Name: Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie die nicht-invasive Messung neuronaler Erregbarkeit in vivo mit FRET-basierten GEVIs in transparenten Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Analyse elektrischer Eigenschaften motorischer Neuronen.

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Die Autoren danken Simona Rodighiero für ihre unschätzbare Unterstützung bei der FRET-Bildgebungsanalyse.

1. pHuC_Mermaid-Plasmid-Erzeugung HINWEIS: Meerjungfrau ist ein Biosensor, der durch die Paarung der spannungsempfindlichen Domäne (VSD) der Ciona intestinalis (jetzt) ​​entwickelt wurde Ciona robusta ) 5 Spannungssensor mit Phosphatase (Ci-VSP) mit dem FRET-Partner Fluorophoren Umi-Kinoko Green (mUKG: Donor) und einer monomeren Version des orange emittierenden fluoreszierenden Proteins Kusabira Orange (mKOk: Akzeptor). Für diesen Biosensor erhöhen Konformationsänderungen der VSD-Domäne, die durch Membrandepolarisation induziert werden, die Nähe der Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzproteine, wodurch die Energieübertragung zwischen ihnen erhöht wird (Erhöhung des FRET-Verhältnisses) 3 . Die VSD sichert die effiziente Lokalisierung des Biosensors an der Plasmamembran. Die neuronale Expression des Biosensors (im Rückenmark, das Signal ist sowohl bei Interneuronen als auch bei motorischen Neuronen nachweisbar) wird durch Klonierung der Meerjungfrau opEn Leserahmen (ORF) unter dem Zebrafisch-pan-neuronalen Promotor HuC 6 . <ol><li> Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) des Mermaid-ORF aus dem pCS4 + Meerjungfern-Plasmid 3 mit Pfu (Korrekturlesen) DNA-Polymerase unter Verwendung des T3 Universal-Primers und des Mermaid Sma I-Primers (5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA), um eine SmaI- Restriktionsstelle stromaufwärts einzuführen Der Meerjungfrau ORF. <ol><li> Verwenden Sie die folgende PCR-Mischung: 0,5 μl Pfu-DNA-Polymerase, 7,5 μl des spezifischen 10x Puffers, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl Dimethylsulfoxid (DMSO), 0,5 μl (50 ng) des Plasmidpräparates und 1 ΜL von 20 &amp; mgr; M Stammlösungen von jedem Primer in einem Gesamtvolumen von 50 &amp; mgr; l </li><li> Die PCR-Mischung für 15 s bei 95 ° C erhitzen, für 15 s bei 50 ° C betragen und für 4 min bei 72 ° C für insgesamt 35 Zyklen verlängern. </li></ol></li><li> Gel-reinigen die spezifischen stumpfPCR-Produkt unter Verwendung eines handelsüblichen Gelreinigungskits nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Klonen Sie das DNA-Fragment in den pCMV-SC-stumpfen Vektor nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Linearisieren Sie das Mermaid-positive Plasmid (genannt pCMV-SC_Mermaid) mit dem Sma I Restriktionsenzym für die folgende Insertion des HuC-Promotors. <ol><li> Stellen Sie die Restriktionsreaktion wie folgt ein: 0,5 μl (10 U) Sma I Restriktionsenzym, 2 μl des Kit 10x Puffers und 5 μg Plasmid DNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Inkubieren Sie die Reaktion bei 25 ° C für 1 h. </li></ol></li><li> Gel-reinigen des verdauten Plasmids unter Verwendung eines handelsüblichen Gelreinigungskits nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> PCR-amplifizieren den HuC-Promotor (pHuC) mit Pfu-DNA-Polymerase und Zebrafisch-Genom-DNA als Matrize unter Verwendung eines Paares von HuC-spezifischen Primern (HuCprom-forw1_SalI: 5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA und HuCproM-rev1: 5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) und überspannt eine 3,150-bp-Region stromaufwärts des ATG. <ol><li> Stellen Sie die PCR-Mischung