Name: Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T12:00:01.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Charakterisierung von Maus-Antral-Oozyten basierend auf der Nukleolus-Chromatin-Organisation. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen SN- und NSN-Oozyten für Entwicklungsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

M.M. und C.A.R. danken dem Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 der Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M und C.A.R. bedanken sich bei Marianna Longo für die Hilfe bei der Vorbereitung der Bilder.

Dieses Protokoll wird in Übereinstimmung mit den Leitlinien der europäischen (EU 63/2010) und Italienisch (26/2014) Gesetze zum Schutz von Tieren für die wissenschaftliche Forschung verwendet werden, durchgeführt. Genickbruch der Euthanasie ist für Eierstöcke Isolierung verwendet und es wird von Experten durchgeführt und ausgebildeten Personen in der genehmigten Protokoll über diese Studie aufgeführt. 1. Tiere <ol><li> Pflegen Erwachsenen 3- bis 6 Wochen alte weibliche Mäuse in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und Feuchtigkeit (mit Phasen der 12L: 12D und ad libitum gefüttert). </li><li> Spritzen Sie Mäusen intraperitoneal mit 2,5 IU pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) bis Follikelwachstum durch Nachahmung der Wirkungen von follikelstimulierendem Hormon (FSH) zu stimulieren. Isolieren Sie die Eierstöcke für antralen Oozyten Sammlung von 48 Stunden später. Euthanize die weibliche Maus zuvor mit PMSG injiziert, nach Ihren Richtlinien des Instituts. </li><li> Schnelles Entfernen der Eierstöcke aus der Körperhöhle und legen Sie sie in die Petrischale containing M2 Medium für spätere Oozyten Isolierung (siehe Abschnitt 3). <ol><li> Einen Einschnitt in der Haut, welche die Bauchwand, gefolgt von einem Einschnitt in der Bauchfells unter Verwendung sterilen Sektions Schere. Öffnen Sie die Schnittführung, um den Bauch freizulegen, bewegen Sie den Mut, auf der einen Seite mit einer sterilen Pinzette und lokalisieren die Eileiter und bilden eine V-Form, ausgehend von der Blase. </li><li> Beachten Sie die Eierstöcke unterhalb der Nieren entfernt. Halten Sie jede Röhre mit steriler Pinzette und machen einen kleinen Schnitt an der Unterseite der Eierstöcke, um sie freizugeben. Übertragen beide Ovarien am Boden einer Petrischale mit voräquilibriert Medium. </li></ol></li></ol> 2. Hormonpräparat <ol><li> Verdünnen Sie PMSG (in verschiedenen Aktien Konzentrationen) mit steriler isotonischer Kochsalzlösung, um eine Arbeitskonzentration von 2,5 IU Hormon pro 0,1 ml für eine geeignete Injektionsvolumen zu erhalten. HINWEIS: Hormon-Lösungen müssen in 0,5 ml Röhrchen aliquotiert und gelagert bei -20 ° C bis zum Tag der Verwendung. Bewahren Sie keine verdünnten Aliquots länger als drei Monate bei -20 ° C. Einmal aufgetaut, wenn serielle Injektionen durchgeführt werden, speichern die Teilmengen von Hormon-Lösungen bei +4 ° C und verwenden Sie sie innerhalb von 4 Tagen. </li></ol> 3. Die Eizellen Antrum Isolation Für die richtige Oozyten Trennung: <ol><li> Äquilibrieren M2 Medium 13 (M2) bei 5% CO 2 und 37 ° C für mindestens 1 Stunde vor dem Beginn der Oozyten Isolierungsverfahren. Bereiten zwei Petrischalen (35 mm x 10 mm), eines mit 1 ml M2 für Ovar Punktierung und die zweite mit kleinen Tropfen (20 ul) von M2 mit Mineralöl (~ 1,5 ml) für Oozyten Übertragung nach Isolierung aus der überdachten Eierstock (siehe 3,4-3,6). Halten Sie beide Petrischalen im Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C bis zur Verwendung bereit. </li><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop bei Oozyten Isolierungsverfahren. </li><li> Bereiten dünnen Mundglaspipetten, um die Eizellen mit