Geschwindigkeit der optischen Antwort zu berechnen, öffnen Sie die ASCII-Datei und tragen die relative Fluoreszenzänderung über der Zeit auf. Klicken Sie dann im Datenanalyseprogramm auf den Datenselektor und wählen Sie einen Zeitpunkt aus, der dem Beginn eines sprunghaften Spannungsimpulses entspricht, sowie einen zweiten Zeitpunkt, an dem das optische Signal den stationären Zustand erreicht hat.

Passen Sie diesen Bereich an eine einfache und doppelte exponentielle Abklingfunktion an, indem Sie nacheinander auf Analyse, Anpassung, exponentielle Anpassung und dann auf Dialog öffnen klicken, und geben Sie die bessere Anpassung an. Diese Abbildung zeigt die Fluoreszenzänderung einer HEK-Zelle, die ein einzelnes auf FP basierendes GEVI Bongwoori exprimiert. Dies ist eine typische Fluoreszenzänderung als Reaktion auf gestufte Spannungsimpulse.

Hier wurde eine HEK293-Zelle mit einer Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera abgebildet. Dieses Bild zeigt die Ruhe-Lichtintensität einer Zelle, die Bongwoori exprimiert. Und dies ist ein Bild der Subtraktion von Einzelbildern, das die Pixel anzeigt, in denen eine Fluoreszenzänderung beobachtet wurde.

Hier ist die optische Aufzeichnung der induzierten Aktionspotentiale von primären Maushirnnervenzellen dargestellt, die Bongwoori exprimieren. Die Aktionspotentiale wurden im Ganzzell-Stromklemm-Modus ausgelöst. Die Spur der relativen Fluoreszenzänderung wurde aus den mit dem Soma korrelierten Pixeln ausgewählt.

In dieser Abbildung ist die Fluoreszenzänderung einer HEK-Zelle, die ein auf FRET basierendes GEVI exprimiert, in Reaktion auf gestufte Spannungsimpulse bei zwei Wellenlängen dargestellt. Die Aufnahme erfolgte mit einer Hochgeschwindigkeits-CCD-Kamera bei einer Rate von einem Kilohertz. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, variable Fluoreszenzintensitäten zu überprüfen, da eine Überexpression von Fluoreszenzproteinen die Zellgesundheit beeinträchtigen kann.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Slicer-Codierungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Neuronenaktivität verschiedener Schaltkreise zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Membranpotential mithilfe verschiedener Probentypen abgebildet werden kann.