Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Occyten mit einer rückseitigen Entwicklungsfähigkeit mit Hilfe eines nicht-invasiven Werkzeugs. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass man durch die einfache Beobachtung der Eizellenbewegungen während der In-vitro-Reifung das Entwicklungspotenzial der weiblichen Gameten beurteilen kann. Diese Technik basiert auf Zeitraffer-Bildgebung in Verbindung mit Particle Image Velocimetrie, einer auf neuronalen Netzwerken basierenden Analyse.

Hier werden die Schritte beschrieben, die unternommen wurden, um zu zeigen, dass Maus-Eizellen während des Übergangs von der keimförmigen Blasen- zur Metaphase zwei ein anderes Profil dieser plasmatischen Bewegungen aufweisen, das signifikant mit ihrer Entwicklungskompetenz oder Inkompetenz korreliert. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation ist Unfruchtbarkeit eine Pathologie, von der etwa 20 Prozent der Paare betroffen sind, und außerdem besteht bei einem Drittel der Frauen, die sich einer Krebsbehandlung unterziehen, das Risiko eines vorzeitigen Eierstockversagens. Das entspricht etwa 300.000 bzw. 30.000 Frauen in Ländern wie den USA bzw. Italien.

Die Entwicklung nicht-invasiver Verfahren zur Identifizierung der Entwicklungskompetenz der Eizellen würde dazu beitragen, den Gesamterfolg der Schwangerschaftsergebnisse zu verbessern. Im Folgenden beschreiben wir die wichtigsten Schritte des Verfahrens, wie es für die Maus entwickelt wurde, um es für Tests und den Einsatz bei anderen Säugetierarten wie Rindern oder Menschen leicht verfügbar zu machen. Die Eierstöcke werden in eine Petrischale mit M2 Medium umgefüllt, das vorgewärmt und ausgeglichen ist und 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 hat.

Wenn der Eileiter und etwas Fett um den Eierstock herum noch vorhanden sind, sollten sie entfernt werden. Dann wird der Eierstock mit einer Pinzette festgehalten und seine Oberfläche mit einer sterilen 1G-Nadel durchstochen. Die punktierten Eierstöcke werden aus dem M2-Medium entfernt und mit einer handgezogenen Mikropipette zunächst auf ein neues, sauberes M2-Medium umgefüllt und dann einige Sekunden lang ein- und ausgepipetiert, bis die Kumuluszellen, die die Eizelle umgeben, vollständig entfernt sind.

Als nächstes werden die Eizellen in 20-Mikroliter-Tropfen M2-Medium übertragen, und wenn einige Kumuluszellen persistieren, werden sie durch mehrere Gänge von Tropfen zu Tropfen gründlich entfernt, bis die Kumuluszellen vollständig eliminiert sind. Um Hoechst 33342 in einer Endkonzentration von 0,05 Mikrogramm pro Monat herzustellen, beginnen wir mit einer milden Lösung von Hoechst in einer Konzentration von fünf Milligramm pro Monat, die in einmaligen PBS hergestellt und weiter verdünnt wird, bis die erforderliche Konzentration erreicht ist. 3,5 Mikroliter Mikrotropfen Hoechst-Lösung werden auf den Boden eines Petrischalendeckels gegeben und jede einzelne verdünnte Eizelle wird dann in einen einzigen Hoechst-Tropfen übertragen, wobei darauf geachtet wird, die Lichteinwirkung während des Hoechst-Färbeprozesses zu reduzieren, indem die Schale mit einem dunklen Deckel abgedeckt wird.

Nach einer zehnminütigen Färbung werden die Eizellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit UV-Licht betrachtet. Basierend auf der Chromatinkonformation werden sie entweder als Surrounded Nucleolus, SN klassifiziert, wenn sie einen Ring aus x-positivem Chromatin um den Nukleolus aufweisen, oder als Non-Surrounded Nucleolus, NSN, wenn dem Nukleolus ein Ring aus x-positivem Chromatin fehlt und das Gesamtchromatin im Nukleolus dispergiert erscheint. Vier Zwei-Mikroliter-Tropfen Alpha-Mem-Medium werden auf eine Petrischale mit Glasboden gelegt, wobei darauf geachtet wird, dass die Tropfen in einem bestimmten Abstand gehalten werden, die Tropfen werden mit vorgewärmtem und gleichem Mineralöl überlagert und insgesamt drei bis vier Eizellen auf jeden Tropfen übertragen.