nach folgendem Schema ein: 0,5 μl Pfu-DNA-Polymerase, 7,5 μl des spezifischen 10x-Puffers, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl DMSO, 200 ng genomische DNA und 1 μl 20 μM Stammlösungen von jedem Primer in einem Gesamtvolumen von 50 μl. </li><li> Nach einem anfänglichen Schritt von 2 min bei 95 ° C wird die PCR-Mischung für 15 s bei 95 ° C erhitzt, für 15 s bei 50 ° C vorgelegt und für 4 min bei 72 ° C für insgesamt 35 Zyklen verlängert . </li></ol></li><li> Gel-reinigen Sie das spezifische stumpfe PCR-Produkt unter Verwendung eines handelsüblichen Gelreinigungskits nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Ligat eine äquimolare Menge des gereinigten pCMV-SC_Mermaid (Schritt 1.5) und der pHuC-DNA (Schritt 1.7) unter Verwendung von 1 μl T4-DNA-Ligase und 1 μl des spezifischen 10X-Puffers in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Inkubieren Sie die Reaktion für 16 h bei4 ° C </li><li> Umwandlung eines Aliquots kompetenter Zellen mit 5 μl der Ligationsreaktion (Schritt 1.8) nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wählen Sie die pHuC-positiven Klone (pHuC_Mermaid) mit dem in die richtige Orientierung eingeführten Promotor durch eine Sal I- Eco RV-Doppelverdauung (die Sal I-Restriktionsstelle wurde stromaufwärts des Promotorfragments in Schritt 1.6 eingefügt, während die Eco RV-Restriktionsstelle Ist stromabwärts der Polyadenylierungsregion, PolyA, des pCMV-SC-Plasmids angeordnet). <ol><li> Stellen Sie die Restriktionsreaktion wie folgt ein: 0,5 μl (10 U) sowohl der Sal I als auch der Eco RV Restriktionsenzyme, 2 μl des Kit10X Puffers und 1 μg pHuC_Mermaid DNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 1 h. Führen Sie die Reaktionen auf ein Agarosegel. </li></ol></li></ol> 2. Embryo Mikroinjektion <ol><li> Übertragen Sie den befruchteten zBGs, erhalten aus Wildtyp (AB-Stamm) oder Sod1-G93R erwachsenen Zebrafisch 4 zu einer 10 mm Petrischale unter Verwendung einer Plastikpipette. </li><li> Spülen Sie die Embryonen in kaltem (4 ° C) Fischwasser und mischen Sie sie sofort in das Eigelb mit 200 pg pHuC_Mermaid-Plasmid unter Verwendung eines Mikroinjektors (für eine Gesamt- und detaillierte Beschreibung des Mikroinjektionsprozesses siehe Literatur 7 und 8). </li><li> Mit einer Plastikpipette die Embryonen in eine Petrischale überführen und in Fischwasser bei 28 ° C inkubieren bis sie die gewünschte Entwicklungsstufe (20-24 h nach der Befruchtung, hpf) für die folgenden Analysen erreichen. </li></ol> 3. Spontane Tail Coiling Analyse HINWEIS: Bewerten Sie das spontane Schwanzaufwicklungsverhalten in 20-24 hpf Embryonen mit oder ohne Drogenriluzol. <ol><li> Übertragen Sie einen Embryo auf eine 90-mm-Runde Petrischale mit Fischwasser mit 0,2% DMSO (Riluzol-Träger) gefüllt und manuell dechorionieren mit twO Juwelier Pinzette mit scharfen Spitzen. Den Embryo für 5 min inkubieren. </li><li> Erkennung der Schwanzaufwicklung bei RT während einer 1-minütigen Videoaufnahme mit einer Digitalkamera, die auf einem Stereomikroskop montiert ist. Erwerben Sie Zeitreihen zu einer Zeitauflösung von 30 Bildern / s. </li><li> Berechnen Sie die Häufigkeit der spontanen Schwanzwicklungen, indem Sie die Anzahl der Biegungen (sowohl kontralateral als auch ipsilateral) pro Zeiteinheit zählen. </li><li> Um die Wirkung des Medikamenten-Riluzols zu bewerten, verwenden Sie vorsichtig eine Plastik-Pasteur-Pipette, um den Embryo auf eine neue 90-mm-Petrischale zu bringen, die mit Fischwasser mit 5 μM Riluzol gefüllt ist. <ol><li> Inkubieren Sie den Embryo für 5 Minuten, bevor Sie ein 1-minütiges Video aufzeichnen und