Name: Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Lernen Sie eine validierte quantitative PCR-Methode zur Diagnose von Equiden Herpesvirus-2 in Atemflüssigkeiten von Pferden. Dieses sensitive Verfahren liefert präzise virale Lastdaten für die klinische Veterinärmedizin.

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Die Autoren danken Sophie Castagnet und Nadia Doubli-Bounoua für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde finanziell vom Generalrat von Calvados und im Einvernehmen zwischen der Region Basse-Normandie und der französischen Regierung unterstützt (CPER 2007-2013; Projekt R25 p3). Die Autoren danken den Experten der AFNOR-Gruppe, insbesondere Jean-Philippe Buffereau und Eric Dubois.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Seit den 2000er Jahren, Echtzeit-PCR wurde ersetzt Goldstandardtechniken (Zellkultur und Bakterienkultur Methoden) in einer wachsenden Zahl von Laboratorien. Die Umsetzung der Technik ist relativ einfach. Jedoch Validierung von Laborverfahren ist wesentlich für die molekulare Erkennung und Quantifizierung von Pathogenen genaue, wiederholbare und zuverlässige Daten zu gewährleisten. Da der Extraktionsschritt die Hauptquelle für den Verlust der biologischen Material ist, kann es die Hauptfehlerquelle der Quantifizierung zwischen einem Protokoll und einem anderen betrachtet. Als solche kann die Schaffung einer Standardkurve von DNA Plasmids während qRT-PCR, vor allem in der Literatur berichtet wurde, zeigt die Viruslast Genom aber nicht berücksichtigt nicht der Extraktionsschritt. Beschreibung eines De - novo - Strategie für eine ganze Methode Validierungsprozess in der AFNOR - Norm NF U47-600-2 stellt einen bedeutenden Fortschritt auf diesem Gebiet. Wie veranschaulicht indieses Papier für EHV-2 bei Pferden oder von anderen in Bienen 21 erfordert diese klare Unterscheidung zwischen dem Entwicklungsschritt und der Validierungsschritt mit Charakterisierung der PCR und Charakterisierung des gesamten Verfahrens. Eine Einschränkung in diesem interessanten Ansatz ist, dass jede Änderung des Protokolls in der Verpflichtung führen werden, den gesamten Prozess erneut zu validieren, die sehr teuer sein könnte. Diese Begrenzung wurde auch durch die Tatsache hervorgehoben , dass die Grenzen der Quantifizierung auf der Quelle abhängen , aus dem das Virus extrahiert wird (beispielsweise Atmungsflüssigkeiten, Organen, Blut oder Urin). In der Tat stellt jede Matrix unterschiedliche Spezifitäten in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften und es ist wichtig, unabhängig jede unterschiedliche Matrix für virale Detektion und Quantifizierung durch qRT-PCR verwendet zu definieren. Somit kann das virale Genom Last jeder biologischen Probe genauer aus der Extraktion werden quantifiziert. Die Charakterisierung berücksichtigt auch die Thermocycler model und wenn die Verwendung eines zuvor gut charakterisierten Verfahren (beispielsweise das EHV-2 qPCR Verfahren in diesem Papier beschrieben) , um eine neue Art von Maschine in Laboratorium Mutter erfordert oder einem anderen Labor, muß man die Leistung des Instruments zu bestätigen. Die Bestätigung der Durchführung eines Assays qPCR ist Voraussetzung für alle Tests in einem Labor zu bringen. Dies wird normalerweise durch die Analyse einer Bezugsprobe mit bekannten Eigenschaften erreicht. Eine solche Prüfung ist Voraussetzung und zwingend angesehen, wie durch die NF 47-600-1 AFNOR-Norm gefordert, um die Leistung der qPCR (LOD, LOQ Effizienz) und die Robustheit des gesamten Verfahrens (LOD, LOQ) zu validieren. Nicht nur während der Entwicklung und Charakterisierung Schritte sondern auch, wenn in der Forschung oder für diagnostische Zwecke verwendet werden, können die Risikofaktoren identifiziert werden und gut kontrollierte Standardisierung des Protokolls zu gewährleisten. Von besonderer Bedeutung ist eine angemessene Ausbildung des Personals, hoch qualifiziertes Personal, Qualitätskontrolle der Verbrauchsmaterialiengebrauchte und ihre Lagerung, Kontrolle über die unmittelbaren Umgebungsbedingungen und das Bewusstsein für messtechnische Bedingungen, die in dem Test beteiligt, die