Die Petrischale wird in die Inkubationskammer eines Zeitraffermikroskops überführt, was eine verlängerte Zylinderhaltung der Temperatur bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 sowie eine Beleuchtung mit rotem LED-Licht ermöglicht. Vor der Zeitrafferanalyse werden mit der BioStation-Software die Koordinaten jedes Tropfens eingestellt, um den Durchgang von einem Tropfen zum nächsten während der Zeitrafferroutine zu automatisieren. Zeitrafferbilder werden im Acht-Minuten-Takt für insgesamt 15 Stunden aufgenommen.

Die aufgenommenen Filme werden dann mit der CellPave-Software analysiert, die die Detektion von zytoplasmatischen Bewegungen ermöglicht, die in Form von Geschwindigkeitsvektoren ausgedrückt werden. Zunächst wird mit dem CellPave-Tool der Umfang jeder Eizelle manuell abgegrenzt. Dann berechnet die Software die Geschwindigkeit der zytoplasmatischen Bewegung, die beim Vergleich zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitrafferbildern auftritt, und drückt sie aus, indem sie einen farbigen Pfeil platziert, dessen Farbintensität und -länge die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegungen definiert.

Das hier gezeigte Histogramm unter der Eizelle beschreibt die Gesamtgeschwindigkeit der zytoplasmatischen Bewegung während des 15-stündigen Aufzeichnungszeitraums einer SN-Eizelle. Die gleiche Art der Analyse wird an einer NSN-Eizelle durchgeführt. Beachten Sie den verzögerten Extrusionspeak des Polkörpers um einen, der von der NSN-Eizelle im Vergleich zur SN-Eizelle gezeigt wird.

Der untere Bildschirmrand zeigt das zeitliche Muster der zytoplasmatischen Bewegungsgeschwindigkeit der Eizelle. Die Geschwindigkeit wird berechnet, indem zwei aufeinanderfolgende Frames verglichen werden. Die Rohdaten der zytoplasmatischen Bewegungsgeschwindigkeit werden dann in eine Excel-Tabelle exportiert, in der die einzelnen analysierten Eizellen in den Zeilen in der Frens-Sequenz und in den Spalten aufgeführt sind.

Auf der linken Seite die Daten einer SN-Eizelle, auf der rechten Seite die Daten von NSN-Eizellen. Die Daten von SN- oder NSN-Eizellen werden dann in 10 Untergruppen aufgeteilt. Neun werden für das Training verwendet, grüne Farbe.

Und eine für den Blindtest, rote Farbe. Dieser Vorgang wird insgesamt 10 Mal wiederholt. Jedes Mal wird die Blindtestprobe gewechselt.

Die Daten werden dann durch ein künstliches neuronales Feed-Forward-Netz (FANN) untersucht. Das FANN ist so aufgebaut, dass es die gesamten Zeitraffer-Frames analysiert, die hier als Eingabeneuronen bezeichnet werden. "Letztere sind mit drei verborgenen Neuronen verbunden, die ihrerseits mit zwei Ausgabeneuronen verbunden sind. Ein Output gibt die Wahrscheinlichkeit an, dass es sich bei dem Input um eine kompetente Eizelle handelt.

Die andere dagegen, dass es sich bei der Eingabe um eine inkompetente Eizelle handelt. Der Vergleich zwischen den beiden Ausgängen sagt die mentale Kompetenz der Eizell-Dula mit einer Genauigkeit von 91,03 Prozent voraus. Die Technik wurde für Maus-Eizellen entwickelt, wie hier gezeigt.

Der zukünftige Rückruf besteht jedoch darin, es an menschlichen Eizellen zu testen. In der Tat, dass nicht-invasive Verfahren aus der Analyse der Eizellqualität gerade im Bereich der künstlichen Reproduktionstechnologien gefordert sind.