die Verhaltensanalyse wie oben durchführen. </li></ol></li></ol> 4. Imaging-Setup für Meerjungfrau Biosensor Visualisierung in lebenden Embryonen: Simultane Erkennung von Spender- und Akzeptorsignalen <ol><li> Montieren Sie die 20 - 24 hpf Embryonen in 1% niedrigschmelzender Agarose in Fischwasser bei37 ° C in einer 35 mm Glasboden-Aufnahmeschale. Orientiere die Embryos an ihren Seiten. Warten Sie, bis die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt. </li><li> Übertragen Sie die bildgebende Schale auf die Bühne eines umgekehrten konfokalen auf einem invertierten Mikroskop montiert. Identifizieren Sie Motorneuronen, die den Biosensor mit einem 20X-Objektiv (0,7 numerische Apertur, NA) ausdrücken, indem Sie das mUKG mit der 488 nm Argon-Laserlinie anregen und seine Emission zwischen 495 und 525 nm aufzeichnen. </li><li> Für eine FRET-Messung wird mUKG, der Spender des FRET-Paares, mit der 488 nm Laserlinie angeregt. Gleichzeitig mit einem Resonanzscanner, der bei 8000 Hz im bidirektionalen Modus arbeitet, die von dem Donor emittierte Fluoreszenz (zwischen 495 und 525 nm) und die vom mKOk-Akzeptor emittierte Fluoreszenz (zwischen 550 und 650 nm, FRET-Kanal). Falls vorhanden, verwenden Sie den 473 nm Laser. HINWEIS: Die Erregungseffizienz des Spenders wird leicht reduziert (85% statt 93% bei 488 nm), aber die Kreuzerregung des Akzeptors wirdAuch reduziert werden (von 17% bei 488 nm bis 9% bei 473 nm Laserlinie). </li><li> Um die Phototoxizität und die Fluorophor-Bleiche zu reduzieren, minimieren Sie die Beleuchtung der Probe durch Verringerung der Leistung der Laserlinie (auf dem Strahlengangfenster der Erfassungssoftware). </li><li> Optimieren Sie die Erregung, um den Verstärkungs- und Offset-Parametern zu entsprechen, die zu Beginn des Experiments eingestellt sind und während der gesamten Sitzung konstant gehalten werden. Um den Offset einzustellen, ändern Sie die Farbe des Bildes in Intensitätswerte (mit der Q-Look-Up-Tabelle) und drehen Sie beim Scannen mit dem Laser den Offset-Regler (smart offset), so dass die Hintergrundpixel eine Intensität haben Höher als null. Mit der gleichen Nachschlagtabelle, durch Umschalten des Lasers beim Scannen, drehen Sie den Verstärkungsknopf (intelligente Verstärkung), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, wobei darauf geachtet wird, dass gesättigte Pixel vermieden werden. </li><li> Mit einem geöffneten Pinhole (2 luftige Einheiten) erwerben 16-Bit-Bilder, um einen ausreichenden Dynamikbereich für quantitativ zu liefernE analysiert. Vermeiden Sie die Mittelung, um die Erfassungsgeschwindigkeit zu erhöhen und das Photobleichen zu minimieren. </li><li> Wählen Sie im Software-Erfassungsfenster aus dem Dropdown-Menü eine Bildfeldgröße von 512 x 64 Pixel (Pixelgröße: 605 nm) aus. </li><li> Wählen Sie aus dem Erfassungsmodus-Fenster xyt (Zeitraffer auf einer einzelnen xy-Ebene) aus dem Dropdown-Menü und notieren Sie die Änderungen der Embryo-Wirbelsäulenneuronspannung durch Erfassen einer einzelnen xy-Ebene, indem Sie die Erfassungsparameter einstellen, um jeweils ein Bild aufzuzeichnen Ms für 1 min. </li><li> Um die Wirkung der Riluzol-Verabreichung auf die Membrandepolarisation im selben Neuron zu bewerten, erhält man nach der Zugabe von Fischwasser, das 5 μM Riluzol enthält, einen neuen Datensatz. </li><li> Für die FRET-Analyse verwenden Sie den ImageJ-Makro Biosensor_FRET (Ausdrücken von einkettigen FRET-Biosensoren. </li><li> Bewerte das Basalmembran-FRET-Verhältnis jedes Neurons bei t 1 als ((FRET mean - FRET-Hintergrund) / (Donor mean - Donor Hintergrund)), wo FRET und DonOder