Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

Das übergeordnete Ziel der qPCR-Methode ist es, die Viruslast des equinen Herpesvirus-2 in biologischen Proben von Pferden zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den diagnostischen Bereichen der Atemwegserkrankungen bei Pferden zu beantworten und quantitative Daten zu neuen Interpretationshilfen für Praktiker zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie empfindlich, spezifisch und eine schnelle Methode ist.

Ein weiterer Vorteil ist die Entwicklung nach der AFNOR-Norm NF U47-600, die der französische Vertreter im internationalen Normungskomitee ist. Das Verfahren wird von Erika Hue, einer jungen Forscherin aus meiner Abteilung, vorgeführt. Um Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe von Atemwegsflüssigkeiten zu extrahieren, beginnen Sie unter einem Abzug mit der Zugabe von 140 Mikrolitern biologischer Probe zu 560 Mikrolitern Lyselösung und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie 560 Mikroliter Ethanol in die Probe und tragen Sie 630 Mikroliter der Gesamtlösung auf eine Siliziumdioxidsäule und eine Zentrifuge auf. Die restlichen 630 Mikroliter auf die Kieselsäuresäule geben und erneut zentrifugieren. Nachdem die Probe auf die Säule aufgetragen wurde, verwenden Sie jeweils 500 Mikroliter Waschpuffer AW1 und AW2, um die Säule zweimal zu waschen.

Um die Nukleinsäuren aus der Säule zu eluieren, fügen Sie dann 50 Mikroliter Elutions- oder AVE-Puffer bei Raumtemperatur hinzu. Schließen Sie die Kappe und inkubieren Sie sie eine Minute lang bei Raumtemperatur. Dann eine Minute lang bei 6.000 g zentrifugieren.

Um die DNA zu amplifizieren, bereiten Sie nach der Titration der Primer und der Sonde gemäß dem Textprotokoll 22,5 Mikroliter Reaktionsmischung für jede Reaktion vor, indem Sie 12,5 Mikroliter PCR-Mastermix, 20 mikromolare Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 10 Mikromolare der Sonde und so viel ultrareines Wasser hinzufügen, dass 22,5 Mikroliter erreicht werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung immer in einem bestimmten Bereich vor. Aliquotieren Sie 22,5 Mikroliter des entsprechenden Reaktionsgemisches in jede Reaktionsvertiefung einer 96-Well-Platte.

Fügen Sie Negativkontrollen für Extraktion und PCR hinzu, um sicherzustellen, dass keines der Reagenzien mit unerwünschter DNA kontaminiert ist. Geben Sie anschließend 2,5 Mikroliter entweder der Probe, der Extraktions-Negativkontrolle, der PCR-Negativkontrolle oder der Positivkontrollprobe in die entsprechenden Reaktionsvertiefungen. Verwenden Sie dann eine selbstklebende Plattendichtung, um die Platte abzudecken.

Und zentrifugieren Sie 10 Sekunden lang bei 6.000 g. Legen Sie die Platte in ein real-time PCR-System. Wählen Sie dann die Vorlage für das Assay-Layout und die hier gezeigten PCR-Programmeinstellungen aus und starten Sie den Lauf.

Nachdem Sie die Rohdaten aus dem Echtzeit-PCR-System in eine Tabelle übertragen haben, legen Sie den Schwellenwert in den Amplifikationsdiagrammen über der Basislinie und innerhalb des exponentiellen Wachstumsbereichs fest, um den Schwellenwertzyklus für jede Probe zu erhalten. Plotten Sie jeden Punktstandardsatz als Standardkurve, um Linearität zu erhalten. Berechnen Sie dann die Kopienzahl für die verschiedenen Proben basierend auf der Standardkurve.

Um die Nachweisgrenze der qRT-PCR-Ergebnisse zu bestimmen, geben Sie 90 Mikroliter Reinstwasser in sechs Röhrchen ab. Um sechs zehnfache Serienverdünnungen des Plasmids für die Minderungszone vorzubereiten, beginnen Sie damit, 10 Mikroliter aus der Plasmid-Arbeitsverdünnung in das Röhrchen mit 90 Mikrolitern Reinstwasser zu übertragen. Das Röhrchen kurz vortexen und zentrifugieren.

Übertragen Sie dann 10 Mikroliter aus der Tube in die nächste Tube mit Wasser. Nach dem Vortexen und Zentrifugieren wiederholen Sie den Transfer, bis alle Röhrchen mit Wasser das Plasmid aufgenommen haben. Nach der Amplifikation der DNA in den sechs zehnfachen Reihenverdünnungen, wie zuvor in diesem Video beschrieben, bestimmen Sie die Abatementzone, d. h. die letzte Verdünnung des Plasmids, die ein positives Signal erzeugt, und die erste Verdünnung ohne Nachweis.

