Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, alle Schritte zur Charakterisierung von murinen Antrum-Oozyten basierend auf ihrer Chromatinorganisation detailliert darzustellen, entsprechend ihrer Fähigkeit, eine potenzielle embryonale Entwicklung vollständig aufrechtzuerhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie man zwei verschiedene Arten von Antrum-Oozyten, SN (surrounded nucleolus) und NSN (non-surrounded nucleolus), die im Antrumkompartiment des Säugetierovars lokalisiert sind, unterscheiden und isolieren kann. Um die Eierstöcke zu gewinnen, injizieren Sie zunächst drei bis sechs Wochen alten weiblichen Mäusen intraperitoneal 2,5 internationale Einheiten schwangeren Stuten-Serum-Gonadotropin.

Zwei Tage später, etwa eine Stunde vor der Ernte, füllen Sie eine sterile Petrischale mit M2-Medium und geben mehrere 20-Mikroliter-Tropfen M2-Medium in eine zweite Petrischale, wobei jeder Tropfen mit 1,5 Millilitern Mineralöl bedeckt wird. Anschließend alle Petrischalen in einen 37 °C, 5 % Kohlendioxid-Brutschrank überführen, um das Medium zu äquilibrieren. Danach mit sterilen Dissektions-Scalpellen einen Schnitt in die Haut vornehmen, die die Bauchdecke bedeckt, gefolgt von einem Schnitt in das Peritoneum der ersten hormonbehandelten Maus.

Verwenden Sie sterile Pinzette, um die Därme beiseitezuschieben und die Uterus-Tuben zu lokalisieren, die eine V-Form beginnend von der Harnblase bilden. Nachdem Sie die Eierstöcke unterhalb der Nieren lokalisiert haben, greifen Sie einen Uterus-Tubus und lösen den entsprechenden Eierstock durch einen kleinen Schnitt am unteren Rand des Gewebes. Wiederholen Sie den Vorgang, um den anderen Eierstock zu gewinnen, und legen Sie anschließend beide Eierstöcke in die mit vorab äquilibriertem M2-Medium gefüllte Petrischale.

Bevor die antrale Oozyte isoliert wird, stellen Sie Glaspipetten her, indem Sie beide Enden einer Glas-Pasteurpipette greifen und die Pipette horizontal über eine Bunsenbrennerflamme halten. Wenn das Glas zu schmelzen beginnt, nehmen Sie die Pipette aus der Flamme und ziehen Sie das Instrument schnell auseinander. Schneiden Sie mithilfe eines Fingernagels das überschüssige Glas dicht an der engen Stelle der Pipette ab, um die Spitze zu verkürzen und einen inneren Kapillardurchmesser von etwa 100 Mikrometern zu erreichen.

Es ist wichtig, den richtigen Pipettendurchmesser zu verwenden. Wenn dieser zu eng ist, bleiben die Oozyten stecken, fragmentieren und sterben ab. Anschließend verbinden Sie das nicht veränderte Ende der Pipette mit einem Aspirationsrohr.

Überführen Sie anschließend die Eierstöcke in die Petrischale, die ein Milliliter vorab äquilibriertes M2-Medium enthält, und verwenden Sie eine sterile Insulinspritzennadel, um die Antralfollikel der Eierstöcke vorsichtig zu perforieren. Während die Oozyten freigesetzt werden, sammeln Sie diese vorsichtig mittels Mundpipette auf, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Follikelzellen oder sonstigen Gewebereste anzusaugen. Danach pipettieren Sie jedes Oozyt rasch durch mehrere Tropfen vorab äquilibriertes M2-Medium, um alle an der Zona pellucida der Oozyten anhaftenden Cumuluszellen zu entfernen.

Nachdem die Oozyten entkleidet wurden, lassen Sie die Oozyten vorsichtig auf den Boden einzelner Tropfen frisch equilibrierter M2-Medien sinken. Um die Oozyten anzufärben, übertragen Sie die Zellen mit einer Mundpipette in 20-Mikroliter-Tropfen von Hoechst 33342, verdünnt in M2-Medium. Anschließend überführen Sie die Oozyten in eine neue Petrischale, die fünf-Mikroliter-Tropfen M2-Medium unter einer Schicht Mineralöl enthält, wobei Sie darauf achten, die Oozyten einzeln auf den Boden jedes Tropfens zu setzen.

Nachdem alle Oozyten übertragen wurden, stellen Sie die Petrischale unter das Fluoreszenzmikroskop und excitieren die Zellen gerade so lange, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Rings um das Nukleolus sichtbar wird. Achten Sie darauf, die Oozyten nicht übermäßig zu belichten, da die Chromatinstruktur beschädigt werden kann und die Oozyten absterben könnten, wenn die Belichtung zu lang ist. Nach der Identifizierung der SN- und NSN-Oozyten sortieren Sie die Zellen entsprechend ihrer Chromatinorganisation in die jeweils passende Petrischale mit dem geeigneten Reagenz für die gewünschte nachgeschaltete Analyse ein.

Die Färbung mit Hoechst 33342 zur Darstellung der Chromatinorganisation ist vermutlich der kritischste Schritt des Verfahrens. Eine fünfbis zehnsekündige Anregung sollte ausreichen, um die Oozyten anhand des Vorhandenseins oder Fehlens von Chromatin um den Nukleolus jedes Oozyten herum zu sortieren. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als drei Stunden abgeschlossen werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, bei Raumtemperatur zu arbeiten und daran zu denken, sowohl die Eierstöcke als auch die Oozyten schonend zu behandeln. Nach diesem Verfahren können die Oozyten anschließend für die in-vitro-Maturation und die in-vitro-Befruchtung verwendet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie den Weg, um eine bislang offene Frage zu beantworten: Wie lassen sich zwei Arten antraler Oozyten, die in den Eierstöcken von Säugetieren vorkommen, erkennen und voneinander unterscheiden?

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine eigene Mundpipette herstellt und verwendet sowie antrale Oozyten mittels Färbung mit Hoechst 33342 isoliert und sortiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tieren und Zellen besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert, beispielsweise das Tragen Ihrer persönlichen Schutzausrüstung und die Verwendung sterilisierter Instrumente.