mittlere Intensität ist die mittlere Fluoreszenzintensität, die in der gleichen Region von Interesse (ROI) berechnet wird, die um die Zelle für jeden erworbenen Kanal gezogen wird, und der FRET- und Donorhintergrund ist die mittlere Fluoreszenzintensität, die in einem ROI des Gesichtsfeldes ohne die Fluoreszenzprobe berechnet wird. HINWEIS: Eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verwendung des Plugins finden Sie auf der Website <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a> . </li><li> Verwenden Sie eine Grafiksoftware, um die Frequenz, die Amplitude und die Dauer der Depolarisation zwischen verschiedenen experimentellen Paradigmen zu vergleichen. Vergleichen Sie zwei Gruppen mit einem ungepaarten Student&#39;s t- test und betrachten Mittelwerte als statistisch anders, wenn P &lt;0,05. </li></ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier vorgestellte Protokoll erlaubte es uns, die Assoziation zwischen den elektrischen Eigenschaften von Zebrafisch-Embryo-Wirbelsäulenmotor-Neuronen und dem spontanen Wickelverhalten zu erforschen, die früheste stereotypische motorische Aktivität, die um 17 hpf der embryonalen Entwicklung auftritt und bis 24 hpf 10 dauert. Unser Ansatz bietet Forschern ein Werkzeug, um das neuronale System der intakten Embryonen zu studieren, wobei die Komplexität der Wechselwirk...

In-vivo- systemische Komponentenanalyse ermöglicht es Wissenschaftlern, zelluläres Verhalten auf die zuverlässigste Weise zu untersuchen. Dies trifft besonders dann zu, wenn die zu prüfende Aktivität stark durch Zell-Zell-Wechselwirkungen (sowohl kontakt- als auch berührungsabhängig) beeinflusst wird, wie im Nervensystem, wo Membranspannungsänderungen die Kommunikation zwischen erregbaren Zellen antreiben. Das Verständnis der Informationen, die von diesen elektrischen Signalen codiert werden, ist der Schlüssel zum Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen arbeitet. Um zelle elektrische Eigenschaften in den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen zu untersuchen, wurden vor kurzem mehrere genetisch codierte Spannungsindikatoren entwickelt 1 . Im Gegensatz zu den bisherigen Generationen von optischen Spannungssensoren (hauptsächlich spannungsempfindlichen Farbstoffen) 2 erlauben GEVIs in vivo Analysen des intakten neuronalen Systems undIhre Expression kann auf bestimmte Zelltypen oder Populationen beschränkt sein. Der Zebrafisch-Embryo ist der in vivo &quot;Substrat&quot; ​​der Wahl, um das große Potenzial zu nutzen, das GEVIs zugeschrieben wird. Tatsächlich ermöglicht das Zebrafisch-Modell dank seiner optischen Klarheit und seines vereinfachten, aber dennoch evolutionär konservierten Nervensystems die einfache Identifikation und Manipulation jeder zellularen Komponente in einem Netzwerk. In der Tat führte die Beschäftigung der FRET-basierten GEVI Mermaid 3 zur Identifizierung von prä-symptomatischen Veränderungen im Wirbelsäulenmotor-Neuron-Verhalten in einem Zebrafisch-Modell der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) 4 . Das folgende in vivo- Protokoll beschreibt, wie die elektrischen Eigenschaften von Wirbelsäulenmotor-Neuronen in intakten Zebrafisch-Embryonen, die Meerjungfrau in einer neuronalspezifischen Weise exprimieren, überwacht werden. Darüber hinaus zeigt es, wie pharmakologisch induzierte chanGes in solchen elektrischen Eigenschaften können mit Veränderungen in der Häufigkeit der embryonalen Spontanspulen verbunden sein, die stereotypische motorische Aktivität, die das Bewegungsverhalten des Zebrafischs in sehr frühen Entwicklungsstadien charakterisiert.