Leistung der wissenschaftlichen Instrumente beeinflussen können. Verwendung von Referenzproben für die Interlabor-Vergleiche könnten auch helfen, die Unsicherheiten zu steuern. Auf diese Weise Vergleich von Daten zwischen Laboratorien kann erleichtert werden. Tatsächlich sind Interlabor-Eignungsprüfungen unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit des Verfahrens zu bewerten und zu bestätigen. Viralen Genoms Last Ergebnisse, die in internationalen Einheiten (IE) der analysierten biologischen Matrix ausgedrückt werden (IU: Kopien / ml für Flüssigkeiten oder Kopien / g Gewebe) sind einfacher zu verwenden, um Ergebnisse zwischen verschiedenen Labors zu vergleichen. Alle Ergebnisse über dem LOQ als Kopien ausgedrückt / ml und ein Ergebnis zwischen dem LOD und LOQ genommen wird als nicht quantifizierbare positive Ergebnis. quantificational Daten des Genoms Presenting entspricht mehr auf diese Weise genau auf die Vorarbs von Analysen (Amplifikation des Genoms). In der Tat, in Zellkulturexperimenten, die Expression der Viruslast durch TCID 50 (mittlere Gewebekulturinfektionsdosis) von der Art der Zellen und Virusstämme abhängt. Jeder Stamm Linie besitzt eine einzigartige Infektion Kinetik und einige Viren wie EHV-2 kann mehrere Tage dauern, bis die ersten zytopathogener Effekt ist offensichtlich. Abschließend diese neue Methode zur Charakterisierung von qRT-PCR sollte die Harmonisierung der Datendarstellung und Interpretation zwischen den Labors erleichtern. Dies wird für potenzielle neue Anwendungen der qRT-PCR in Zukunft wie die Einrichtung eines Cut-off-Wert für die Erklärung der Krankheitsstatus sehr nützlich sein, anstatt nur das Vorhandensein oder Fehlen des Erregers.

Equid Herpes - Virus-2 (EHV-2) in einem Respiratorisches Syndrom, mit potentiellen klinischen Manifestationen wie Nasenausfluss, Pharyngitis und geschwollene Lymphknoten 1-3 beteiligt. Dieses Virus wird vermutet , auch mit den Armen-Leistung von Pferden in Verbindung gebracht werden, die zwei in einer signifikanten und negativen wirtschaftlichen Auswirkungen für die Pferdebranche führen kann. Bisher war der Goldstandard für die Gamma-EHV (γ-EHV) Detektion der Zellkulturverfahren. Der erste Nachteil dieses Verfahrens war das Fehlen der Diskriminierung zwischen EHV-2 und γ-EHV ist (zB EHV-5). Der zweite Nachteil war die langsame Entwicklung des cytopathischen Verfahren, die vom 12. bis 28 Tage dauert 4,5 zu manifestieren. Entwicklung eines validierten und normalisierte quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) -Methode wird dazu beitragen, schnell das Virus zu erkennen, zwischen EHV-2 und EHV- zu diskriminieren5 und die Beziehung zwischen dem viralen Genom Last und die Krankheit durch die Quantifizierung Aspekt zu studieren. Die Polymerase - Kettenreaktion (PCR) wurde 1986 von Mullis 6 zum ersten Mal beschrieben und ist über die neue Goldstandard zu werden in die meisten Felder der biologischen Diagnose (Mensch, Umwelt und Tier). Dieses Verfahren, das auf die Amplifikation eines Teils des Genoms der Pathogene basiert, stellt viele Vorteile: Spezifität, Empfindlichkeit und Schnelligkeit. Darüber hinaus zurückgetreten das Risiko von Amplikonkontamination seit dem Aufkommen der qRT-PCR und Qualitätssicherung 7. Dennoch erforderte die Anerkennung der PCR als neuen Goldstandard-Methode mehr als nur Spieldaten verbessert, sondern auch die Demonstration der Kontrolle der Entwicklung und Validierung Schritte des gesamten Verfahrens ohne Verschlechterung der Leistung im Laufe der Zeit. Die erste molekulare Werkzeuge für die Detektion verwendet EHV-2 wurden Zeit consuming und beteiligten unspezifische Amplifikation mit nested PCR 8 durch Sequenzierung gefolgt. Die gezielte Gene für Herpes - Viren wurden Desoxyribonukleinsäure (DNA) Polymerase und DNA Verpackung 9. Jedoch nested PCR stellt ein hohes Risiko der Kontamination durch Amplikons. Seitdem haben sich herkömmliche PCR - Tests entwickelt worden , um die Interleukin-10-like - Gen oder Glycoprotein B - Gens zu amplifizieren, überprüft 2009 2. In jüngerer Zeit, Echtzeit - PCR Eigenschaften für die Quantifizierung von EHV-2 beschrieben sind, wurden 