Strechfolie sammelnHing Glas Pasteurpipetten horizontal gehalten (Halten der Enden der Pipette mit beiden Händen), über eine vertikale Flamme aus dem Bunsenbrenner (Abbildung 1). <ol><li> Sobald das Glas zu schmelzen beginnt, nehmen Sie die Pipette aus der Flamme, und führen Sie einen schnellen Zugbewegung um das gewünschte Pipette zu erhalten. Fest schneiden das überschüssige Glas in der Nähe der Engstelle der Pipette mit den Fingernägeln, die Länge und der Durchmesser der inneren Kapillare einzustellen. Sicherzustellen, dass die dünne Kapillare einen Innendurchmesser von ~ 100 &amp; mgr; m, der etwas größer als der Durchmesser der Eizelle (~ 80 &amp; mgr; m). </li><li> Zu-Mund-Pipette, schließen Sie ein Ende des Ansaugrohr auf die Pipette gezogen wird unter Verwendung einer geeigneten Spitze und das andere Ende in den Mund, befestigen Sie sie mit den Zähnen. </li></ol></li><li> Sammeln der Eierstöcke mit sterilen Pinzetten und legen sie an der Unterseite eines Zellkulturpetrischale (35 mm x 10 mm). Deckt sie mit 1 ml M2 zuvor bei 37 ° C äquilibriertund 5% CO 2 (Abbildung 2). </li><li> Sanft durchstechen die Antralfollikeln der Eierstöcke mit einem sterilen Insulinspritze Nadel antralen Oozyten in M2 (Figur 3) zu lösen. </li><li> Gently Mund pipettieren die Eizellen durch eine enge Pasteur-Pipette, um Follikelzellen und andere mögliche Gewebetrümmer (4A) zu entfernen und setzen sie an der Unterseite der kleinen Tropfen (20 ul) von M2 mit Mineralöl für Embryokultur überzogen (vorher dann hergestellt; 4B). HINWEIS: Es ist wichtig, alle Cumuluszellen an die Zona pellucida der Eizellen durch kontinuierliches Pipettieren angebracht über mehrere und unterschiedliche Tropfen M2 entfernen. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich, um Veränderungen im pH des Mediums zu vermeiden. </li></ol> 4. Antral Oozyten Färbung mit Hoechst33342 HINWEIS: Antral Eizellen können in SN (Umgeben Nucleolus), NSN (Nicht Umgeben Nucleolus) oder unterschieden werdenin einer anderen Zwischenform auf der Grundlage ihrer Chromatinorganisation nach Färbung mit Supravital Konzentration Hoechst33342 (oder andere spezifische Marker für Basen AT) 14. In der Tat zeigen die SN Oozyten eine Hoechst-positive Ring um den Nukleolus, während der NSN nicht, daher der Name. Für die richtige Oozyten-Färbung: <ol><li> Übertragen die Oozyten mit einer Mundpipette in Tropfen Hoechst33342 (20 ul) in M2 verdünnt im supravitalen Konzentration von 50 ng / &amp; mgr; l für 10 Minuten im Dunkeln. </li><li> Nach der Inkubation mit Hoechst33342 Transfer jeder einzelnen Oocyte mit einem Mundpipette an der Unterseite der kleinen Tropfen (5 ul) von M2 mit Mineralöl bedeckt, zum Sortieren basierend auf Chromatinorganisation (SN oder NSN). Verwenden Sie eine beliebige Fluoreszenzmikroskop mit Hoechst33342 Filter (Emissionswellenlänge 486 nm) ausgestattet, um die Chromatin-Konfiguration der Eizellen zu visualisieren. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Art des Fluoreszenzmikroskopes, it kann sich zwingend notwendig, um Glasboden Petrischale für die Bildaufnahme verwenden. Die konfokale Mikroskopie Olympus FluoView Fv10i, wenn mit einem Probenhalter für 35 mm-Schale ausgestattet benötigt nur Glasboden-Gerichte für die Bilderfassung, mit einer 0,17 mm Standard-Dicke und einem Bereich von 0,13 bis 0,21 mm akzeptabel. </li><li> Erregt die Oozyten auf nicht mehr als 5-10 sec, wahrscheinlich genügend Zeit, um die Anwesenheit oder die Abwesenheit von einem Ring um den Nukleolus (Abbildung 5) zu visualisieren. </li><li> Nach dem Sortieren, der Kultur der antralen SN und NSN Oozyten in M2 bei 5% CO 2 und 37 ° C, um in vitro-Reifung induzieren oder halten sie in geeigneten Puffern für die molekulare oder zelluläre Analysen. </li></ol>