<table><tbody><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Stratagene Products Division</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>T3 Universal-Grundierung&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Universal SmaI Primer&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone Säugetier-Expressionsvektor-System / pCMV-SC stumpfer Vektor</td><td>Agilent Technologies - Geschäftsbereich Stratagene Products</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 mm, Bildgebungsschale mit Glasboden</td><td>Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1 Software&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop (invers)</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Makro Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0c&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biosensing motor neuron membran potenzial in live zebrafisch embryos

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen es Forschern, die Zellkommunikation zu untersuchen, ohne die Integrität der Umgebung, in der sich die Zellen befinden, zu verändern. Konkret wurden sie entwickelt, um die elektrische Aktivität von erregbaren Zellen, wie z.B. Spinalneuronen, zu analysieren. In einem solchen Szenario ist es entscheidend, die Integrität der Wirbelsäulenzelle zu erhalten, aber es ist auch wichtig, die Anatomie und die physiologische Form der beteiligten Systeme zu erhalten. In der Tat muss das Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem - und andere komplexe Systeme - funktionieren, auf einem systemischen Ansatz beruhen. Aus diesem Grund wurde der lebende Zebrafischembryo als Modellsystem ausgewählt und die Spannungsänderungen der Spinalneuronenmembran bewertet, ohne die physiologischen Bedingungen der Embryonen zu beeinträchtigen. 
Hier wird ein Ansatz beschrieben, der die Verwendung von Zebrafischembryonen mit einem FRET-basierten Biosensor kombiniert. Zebrafischembryonen zeichnen sich durch ein stark vereinfachtes Nervensystem aus und eignen sich aufgrund ihrer Transparenz, die den Einsatz von fluoreszenzbasierten Spannungsindikatoren an der Plasmamembran während der Entwicklung des Zebrafisches ermöglicht, besonders für bildgebende Anwendungen. Die Synergie zwischen diesen beiden Komponenten ermöglicht es, die elektrische Aktivität der Zellen in intakten lebenden Organismen zu analysieren, ohne den physiologischen Zustand zu stören. Schließlich kann dieser nicht-invasive Ansatz mit anderen Analysen (z. B. spontanen Bewegungsaufzeichnungen, wie hier gezeigt) koexistieren.

Ein Expressionsvektor, der die FRET-basierte Mermaid-Biosensor-codierende Sequenz unter der Kontrolle des pHuC-pan-neuronalen Promotors trägt, der die Synthese des Proteins ausschließlich im Nervensystem antreibt, wurde mittels einer Mikroinjektion in Einzelzell-befruchtete Eier zugeführt Um transiente transgene Embryos zu erhalten ( Abbildung 1 , Linke Tafel). Nach der Beherrschung der Mikroinjektionstechnik lag der Prozentsatz der Meerjungfrau-positi...

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter nichtinvasiven physiologischen Bedingungen mithilfe von Zebrafischembryonen und einem FRET-basierten GEVI zu untersuchen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Biologie erregbarer Zellen wie beispielsweise der Neuronen zu beantworten. So kann sie beispielsweise verwendet werden, um die Rolle der Erregbarkeit bei der Pathogenese neurologischer Erkrankungen zu analysieren.Dieser Ansatz verwendet transparente Zebrafischeier, die auf FRET basierende, genetisch kodierte Spannungsindikatoren exprimieren. Der Ansatz ermöglicht die Messung der elektrischen Eigenschaften der Zellen in vivo auf nicht-invasive Weise. Somit kann diese Methode Einblicke in die Erregbarkeit von Rückenmarkneuronen in Zebrafischeiern liefern.Es kann auch auf andere in-vitro- oder in-vivo-Systeme angewendet werden, die bildgebenden Untersuchungen zugänglich sind. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die PCR-Mischung zur Amplifikation der kodierenden Sequenz des Mermaid-Biosensors vorbereiten. Erhitzen Sie die PCR-Mischung 15 Sekunden lang auf 95 Grad Celsius.Primeren Sie 15 Sekunden lang bei 50 Grad Celsius und verlängern Sie vier Minuten bei 72 Grad Celsius, insgesamt 35 Zyklen. Danach das spezifische stumpfe PCR-Produkt mittels eines kommerziellen Gelelektrophorese-Reinigungs-Kits reinigen. Anschließend das DNA-Fragment in den pCMV-SC-stumpfen Vektor klonen und das Mermaid-positive Plasmid mit dem SmaI-Restriktionsenzym linearisieren, um den HuC-Promotor einzufügen.Richten Sie die Restriktionsreaktion in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern ein und inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius. Reinigen Sie anschließend das geschnittene Plasmid mittels eines kommerziellen Gelelektrophorese-Reinigungs-Kits. Amplifizieren Sie dann den HuC-Promotor mittels PCR mit PFU-DNA-Polymerase und genomischer DNA von Zebrafischen als Vorlage.Richten Sie die PCR-Mischung ein. Nach einem initialen Schritt von zwei Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen Sie die PCR-Mischung 15 Sekunden lang auf 95 Grad Celsius. Anschließend führen Sie die Primeranlagerung 15 Sekunden bei 50 Grad Celsius durch und verlängern für vier Minuten bei 72 Grad Celsius, insgesamt über 35 Zyklen.Danach das spezifische stumpfe PCR-Produkt aus dem Gel reinigen. Mithilfe von einem Mikroliter T4-DNA-Ligase und einem Mikroliter des spezifischen 10x-Puffers in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern eine äquimolare Menge des gereinigten pCMV-SC-Mermaid- und pHuC-DNAs ligieren. Anschließend die Reaktion 16 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren.Transformieren Sie einen Aliquot kompetenter Zellen mit fünf Mikrolitern der Ligationsreaktion. Wählen Sie die pHuC-positiven Klone mit dem Promotor in korrekter Orientierung durch eine Doppelverdauung mit CEL1 und EcoRV aus. Überführen Sie die Klone in 15-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.Anschließend das Plasmid aus den Zellen extrahieren und die doppelte Restriktionsreaktion mit CEL1 und EcoRV durchführen, die eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Danach die Reaktionsprodukte auf ein Agarosegel laufen lassen. In diesem Verfahren werden die befruchteten Eier, die von Wildtyp- oder sod1G93R-adulten Zebrabärblingen stammen, in eine 10-Millimeter-Petrischale überführt.Spülen Sie die Embryonen in kaltem Fischwasser. Anschließend injizieren Sie sofort 200 Pikogramm des pHuC-Mermaid-Plasmids in das Eigelb. Danach überführen Sie die Embryonen in eine Petrischale und inkubieren sie in Fischwasser bei 28 Grad Celsius, bis sie den gewünschten Entwicklungsstadium für die nachfolgenden Analysen erreicht haben.Überführen Sie die Embryonen für eine Analyse der spontanen Schwanzkrümmung in eine 90-Millimeter-Rundschale, die mit Fischwasser mit 0,2 % DMSO gefüllt ist. Entfernen Sie manuell die Chorionhülle mithilfe zweier Spitzpinzetten oder Nadeln. Inkubieren Sie die Embryonen danach fünf Minuten lang bei 28 Grad Celsius.Verwenden Sie eine an ein Stereomikroskop montierte Digitalkamera, um das Schwanzcoiling bei Raumtemperatur während einer einminütigen Videoaufnahme zu erfassen. Erstellen Sie anschließend die Zeitschaltreihe mit einer zeitlichen Auflösung von 30 Bildern pro Sekunde. Berechnen Sie dann die Frequenz spontaner Schwanzcoilingbewegungen, indem Sie die Anzahl der Biegungen pro Zeiteinheit zählen.Um die Wirkung des Wirkstoffs Riluzol zu bewerten, überführen Sie die Embryonen in eine neue 90-Millimeter-Petri-Schale, die mit Fischwasser mit fünf Mikromolar Riluzol gefüllt ist. Inkubieren Sie die Embryonen anschließend fünf Minuten lang bei 28 Grad Celsius, bevor Sie ein eine Minute langes Video aufnehmen und die Verhaltensanalyse durchführen. Nun bringen Sie die 20 bis 24 hpf-Embryonen in einem 35-Millimeter-Glasboden-Abbildungsgefäß bei 37 Grad Celsius in ein Prozent