Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, alle Schritte zu beschreiben, die zur Charakterisierung von antralen Eizellen von Mäusen auf der Grundlage ihrer Chromatinorganisation erforderlich sind, entsprechend ihrer Fähigkeit, eine prospektive Embryonalentwicklung vollständig aufrechtzuerhalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. wie man zwei verschiedene Arten von antralen Ooykten unterscheidet und isoliert, SN, umschlossener Nukleolus, und NSN, nicht umgebender Nukleolus, der sich im antralen Kompartiment des Eierstocks von Säugetieren befindet. Um die Eierstöcke zu entnehmen, injizieren Sie zunächst drei bis sechs Wochen alte weibliche Mäuse IP mit 2,5 internationalen Einheiten trächtiger Stutenserumgonadotropin.

Zwei Tage später, etwa eine Stunde vor der Ernte, füllen Sie eine sterile Petrischale mit M2-Medium und geben Sie mehrere 20 Mikriliter M2-Medium in eine zweite Petrischale, wobei Sie jeden Tropfen mit 1,5 Millilitern Mineralöl bedecken. Bringen Sie dann alle Petrischalen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, damit sich das Medium ausgleichen kann. Als nächstes machen Sie mit einer sterilen Präparierschere einen Schnitt in die Haut, die die Bauchdecke bedeckt, gefolgt von einem Schnitt im Bauchfell der ersten hormoninjizierten Maus.

Schieben Sie den Darm mit einer sterilen Pinzette zur Seite, um die Eileiter zu lokalisieren, die von der Blase ausgehend eine V-Form bilden. Nachdem Sie die Eierstöcke unterhalb der Nieren lokalisiert haben, fassen Sie einen Gebärmutterschlauch und geben Sie den entsprechenden Eierstock mit einem kleinen Schnitt in der Unterseite des Gewebes frei. Wiederholen Sie den Vorgang, um den anderen Eierstock zu entnehmen, und legen Sie dann beide Eierstöcke in die Petrischale, die mit vorbalanciertem M2-Medium gefüllt ist.

Bevor Sie die antrale Eizelle isolieren, stellen Sie Glasmundpipetten her, indem Sie beide Enden einer Pasteur-Glaspipette greifen und die Pipette waagerecht über eine Bunsenbrennerflamme halten. Wenn das Glas zu schmelzen beginnt, nehmen Sie die Pipette von der Flamme und ziehen Sie das Instrument schnell auseinander. Schneiden Sie das überschüssige Glas mit einem Fingernagel in der Nähe der schmalen Spitze der Pipette fest ab, um die Spitze zu kürzen und einen inneren Kapillardurchmesser von etwa 100 Mikrometern zu erreichen.

Es ist wichtig, den richtigen Pipettendurchmesser zu haben. Wenn es zu schmal ist, bleiben die Ooyctes stecken, fragmentieren und sterben ab. Verbinden Sie dann das unveränderte Ende der Pipette mit einem Aspiratorröhrchen.

Übertragen Sie anschließend die Eierstöcke in die Petrischale, die einen Milliliter voräquilibriertes M2-Medium enthält, und verwenden Sie eine sterile Insulinspritzennadel, um die Antralfollikel der Eierstöcke vorsichtig zu punktieren. Wenn die Eizellen freigesetzt werden, sammeln Sie sie vorsichtig mit einer Mundpipette und achten Sie darauf, keine Follikelzellen oder andere Gewebetrümmer abzusaugen. Pipettieren Sie dann schnell jede Eizelle durch mehrere voräquilibrierte M2-Medium-Tropfen, um alle Kumuluszellen zu entfernen, die an der Zona pellucida der Eizellen befestigt sind.

Sobald die Eizellen entblößt wurden, legen Sie die Eizellen vorsichtig auf den Boden einzelner Tropfen frischen, ausgeglichenen M2-Mediums. Um die Eizellen zu färben, werden die Zellen mit einer Mundpipette in 20 Mikroliter Hoechst 33342 überführt, die in M2-Medium verdünnt sind. Übertragen Sie dann die Eizellen in eine neue Petrischale mit fünf Mikrolitern M2-Medium, die mit Mineralöl bedeckt sind, und achten Sie darauf, dass sich die Eizellen einzeln am Boden jedes Tropfens absetzen.

Wenn alle Eizellen übertragen wurden, legen Sie die Schale unter das Fluoreszenzmikroskop und regen Sie die Zellen gerade lange genug an, um das Vorhandensein oder Fehlen eines Rings um den Nukleolus sichtbar zu machen. Achten Sie darauf, die Eizellen nicht zu überbelichten, da das Chromatin beschädigt werden kann und die Eizellen absterben können, wenn sie zu lange ausgesetzt werden. Nachdem die SN- und NSN-Eizellen identifiziert wurden, sortieren Sie die Zellen entsprechend ihrer Chromatinorganisation in die entsprechende entsprechende Petrischale in dem entsprechenden Reagenz für die gewünschte nachgelagerte Analyse.

Die Färbung von Hoechst 33342 für die Chromatinorganisation ist wahrscheinlich der kritischste Schritt des Verfahrens. Fünf bis 10 Sekunden Erregung sollten lang genug sein, um die Eizellen nach dem Vorhandensein oder Fehlen von Chromatin zu sortieren, das den Nukleolus jeder Eizelle umgibt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, bei Raumtemperatur zu arbeiten und daran zu denken, sowohl die Eierstöcke als auch die Eizellen schonend zu behandeln. Nach diesem Verfahren können die Eizellen dann für die In-vitro-Reifung und die In-vitro-Fertilisation verwendet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, um eine noch offene Frage zu beantworten, wie man zwei Arten von antralen Eizellen, die sich in den Eierstöcken von Säugetieren befinden, erkennen und unterscheiden kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre eigene Mundpipette herstellen und verwenden, wie Sie antrale Eizellen mit Hilfe der Hoechst 33342-Färbung isolieren und sortieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tieren und Zellen besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert, wie z. B. das Tragen Ihrer persönlichen Schutzausrüstung und die Verwendung sterilisierter Instrumente.