Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter nichtinvasiven physiologischen Bedingungen mithilfe von Zebrafischembryonen und einem FRET-basierten GEVI zu untersuchen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Biologie erregbarer Zellen wie beispielsweise der Neuronen zu beantworten. So kann sie beispielsweise verwendet werden, um die Rolle der Erregbarkeit bei der Pathogenese neurologischer Erkrankungen zu analysieren.

Dieser Ansatz verwendet transparente Zebrafischeier, die auf FRET basierende, genetisch kodierte Spannungsindikatoren exprimieren. Der Ansatz ermöglicht die Messung der elektrischen Eigenschaften der Zellen in vivo auf nicht-invasive Weise. Somit kann diese Methode Einblicke in die Erregbarkeit von Rückenmarkneuronen in Zebrafischeiern liefern.

Es kann auch auf andere in-vitro- oder in-vivo-Systeme angewendet werden, die bildgebenden Untersuchungen zugänglich sind. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die PCR-Mischung zur Amplifikation der kodierenden Sequenz des Mermaid-Biosensors vorbereiten. Erhitzen Sie die PCR-Mischung 15 Sekunden lang auf 95 Grad Celsius.

Primeren Sie 15 Sekunden lang bei 50 Grad Celsius und verlängern Sie vier Minuten bei 72 Grad Celsius, insgesamt 35 Zyklen. Danach das spezifische stumpfe PCR-Produkt mittels eines kommerziellen Gelelektrophorese-Reinigungs-Kits reinigen. Anschließend das DNA-Fragment in den pCMV-SC-stumpfen Vektor klonen und das Mermaid-positive Plasmid mit dem SmaI-Restriktionsenzym linearisieren, um den HuC-Promotor einzufügen.

Richten Sie die Restriktionsreaktion in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern ein und inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius. Reinigen Sie anschließend das geschnittene Plasmid mittels eines kommerziellen Gelelektrophorese-Reinigungs-Kits. Amplifizieren Sie dann den HuC-Promotor mittels PCR mit PFU-DNA-Polymerase und genomischer DNA von Zebrafischen als Vorlage.

Richten Sie die PCR-Mischung ein. Nach einem initialen Schritt von zwei Minuten bei 95 Grad Celsius erhitzen Sie die PCR-Mischung 15 Sekunden lang auf 95 Grad Celsius. Anschließend führen Sie die Primeranlagerung 15 Sekunden bei 50 Grad Celsius durch und verlängern für vier Minuten bei 72 Grad Celsius, insgesamt über 35 Zyklen.

Danach das spezifische stumpfe PCR-Produkt aus dem Gel reinigen. Mithilfe von einem Mikroliter T4-DNA-Ligase und einem Mikroliter des spezifischen 10x-Puffers in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern eine äquimolare Menge des gereinigten pCMV-SC-Mermaid- und pHuC-DNAs ligieren. Anschließend die Reaktion 16 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren.

Transformieren Sie einen Aliquot kompetenter Zellen mit fünf Mikrolitern der Ligationsreaktion. Wählen Sie die pHuC-positiven Klone mit dem Promotor in korrekter Orientierung durch eine Doppelverdauung mit CEL1 und EcoRV aus. Überführen Sie die Klone in 15-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Anschließend das Plasmid aus den Zellen extrahieren und die doppelte Restriktionsreaktion mit CEL1 und EcoRV durchführen, die eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Danach die Reaktionsprodukte auf ein Agarosegel laufen lassen. In diesem Verfahren werden die befruchteten Eier, die von Wildtyp- oder sod1G93R-adulten Zebrabärblingen stammen, in eine 10-Millimeter-Petrischale überführt.

Spülen Sie die Embryonen in kaltem Fischwasser. Anschließend injizieren Sie sofort 200 Pikogramm des pHuC-Mermaid-Plasmids in das Eigelb. Danach überführen Sie die Embryonen in eine Petrischale und inkubieren sie in Fischwasser bei 28 Grad Celsius, bis sie den gewünschten Entwicklungsstadium für die nachfolgenden Analysen erreicht haben.

Überführen Sie die Embryonen für eine Analyse der spontanen Schwanzkrümmung in eine 90-Millimeter-Rundschale, die mit Fischwasser mit 0,2 % DMSO gefüllt ist. Entfernen Sie manuell die Chorionhülle mithilfe zweier Spitzpinzetten oder Nadeln. Inkubieren Sie die Embryonen danach fünf Minuten lang bei 28 Grad Celsius.

Verwenden Sie eine an ein Stereomikroskop montierte Digitalkamera, um das Schwanzcoiling bei Raumtemperatur während einer einminütigen Videoaufnahme zu erfassen. Erstellen Sie anschließend die Zeitschaltreihe mit einer zeitlichen Auflösung von 30 Bildern pro Sekunde. Berechnen Sie dann die Frequenz spontaner Schwanzcoilingbewegungen, indem Sie die Anzahl der Biegungen pro Zeiteinheit zählen.