<ol><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antral+follicles%3A+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+%28electron+microscopic+and+autoradiographic+data%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).</li>
<li>Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recombinant+human+gonadotropins+on+human%2C+bovine+and+murine+oocyte+meiosis%2C+fertilization+and+embryonic+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro.</a> Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).</li>
<li>Mattson, B. A., Albertini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis%3A+Chromatin+and+microtubule+dynamics+during+meiotic+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase.</a> Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).</li>
<li>Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competent+mouse+oocytes+isolated+from+antral+follicles+exhibit+different+chromatin+organization+and+follow+different+maturation+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics.</a> Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).</li>
<li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organisation+during+mouse+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin organisation during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).</li>
<li>Wu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+oocytes+for+in+vitro+maturation+by+brilliant+cresyl+blue+staining%3A+a+study+using+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model.</a> Cell Res. 17, 722-731 (2007).</li>
<li>Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+Brilliant+Cresyl+Blue+%28BCB%29+staining+of+mammalian+oocytes+used+for+in+vitro+embryo+production+%28IVP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biol%22%5BJournal%5D)">The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP).</a> Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).</li>
<li>Labrecque, R., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+mammalian+oocyte+competence+by+transcriptome+analysis%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Human+Reprod%22%5BJournal%5D)">The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges.</a> Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).</li>
<li>Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+arrest+and+mouse+antral+Not-Surrouded+Nucleolus+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte.</a> Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Yurttas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+PADI6+and+the+cytoplasmic+lattices+in+ribosomal+storage+in+oocytes+and+translational+control+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo.</a> Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).</li>
<li>Li, L., Baibakov, B., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subcortical+maternal+complex+essential+for+preimplantation+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis.</a> Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).</li>
<li>Ami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT-IR+spectra+signatures+of+mouse+antral+oocytes%3A+molecular+markers+of+oocyte+maturation+and+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).</li>
<li>Fulton, B. P., Whittingam, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mammalian+oocytes+by+intercellular+injection+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium.</a> Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).</li>
<li>Luttmer, S. J., Longo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+living+and+fixed+gametes+and+early+embryos+stained+with+supravital+fluorochromes+%28Hoechst+33342+and+3%2C3%E2%80%B2-dihexyloxacarbocyanine+iodide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Res%22%5BJournal%5D)">Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide).</a> Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biopolitics+of+frozen+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The biopolitics of frozen embryos.</a> Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Dieses Protokoll beschreibt die verwendet werden, um zu isolieren und zu klassifizieren Maus antralen GV-Oozyten-Methode. Es gibt keine besonderen kritischen Schritte, um zu unterstreichen, mit wenigen Ausnahmen. Erstens: a) Erhaltung der Vitalität der Oozyten und b) zu vermeiden, den pH-Wert des verwendeten Mediums: Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Zweitens: Eizellen sollten kurz angeregt werden (5-10 sec), um Hoechst33342 Chromatin Schäden und der anschließenden Tod der Eizellen zu v...