10 jedoch keine Daten zur Verfügung standen in Bezug auf die Validierung des gesamten Verfahrens einschließlich des Extraktionsprozesses. In diesem Protokoll, Entwicklungs- und Validierungsverfahren sind für eine quantitative PCR - Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von EHV-2 - DNA in der Pferdeatmungsflüssigkeiten nach der Association Française de normalisation (AFNOR) Norm NF U47-600 3,11,12 beschrieben, das ist der Französisch Vertreter indie internationale Normalisierungskommission. Diese Norm beschreibt die &quot;Anforderungen und Empfehlungen für die Umsetzung, Entwicklung und Validierung von Tier PCR in der Tiergesundheit Analyseverfahren&quot; 11,12, nach dem NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 und OIE (Weltorganisation für Tiergesundheit) . Empfehlungen, 2010 14 der EHV-2 qRT-PCR - Validierungsprotokoll beinhaltet ein dreiteiliges Verfahren: (a) Entwicklung der qRT-PCR - Test, (b) Charakterisierung der qRT-PCR - Test allein und (c) Charakterisierung des gesamten Analyseverfahren (von der Extraktion von Nukleinsäuren aus der biologischen Probe zur PCR-Analyse). Die Charakterisierung der qRT-PCR-Assays und des gesamten Analysemethode umfassen die Definition von zwei Grenzen: Die Nachweisgrenze (LOD) und der Bestimmungsgrenze (LOQ). Die LOD 95% PCR stellt die niedrigste Anzahl von Nukleinsäure Kopien pro Volumeneinheit , die in 95% aller cas nachgewiesen werden kannes. Die Bestimmungsgrenze von 95% PCR stellt die niedrigste Menge an Nukleinsäure Kopien, die die Unsicherheiten unter Berücksichtigung bestimmt werden kann. Diese qRT-PCR-Methode ermöglicht die präzise Erfassung und schnelle Quantifizierung von EHV-2 in der Atem Flüssigkeiten. Darüber hinaus könnte das Verfahren in anderen Laboratorien angewendet werden, um ein standardisiertes Verfahren, um sicherzustellen, und als allgemeine Vorlage für die Entwicklung weiterer neuer qRT-PCR-Assays.

<table><tbody><tr><td>AB-1900 natürliche Farbe ABgene 96 Well-Platte&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16924</td><td></td></tr><tr><td>Klebefolie qPCR Absolut&nbsp;</td><td>Dutsher</td><td>16629</td><td>Klebefolie zum Versiegeln der Platte vor dem qRT-PCR-Lauf</td></tr><tr><td>0,5 ml Mikroröhrchen, mit Rand, Kappen</td><td>Dutsher</td><td>039258</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 98%</td><td>Sodipro</td><td>SAF322941000</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Eurofins</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Probe</td><td>Life Technologies</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid</td><td>Eurofins</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp&nbsp; RNA viral Mini Kit (enthält: QIAamp Mini Säule, AVL&nbsp; Puffer,&nbsp; AW1 Puffer, AW2 Puffer, AVE Puffer, Sammelröhrchen)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>AVL-Puffer: 5 min bei 72 μg vorwärmen; C-Sequenzierung</td></tr><tr><td>mit der Sanger-Methode</td><td>Eurofins</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4364340</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA Pufferlösung</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296653A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c Spektralphotometer</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR Systeme</td><td>Life Technologies</td><td>4376600</td><td>vorwärmen 15 min&nbsp;</td></tr></tbody></table>

entwicklung und validierung einer quantitativen pcr-methode für equiden herpesvirus-2-diagnose in atem flüssigkeiten

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Das Protokoll beschreibt eine quantitative RT-PCR-Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von EHV-2 in Atemflüssigkeiten von Pferden gemäß der Norm NF U47-600. Nach dem Entwicklungs- und ersten Validierungsschritt wurden zwei unterschiedliche Charakterisierungsschritte gemäß der AFNOR-Norm durchgeführt: (a) die Charakterisierung des qRT-PCR-Assays allein und (b) die Charakterisierung der gesamten analytischen Methode. Die Validierung der gesamten Analysemethode umfasste die Darstellung aller Schritte zwischen der Extraktion der Nukleinsäuren und der abschließenden PCR-Analyse. 