Um die Wirkung des Wirkstoffs Riluzol zu bewerten, überführen Sie die Embryonen in eine neue 90-Millimeter-Petri-Schale, die mit Fischwasser mit fünf Mikromolar Riluzol gefüllt ist. Inkubieren Sie die Embryonen anschließend fünf Minuten lang bei 28 Grad Celsius, bevor Sie ein eine Minute langes Video aufnehmen und die Verhaltensanalyse durchführen. Nun bringen Sie die 20 bis 24 hpf-Embryonen in einem 35-Millimeter-Glasboden-Abbildungsgefäß bei 37 Grad Celsius in ein Prozent Low-Melting-Point-Agarose in Fischwasser ein.

Positionieren Sie die Embryonen seitlich und warten Sie, bis sich die Agarose bei Raumtemperatur verfestigt hat. Überführen Sie danach die Abdeckungsschale auf den Objektträger eines konfokalen Mikroskops. Identifizieren Sie die Motoneurone, die den Biosensor exprimieren, indem Sie monomeres Umikinoko-Green mit einem 488 Nanometer Argonlaser anregen.

Stellen Sie dann die Emission zwischen 495 und 525 Nanometern ein und drücken Sie auf Aufnahme. Für eine FRET-Messung regen Sie mUKG, den Donor des FRET-Paares, mit dem 488-Nanometer-Laser an. Gleichzeitig detektieren Sie mithilfe zweier Photomultiplier die von dem Donor emittierte Fluoreszenz und die von dem monomeren Kusibira-Orange-Akzeptor emittierte Fluoreszenz.

Zu Beginn des Experiments optimieren Sie den Verstärkungsfaktor und den Offset des ersten Photomultipliers, an dem die mUKG-Fluoreszenz aufgezeichnet wird, und halten Sie diese Werte während der gesamten Sitzung konstant. Um den Offset einzustellen, ändern Sie die Farbe des Bildes in Intensitätswerte, indem Sie die Q-Lookup-Tabelle verwenden. Während des Scannens mit ausgeschaltetem Laser verwenden Sie den Offset-Regler, sodass die Hintergrundpixel eine Intensität aufweisen, die geringfügig über null liegt.

Verwenden Sie dieselbe Nachschlagetabelle, um den Laser einzuschalten. Während des Abtastvorgangs verwenden Sie den Verstärkungsregler, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, und achten Sie dabei darauf, überbelichtete Pixel zu vermeiden. Wählen Sie im Software-Aufnahmefenster im Dropdown-Menü den xyt-Aufnahmemodus und eine Bildfeldgröße von 512 mal 64 Pixeln aus.

Stellen Sie anschließend die Aufzeichnung der Spannungsänderungen in embryonalen Rückenmarkneuronen ein, um alle 30 Millisekunden eine einzelne XY-Ebene über eine Minute hinweg aufzuzeichnen. Um den Einfluss der Gabe von Riluzol auf die Membrandepolarisation im selben Neuron zu bewerten, nehmen Sie einen neuen Datensatz fünf Minuten nach Zugabe von Fischwasser, das fünf Mikromolar Riluzol enthält, auf. In diesem Film wurden spontane Verkrümmungen, motorische Reaktionen, die ausschließlich aus einer Ganzkörperkontraktion bestehen, bei denen die Schwanzspitze zum Kopf gezogen wird, im Entwicklungsstadium von 20 bis 24 Stunden post Befruchtung in regulärem Fischmedium aufgezeichnet.

Dieser Film zeigt die spontanen Verkrümmungen eines Embryos nach der Inkubation in fünf Mikromolar Riluzol. Um zu überprüfen, ob Veränderungen in der elektrischen Aktivität der spinalen Motoneurone der Grund für die riluzolinduzierten Veränderungen in der Frequenz der spontanen Verkrümmungen waren, wurde das Membranpotenzial in embryonalen spinalen Motoneuronen auf vollständig nichtinvasive Weise untersucht, indem das Fluoreszenzintensitätsverhältnis des Donor-Akzeptor-FRET-Paares des Mermaid-Biosensors gemessen wurde. Primäre spinale Motoneurone, die den Biosensor exprimierten, wurden identifiziert und ihre basalen spontanen Depolarisationsaktivitäten wurden aufgezeichnet.

Zusammen mit der Verringerung der Häufigkeit von Schwanzringelbewegungen verringerte die Verabreichung von Riluzol die Frequenz spontaner Depolarisationsereignisse. Wenn diese Methode einmal beherrscht ist, können Forscher die elektrischen Eigenschaften der neuronalen Netzwerke intakter Embryonen untersuchen, wodurch die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Zellen im sich entwickelnden funktionellen System vollständig erhalten bleibt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die elektrische Aktivität der Rückenmarkneuronen mit der Häufigkeit der spontanen Schwanzringelungen korreliert.