Um sechs zweifache Reihenverdünnungen herzustellen, geben Sie 25 Mikroliter Reinstwasser in sechs Röhrchen ab. Von der letzten Verdünnung des Plasmids, die ein positives Signal von den zehnfachen Verdünnungen gab, werden 25 Mikroliter aus dem Röhrchen in das erste Röhrchen mit Wasser übertragen. Vortex und zentrifugieren, bevor die verbleibenden fünf Verdünnungen vorbereitet werden, wie gerade gezeigt.

Amplifizieren Sie die DNA aus den zweifachen seriellen Verdünnungen, wie weiter oben in diesem Video beschrieben. Nach der Amplifikation der DNA aus den drei unabhängigen Studien Berechnen Sie die Anzahl der positiven Replikate aus 24 Replikaten für jede Stufe der Plasmidkonzentration. Bestimmen Sie die LOD mit einer Konfidenz von 95 Prozent oder die LOD 95 % PCR, d. h. das Niveau, das zum Nachweis von 23 positiven Replikaten von 24 Replikaten führt.

Um die LOD des Verfahrens zu bestimmen: Bereiten Sie fünf zweifache Serienverdünnungen vor, beginnend mit 25 Mikrolitern der Plasmid-Arbeitsverdünnung, die viermal konzentrierter ist als die letzte Konzentration aus einer zehnfachen Verdünnung, die ein positives Signal lieferte. Das Plasmid, das in dem Amplifikationsschritt verwendet wird, stammt aus einer Plasmid-Arbeitsverdünnung, die in einem bestimmten Bereich hergestellt wurde, um eine Kontamination zu vermeiden. Das ist ein entscheidender Schritt.

Übertragen Sie 5 Mikroliter von jeder Verdünnung des Plasmids auf vier Röhrchen mit 135 Mikrolitern des negativen Ressourcenmaterials, um vier Replikate der fünf positiven Standards zu erhalten. Führen Sie die Extraktion der vier Replikate für die fünf positiven Standards durch und führen Sie das Amplifikationsverfahren durch, wie weiter oben in diesem Video beschrieben. Zählen Sie die Anzahl der positiven Replikate von acht Replikaten für jede Stufe der Plasmidkonzentration.

Bestimmen Sie abschließend die LOD-Methode, d. h. die letzte Stufe, bei der acht von acht Replikaten positiv sind. Die in diesem Video beschriebene quantitative RT-PCR-Methode weist equide Herpesvirus-2 in Atemwegsflüssigkeiten nach und quantifiziert sie. In diesem Versuch wurden zehnfache serielle Verdünnungen vorgenommen, um die Minderungszone zu schätzen, die zwischen den Verdünnungen 10 bis zur negativen 9 und 10 zur negativen 10 liegt.

Der LOD PCR-Wert wurde mit einer neuen zweifachen seriellen Verdünnung in der Minderungszone bestimmt. Zur Bestimmung des Linearitätsbereichs und der LOQ-PCR Der LOD-PCR-Wert wurde verwendet, um den Bereich von sechs zehnfachen seriellen Verdünnungen zwischen 2,6, dem LOD-PCR-Wert und 260.000 Kopien pro 2,5 Mikroliter Probe zu beginnen. Die LOQ-PCR ist die niedrigste Konzentration im Linearitätsbereich.

Die Charakterisierung der gesamten Methode besteht in der Validierung aller Schritte, die erforderlich sind, um qRT-PCR-Daten zu erhalten, von der Extraktion von DNA aus der Atemwegsprobe bis hin zur Amplifikation und Quantifizierung des Ziels. Die quantitative Leistung der gesamten analytischen qRT-PCR-Methode wurde anhand eines in dieser Grafik dargestellten Genauigkeitsprofils evaluiert und validiert. Die EHV2-Virusgenomladungen in 172 Nasenabstrichproben von Pferden mit Atemwegserkrankungen wurden wie hier gezeigt quantifiziert.

Bei jungen Pferden war die Virusgenomlast höher, wobei die höchste Last bei 1,9 mal 10 bis 11 Kopien pro Milliliter nachgewiesen wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zwei Stunden pro Amplifikationsschritt durchgeführt werden, und die Summe der Validierungsschritte kann in weniger als vier Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Risiko einer Kontamination zu vermeiden, insbesondere bei der Arbeit mit einer Plasmidlösung.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Genomidentifikation zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Extraktion und Amplifikation von DNA durchführt und ihre PCR-Reserven charakterisiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben wie Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten in einer Haube und ein angepasster Bereich der Sicherheitsstufe.