Antralen ausgewachsene Oocyten (GV, Keimbläschen) aus dem Antrum Fach der Ovarien isoliert werden routinemäßig für verschiedene Zwecke verwendet, wie zum Beispiel die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die in vitro-Reifung bis Metaphase II Stufe. Trotz ihres schönen Aussehens meisten antralen Eizellen, aber nicht alle sind in der Lage, um die Meiose zu vervollständigen und erreichen das Blastozystenstadium; in der Tat, in vielen Säugetierspezies, einschließlich Menschen, 1,2, etwa 30% von ihnen verhaften ihre Entwicklung in der 2-Zell-Stadium, wenn die Befruchtung stattfindet 3-5. Bisher sind nur wenige Parameter verwendet werden, um zwischen den Oozyten der Lage, die Embryonalentwicklung von denen nicht in der Lage, dies zu tun aufrecht zu unterscheiden. Zum Beispiel ist Cresyl-Blau-Färbung (BCB) einen gültigen Methode die Oozyten basierend auf der Aktivität der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase zu sortieren, obwohl der Nutzen dieses Sortierverfahren den BCB + oder BCB- Färbung zusammenhängtnoch Labor abhängig 6-8. Eine andere gut etablierte Methode liegt in ihrer Chromatinorganisation: Wenn bei allen DNA interkalierende Farbstoffe (wie Hoechst33342) gefärbt, 70% der antralen Oozyten zeigen eine farbstoff positive Ring um den Nukleolus und sind umgeben Nucleolus (SN) aufgerufen wird, während die restlichen 30% zeigen eine gefleckte positive Signale und werden als Nicht Umgeben Nucleolus (NSN) 3-5. Kürzlich haben wir gezeigt, dass das Fehlen von zytoplasmatischen Gittern 9 (CPLs, wichtige Lagerstätten für maternalen mRNA und Ribosom in beiden Säugetier Eizellen und Embryonen) 10 und der Herunterregulierung der MATER (wichtig für CPLs Bildung 11) zusammen mit der Anwesenheit von Lipidtröpfchen in ihrem Zytoplasma 9,12, können andere Ursachen auf den NSN Oozyten Unfähigkeit, die auf über die 2-Zell-Stadium fortfahren. Leider können einige Techniken angewendet, um antralen SN und NSN Eizellen und sortiert werden,Aus diesem Grund könnte die Entwicklung einer weniger invasiven Verfahren (ohne Kernfärbung, der Fixierung oder Manipulation mit Mund-Pipetten) sehr wichtig geworden, um die Raten der menschlichen und tierischen Embryo-Entwicklung zu erhöhen. In diesem Papier haben wir ausführlich die einfache und schnelle Protokoll für die Anzeige Art SN und NSN antralen Eizellen von weiblichen Mäusen zu isolieren, und es wird an alle Wissenschaftler interessieren sich für das Studium der weiblichen Gametogenese, Eizellreifung und Embryoentwicklung gerichtet.

<table><tbody><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>EmbrioMax M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-PD</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale 35mmx10mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Schale 35mm, hoher Glasboden</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur Borosilikatglas</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator-Röhrchenbaugruppen für kalibrierte Mikrosäulenpipetten</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von maus antral oozyten basierend auf nucleolar chromatinorganisation

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung und Charakterisierung von antralen GV-Eizellen (Germinal Vesicle) von Mäusen, die in der Lage (SN, Surrounded Nucleolus) oder nicht in der Lage (NSN, Not Surrounding Nucleolus) sind, sich nach in vitro Reifung (IVM) und in vitro Fertilisation (IVF) zum Blastozystenstadium zu entwickeln. Es verwendet Hoeschst33342 (oder einen anderen DNA-Interkalationsfarbstoff), der in der Lage ist, an das Heterochromatin des Nukleolus zu binden und einen Ring in den SN-Eizellen zu zeigen oder nicht, wie in den NSN-Eizellen. Dies ist der einfachste und schnellste Weg, um beide antralen Eizellen zu sortieren, die schließlich für IVM- oder IVF-Eingriffe verwendet werden können. 
Kurz gesagt, das Protokoll besteht aus folgenden Schritten: Hormoninjektion zur Stimulierung des Follikelwachstums; Isolierung der Eizellen im GV-Stadium aus dem Antralkompartiment durch Punktion des Eierstocks mit einer sterilen Nadel; Vorbereitung von dünnen Glaspipetten für das Mundpipettieren der Eizellen; Sortierung der Eizellen mit Hoechst33342, hergestellt in einer supravitalen Konzentration; IVM, IVF oder jede andere molekulare/zelluläre Analyse.
Leider gibt es immer noch wenige Beweise für die Sortierung von SN- und NSN-Eizellen mit weniger invasiven Techniken. Wenn sie identifiziert werden, könnten sie möglicherweise auf assistierte Reproduktionstechnologien beim Menschen angewendet werden, wenn auch mit mehreren Aspekten, die geändert werden sollten. Bis heute hat diese Technik potenzielle Auswirkungen, um die erfolgreichen IVM- und IVF-Verfahren sowohl bei gefährdeten als auch bei Arten von wirtschaftlichem Interesse drastisch zu steigern.