Low-Melting-Point-Agarose in Fischwasser ein.Positionieren Sie die Embryonen seitlich und warten Sie, bis sich die Agarose bei Raumtemperatur verfestigt hat. Überführen Sie danach die Abdeckungsschale auf den Objektträger eines konfokalen Mikroskops. Identifizieren Sie die Motoneurone, die den Biosensor exprimieren, indem Sie monomeres Umikinoko-Green mit einem 488 Nanometer Argonlaser anregen.Stellen Sie dann die Emission zwischen 495 und 525 Nanometern ein und drücken Sie auf Aufnahme. Für eine FRET-Messung regen Sie mUKG, den Donor des FRET-Paares, mit dem 488-Nanometer-Laser an. Gleichzeitig detektieren Sie mithilfe zweier Photomultiplier die von dem Donor emittierte Fluoreszenz und die von dem monomeren Kusibira-Orange-Akzeptor emittierte Fluoreszenz.Zu Beginn des Experiments optimieren Sie den Verstärkungsfaktor und den Offset des ersten Photomultipliers, an dem die mUKG-Fluoreszenz aufgezeichnet wird, und halten Sie diese Werte während der gesamten Sitzung konstant. Um den Offset einzustellen, ändern Sie die Farbe des Bildes in Intensitätswerte, indem Sie die Q-Lookup-Tabelle verwenden. Während des Scannens mit ausgeschaltetem Laser verwenden Sie den Offset-Regler, sodass die Hintergrundpixel eine Intensität aufweisen, die geringfügig über null liegt.Verwenden Sie dieselbe Nachschlagetabelle, um den Laser einzuschalten. Während des Abtastvorgangs verwenden Sie den Verstärkungsregler, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, und achten Sie dabei darauf, überbelichtete Pixel zu vermeiden. Wählen Sie im Software-Aufnahmefenster im Dropdown-Menü den xyt-Aufnahmemodus und eine Bildfeldgröße von 512 mal 64 Pixeln aus.Stellen Sie anschließend die Aufzeichnung der Spannungsänderungen in embryonalen Rückenmarkneuronen ein, um alle 30 Millisekunden eine einzelne XY-Ebene über eine Minute hinweg aufzuzeichnen. Um den Einfluss der Gabe von Riluzol auf die Membrandepolarisation im selben Neuron zu bewerten, nehmen Sie einen neuen Datensatz fünf Minuten nach Zugabe von Fischwasser, das fünf Mikromolar Riluzol enthält, auf. In diesem Film wurden spontane Verkrümmungen, motorische Reaktionen, die ausschließlich aus einer Ganzkörperkontraktion bestehen, bei denen die Schwanzspitze zum Kopf gezogen wird, im Entwicklungsstadium von 20 bis 24 Stunden post Befruchtung in regulärem Fischmedium aufgezeichnet.Dieser Film zeigt die spontanen Verkrümmungen eines Embryos nach der Inkubation in fünf Mikromolar Riluzol. Um zu überprüfen, ob Veränderungen in der elektrischen Aktivität der spinalen Motoneurone der Grund für die riluzolinduzierten Veränderungen in der Frequenz der spontanen Verkrümmungen waren, wurde das Membranpotenzial in embryonalen spinalen Motoneuronen auf vollständig nichtinvasive Weise untersucht, indem das Fluoreszenzintensitätsverhältnis des Donor-Akzeptor-FRET-Paares des Mermaid-Biosensors gemessen wurde. Primäre spinale Motoneurone, die den Biosensor exprimierten, wurden identifiziert und ihre basalen spontanen Depolarisationsaktivitäten wurden aufgezeichnet.Zusammen mit der Verringerung der Häufigkeit von Schwanzringelbewegungen verringerte die Verabreichung von Riluzol die Frequenz spontaner Depolarisationsereignisse. Wenn diese Methode einmal beherrscht ist, können Forscher die elektrischen Eigenschaften der neuronalen Netzwerke intakter Embryonen untersuchen, wodurch die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Zellen im sich entwickelnden funktionellen System vollständig erhalten bleibt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die elektrische Aktivität der Rückenmarkneuronen mit der Häufigkeit der spontanen Schwanzringelungen korreliert.

biosensing-motor-neuron-membrane-potential-in-live-zebrafish-embryos

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Ziel-Skelettmuskel ermöglichen. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um eine segmentale CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

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