Die folgenden Bilder zeigen die verwendet werden, um antralen Eizellen aus den Eierstöcken der Maus zu isolieren, ausgehend von Pipetten Zubereitung der Oozyten &quot;Sortierung mittels Hoechst33342 Methode. Diese Methode ist sehr einfach und kann in jedem Labor mit einem CO 2 -Inkubator, einem Stereomikroskop und einem Fluoreszenzmikroskop mit dem korrekten Filter für die Beobachtung des Hoechst33342 ausgestattet erfolgen Abbildung 1 zeigt den Anfangsschritt ...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Maus antralen Oozyten basierend auf nucleolar Organisation.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, alle Schritte zur Charakterisierung von murinen Antrum-Oozyten basierend auf ihrer Chromatinorganisation detailliert darzustellen, entsprechend ihrer Fähigkeit, eine potenzielle embryonale Entwicklung vollständig aufrechtzuerhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie man zwei verschiedene Arten von Antrum-Oozyten, SN (surrounded nucleolus) und NSN (non-surrounded nucleolus), die im Antrumkompartiment des Säugetierovars lokalisiert sind, unterscheiden und isolieren kann. Um die Eierstöcke zu gewinnen, injizieren Sie zunächst drei bis sechs Wochen alten weiblichen Mäusen intraperitoneal 2,5 internationale Einheiten schwangeren Stuten-Serum-Gonadotropin.Zwei Tage später, etwa eine Stunde vor der Ernte, füllen Sie eine sterile Petrischale mit M2-Medium und geben mehrere 20-Mikroliter-Tropfen M2-Medium in eine zweite Petrischale, wobei jeder Tropfen mit 1,5 Millilitern Mineralöl bedeckt wird. Anschließend alle Petrischalen in einen 37 °C, 5 % Kohlendioxid-Brutschrank überführen, um das Medium zu äquilibrieren. Danach mit sterilen Dissektions-Scalpellen e

isolation-characterization-mouse-antral-oocytes-based-on-nucleolar

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Dieses Video beschreibt die Isolierung von antralen Eizellen aus frisch entnommenen Maus-Eierstöcken. Diese antralen Eizellen können für weitere Charakterisierungs- und Entwicklungsstudien verwendet werden.

Isolierung von antralen Eizellen aus der Maus: Eine Methode zur Isolierung von antralen Eizellen aus frisch entnommenen Eierstöcken der Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die nicht-invasive Beurteilung der Eizelle Entwicklungskompetenz während ihre in Vitro Reifung von Germinal Vesicle zur Metaphase II Stufe durchgeführt. Diese Methode verbindet Zeitraffer Bildgebung mit Particle Image Velocimetry (PIV) und neuronale Netzwerkanalysen.

Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Eierstöcke Gewebekulturen als Modelle der Follikel Entwicklung, Eisprung und Follikel Atresie einsetzbar und regulatorische Mechanismen der Eierstöcke Dynamiken zeigen.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht.

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um den physikalischen Einfluss des Zytoskeletts auf die Kernform und die inneren membranlosen Organellen im Eizellsystem der Maus zu dokumentieren. Das Framework kann für die Verwendung in anderen Zelltypen und Kontexten angepasst werden.

Erfassung der zytoskelettbasierten Agitation des Maus-Eizellkerns über räumliche Skalen hinweg

Meiotische Fehler in Synapsen und Rekombination sind bei Säugetier-Eizellen üblich. Eine rigorose Analyse der Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist unerlässlich, um zu verstehen, wie und warum die Oogenese oft schief geht. Die hier vorgestellten Techniken ermöglichen ein umfassendes Monitoring von Rekombination und Synapsen, um die Eizellqualität bei Mäusen zu bewerten.

Präparation meiotischer Chromosomenspreizungen aus Maus-Eizellen zur Beurteilung von Synapse und Rekombination

Lernen Sie die Isolierung und Charakterisierung von Maus-Antral-Oozyten basierend auf der Nukleolus-Chromatin-Organisation. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen SN- und NSN-Oozyten für Entwicklungsbiologie.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

Weitere Videos entdecken