Die Validierung der gesamten Methode ist sehr wichtig für den Virusnachweis mittels qRT-PCR, um eine genaue Bestimmung der viralen Genomlast zu erhalten. Da der Extraktionsschritt die Hauptursache für den Verlust von biologischem Material ist, kann er als Hauptquelle für Fehler bei der Quantifizierung zwischen den Protokollen angesehen werden. Aus diesem Grund empfiehlt die AFNOR-Norm NF-U-47-600, den Bereich der Plasmidverdünnung vor dem Extraktionsschritt einzubeziehen. Darüber hinaus hängen die Grenzen der Quantifizierung von der Quelle ab, aus der das Virus extrahiert wird. Die Ergebnisse der Virusgenomlast, die in internationalen Einheiten (IE) ausgedrückt werden, sind einfacher zu verwenden, um die Ergebnisse zwischen verschiedenen Laboratorien zu vergleichen. 
Diese neue Methode zur Charakterisierung der qRT-PCR sollte die Harmonisierung der Datenpräsentation und -interpretation zwischen Laboratorien erleichtern.

Die quantitative RT-PCR - Methode, wie oben beschrieben, durchgeführt wurde , zu detektieren und equid herpesvirus-2 in Atmungsflüssigkeiten quantifizieren. 1 stellt einen schematischen Arbeitsablauf - Diagramm für die Entwicklung und Validierung eines quantitativen RT-PCR - Verfahren nach der AFNOR - Norm NF U47-600. Spezifität der Primer und Sonden wurden während der Schritt-für-Schritt Entwicklung der PCR validiert. Nur EHV-2-Stämme wurden in diesem System amplifiziert. Anschließend war die Leistung der qRT-PCR charakterisiert. Erstens, die LOD PCR abzuschätzen, a 6 zehnfachen Reihenverdünnung durchgeführt wurde , das Minderungszone (Figur 2) zu schaffen. In diesem Beispiel 6 zehnfache serielle Verdünnungen wurden zwischen 10 -5 und 10 bis 10 (zwischen 26.000 und 0,26 Kopien / 2,5 &amp; mgr; l - Probe) zu schätzen , die LOD PCR hergestellt. Die Minderungszone lies zwischen Verdünnungen von 10 -9 und 10 -10 (zwischen 2,6 und 0,26 Kopien / 2,5 ul Probe). Um die LOD PCR - Wert in diesem Fall 6 zweifache serielle Verdünnungen des Plasmids bestimmen wurden in dieser Minderungszone zwischen 5,2 und 0,16 Kopien / 2,5 ul Probe gemacht. Die LOD PCR - Wert lag bei 2,6 Kopien / 2,5 ul Probe. Um den Linearitätsbereich und LOQ PCR bestimmen, wurde die LOD PCR - Wert verwendet , um den Bereich von 6 zehnfache Reihenverdünnungen zu starten, zwischen 2,6 (LOD PCR) und 260.000 Kopien / 2,5 &amp; mgr; l Probe. 3 veranschaulicht eine lineare Regression für die EHV2 qRT-PCR von einer Studie. Die Leistungen der linearen Regression (Abbildung 4) sind in vierfacher Ausfertigung validiert unter Verwendung der beschriebenen Berechnungen in Tabelle 3. Die Berechnungen durchgeführt werden , nach den Linearitätsbereich zu definieren , um die Kriterien absolute Bias i value ≤ 0,25 log 10, unabhängig von der Ebene i von Plasmid - Last. In diesem Fall Bereich lag die Linearität zwischen 2,6 und 260.000 Kopien / 2,5 ul Probe. LOQ PCR ist die niedrigste Konzentration in der Linearitätsbereich (dh 2,6 Kopien / 2,5 &amp; mgr; l Probe in diesem Fall). U LIN wurde 2.6-260,000 Kopien / 2,5 ul DNA zu 0,12 log 10 im Bereich bestimmt. Nach der Entwicklung (Abbildung 1, blau) und Charakterisierung der qRT-PCR (Abbildung 1, gelb), empfiehlt die AFNOR NF U47-600 norm Charakterisierung des gesamten Analyseverfahrens von DNA Extraktion qRT-PCR (Abbildung 1, orange). Die diagnostische Sensitivität und Spezifität wurden in Tabelle 4. Die quantitativen Leistungen der qRT-PCR ganze analytische Verfahren , wie es berechnet wurde mit einer Genauigkeit Profil ausgewertet und validiert ( <strong&gt; Abbildung 5). Dieses Protokoll, das state-of-the-Art molekularen Technologie nutzt, erlaubt uns die EHV-2-Virusgenom Last in 172 Nasentupferproben von Pferden mit Atemwegserkrankungen und / oder klinischer Verdacht auf Infektion erhalten nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Inzidenz von EHV-2 aus dem Feld (biologischen) Proben betrug 50% (86/172) in dieser Population. Die quantitativen Analysen zeigten , dass virale Genom Lasten von EHV-2 bei jungen Pferden waren signifikant höher und die Neuverteilung der viralen Genoms Lasten verringert mit dem Alter (Abbildung 6). In der vorliegenden Studie wurde die höchste EHV-2 Genom virale Belastung (1,9 x 10 11 Kopien / ml) wurde in Fohlen (Abbildung 6) detektiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow - Diagramm für die Entwicklung (blau), die Charakterisierung der quantitativen RT-PCR(gelb) und die Charakterisierung des gesamten Analyseverfahrens von DNA Extraktion qRT-PCR (orange) gemäß der AFNOR - Norm NF U47-600-2. Der Arbeitsablauf - Diagramm nimmt die verschiedenen Schritte für die Entwicklung, die Charakterisierung der quantitative RT -PCR und die Charakterisierung des gesamten Analyseverfahrens von DNA Extraktion qRT-PCR. Für jeden Schritt, die Anzahl der erforderlichen Durchläufe zeigt das Workflow - Diagramm, führen zu Verdünnungen und die Anzahl der benötigten Analysten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig2.jpg" /> Abbildung 2: Bestimmung der Bekämpfungszone mit repräsentativen Ergebnissen von real-time PCR - Kurven mit 6 zehnfache serielle Verdünnungen von Plasmid erhalten. Um die Minderungszone schätzen, 6 zehnfache SerienVerdünnungen werden zwischen 10 -5 (26.000 Kopien / 2,5 ul Probe) und 10 bis 10 (0,26 Kopien / 2,5 ul Probe) hergestellt. Die Vermeidungszone liegt zwischen Verdünnungen von 10 -9 (2.6 Kopien / 2,5 ul Probe) und 10 bis 10 (0,26 Kopien / 2,5 ul Probe). In diesem Fall 6 zweifache serielle Verdünnungen von Plasmid wurden in dieser Minderungszone machte die LOD 95% PCR, zwischen 5,2 und 0,16 Kopien / 2,5 ul Probe. , Um zu bestimmen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken hier</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig2large.jpg" target="_blank">um eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig3.jpg" /> Fig . 3: Die lineare Regression für EHV2 qRT-PCR Die Linearität der quantitativen Tests ist die Fähigkeit , Ergebnisse zu erzeugen , die in einem bestimmten Bereich auf die Konzentration des Ziel proportional sind. Dies kann dadurch modelliert werden,lineare Regression (y = ax + b) zwischen der Instrumentenantwort (Zyklus Schwelle oder Ct) und dem Logarithmus der Menge des Ziels (Anzahl der Ziel Kopien / 2,5 ul Probe). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig4.jpg" /> Abb . 4: Durchführung der linearen Regression von EHV-2 qPCR mittlere Vorspannung stellen die mittlere Differenz zwischen der gemessenen Menge Plasmid ( <img alt="fig4-1" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-1.jpg" /> ) Und die theoretische Plasmid Menge (x &#39;i) für jedes Plasmid - Ebene. Vertikale Balken repräsentieren die Linearität Unsicherheit (U Lini) durch die Formel <img alt="fig4-2" src="/files/ftp_upload/53672/fig4-2.jpg" /> wo SD&#39;i ist die Standardabweichung o<html> f gemessen Plasmid Menge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Genauigkeit Profile auf der Basis der Validierungsergebnisse des EHV-2 qRT-PCR - Methode Die grüne Linie (Kreise) stellt die Richtigkeit der Daten (systematischer Fehler oder Bias). Die Akzeptanzgrenzen sind bei ± 0,75 log 10 durch das Labor (gestrichelte Linien) definiert. Die untere und die obere Genauigkeitsgrenzen für jedes Plasmid Lastniveau aus dem zweimal bedeuten Bias bestimmt ± Standardabweichung der Zuverlässigkeitsdaten (rote Linien). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53672/53672fig6.jpg" /> Abbildung 6:. Die Quantifizierung der viralen Genoms Lasten von EHV-2 nach Alter Das virale Genom Lastverteilung von EHV-2 in Nasentupferproben nachgewiesen wird für die verschiedenen Altersgruppen vertreten. Die horizontalen Linien stellen die Medianwerte innerhalb der Standardabweichung (m = Monate). * Signifikant verschieden von ANOVA mit Newman-Keuls post-hoc - Test (p &lt;0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zielgen </td><td colspan="3"> Grundierungen, Sonde und Plasmid - Sequenzen (5&#39;-3 &#39;) </td><td> Nukleotidposition </td><td> Produktgröße (Nukleotide) </td><td colspan="2"><strong&gt; Thermozyklusbedingungen </td><td> Referenzen </td></tr><tr><td rowspan="4"> EHV2 gB (HQ247755.1) </td><td colspan="3"> Forward: GTGGCCAGCGGGGTGTTC </td><td> 2113-2130 </td><td rowspan="4"> 78 </td><td> 95 ° C 5 min </td><td></td><td rowspan="4"> 11 </td></tr><tr><td colspan="3"> Reverse: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA </td><td> 2189-2170 </td><td> 95 ° C 15 sec </td><td rowspan="2"> 45 Zyklen </td></tr><tr><td colspan="3"> Sonde: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB </td><td> 2132-2157 </td><td> 60 ° C 1 min </td></tr><tr><td colspan="3"> Plasmid: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG </td><td> 2081-2381 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Die Sequenzen der Primer, Sonden und positive synthetische DNA Kontrollen in diesem Protokoll verwendet Die Sequenz von Plasmid (positive synthetische DNA) entspricht Positionen 2081 bis 2381 der Sequenz EHV2gB bis Nukleotid (HQ247755.1). Das Design von Primern und Sonden in diesem Protokoll verwendet wurde, durch Verwendung spezieller Software erhalten. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> PATHOGENS </td><td rowspan="2"> Referenz (Ursprung) </td><td rowspan="2"> Anzahl der Stämme </td><td> ERGEBNISSE </td></tr><tr><td> EHV-2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-2 </td><td> VR701 (ATCC) </td><td rowSpan = &quot;2&quot;&gt; 20 </td><td rowspan="2"> Positiv </td></tr><tr><td> 20 Proben (FDL-Sammlung) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-5 </td><td> KD05 (GERC) </td><td rowspan="2"> 20 </td><td rowspan="2"> Negativ </td></tr><tr><td> 20 Proben (FDL-Sammlung) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-3 </td><td> VR352 (ATCC) </td><td rowspan="2"> 2 </td><td rowspan="2"> Negativ </td></tr><tr><td> T934 WSV (GERC) </td></tr><tr><td rowspan="2"> EHV-1 </td><td> Kentucky Stamm Ky A (ATCC) </td><td rowspan="2"> 3 </td><td rowspan="2"> Negativ </td></tr><tr><td> 2 Proben (FDL-Sammlung) </td></tr><tr><td> EHV-4 </td><td> VR2230 (ATCC) </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Asinine herpesvirus AHV5 </td><td> FDL-Sammlung </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td rowspan="2"> PferdeInfluenza-Virus </td><td> A / Pferde / Jouars / 4/2006 (H3N8) </td><td rowspan="2"> 1 </td><td rowspan="2"> Negativ </td></tr><tr><td> (Zugangsnummer JX091752) </td></tr><tr><td> Equine Arteritis Virus </td><td> VR796 (ATCC) </td><td> 2 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Rhodococcus equi </td><td> FDL-Sammlung </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. zooepidemicus </td><td> FDL-Sammlung </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Streptococcus equi subsp. equi </td><td> FDL-Sammlung </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Coxiella burnetii </td><td> ADI-142-100 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Chlamydophila abortus </td><td> ADI-211-50 (Adiagene) </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Klebsiella pneumoniae </td><td> FDL-Sammlung </td><td> 1 </td><td> Negativ </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Analytische Spezifität der qRT-PCR für EHV-2. <img alt="Tabelle 3" src="/files/ftp_upload/53672/53672table3.jpg" /> Tabelle 3: Berechnung der Vorspannung und Linearität Unsicherheit (angepasst von NF U47-600-2 12). Für jeden Versuch, die Leistungen der linearen Regression (y = ax + b) werden unter Verwendung der Tabelle validiert , wobei y der Zyklus Schwellenwert erreicht ist, eine die Neigung erhalten wird;. X ist das Plasmid Ebene und b ist der Schnittpunkt i ist das Plasmid Pegel (i variiert von 1 bis k Stufen); k die Anzahl der Plasmid - Ebenen verwendet wird (beispielsweise k = 6 in tseinen Tisch); j der Studie (j von 1 bis I - Studien variiert); I ist die Anzahl der Versuche, zwischen 3 und 6 Studien (zB I = 4 in dieser Tabelle) x i die geschätzte Plasmid Menge für jeden ist. i Plasmid - Ebene. x i &#39;i die theoretische Gleichung x erhaltene Plasmid Menge ist&#39; = 10 log (x i) für jedes i Ebene Plasmid. Während jeder j - Studie erhalten die Zyklus Schwellenwert für jedes i Plasmid-Ebene wird mit der linearen Regression berechnet, y i, j = a j x i, j + b j. <img alt="table3-1" src="/files/ftp_upload/53672/table3-1.jpg" /> ist die gemessene Menge Plasmid während des Prozesses j. Bias i </<html> sub&gt; ist der Unterschied zwischen der gemessenen Plasmid Menge und der theoretischen Plasmid Menge für jeden Versuch und jedes Plasmid Ebene beobachtet. <img alt="table3-2" src="/files/ftp_upload/53672/table3-2.jpg" /> ist der Mittelwert von <img alt="table3-3" src="/files/ftp_upload/53672/table3-3.jpg" /> von jeder i - Ebene Plasmid; SD &#39;i die Standardabweichung der Messgröße ist <img alt="table3-4" src="/files/ftp_upload/53672/table3-4.jpg" /> für jedes i Plasmid - Ebene; Mittlere Vorspannung ist der Mittelwert von Bias i; U Lini die Linearität Unsicherheit ist für jedes i - Ebene aus SD&#39;i berechnet Plasmid bestimmt und die mittlere Bias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53672/53672table3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 1 &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;fo: keep-mit-next.within-page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> Echt Status der Probe </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Positiv </td><td> Negativ </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ergebnisse mit ganzen Verfahren erhalten </td><td> Positiv </td><td> RP (real positiv) </td><td> FP (false positive) </td></tr><tr><td> Negativ </td><td> FN (falsch negativ) </td><td> RN (real negativ) </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> RP + FN </td><td> FP + RN </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Se = RP / (RP + FN) </td><td> Sp = RN / (RN + FP) </td></tr></tbody></table> Tabelle 4:. Berechnung der diagnostischen Sensitivität (Se) und Spezifität (Sp) des gesamten Verfahrens A Schwartz Tabelle verwendet , um die confid zu berechnenrenzIntervall bei 95% der Empfindlichkeit und Spezifität des gesamten Verfahrens wie in NF U47-600-2 beschrieben.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode, die zum Nachweis und zur Quantifizierung von EHV-2-DNA in Atemwegsflüssigkeiten von Pferden verwendet wird. Das EHV-2 qRT-PCR-Validierungsprotokoll umfasst ein dreiteiliges Verfahren: Entwicklung, Charakterisierung des qRT-PCR-Assays allein und Charakterisierung der gesamten Analysemethode.

Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Das übergeordnete Ziel der qPCR-Methode besteht darin, die Viruslast von Equinem Herpesvirus-2 in biologischen Proben von Pferden zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im diagnostischen Bereich von Atemwegserkrankungen bei Pferden zu beantworten und quantitative Daten für neue interpretative Hilfsmittel für Tierärzte bereitzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie empfindlich, spezifisch und eine schnelle Methode ist.Ein weiterer Vorteil ist die Entwicklung gemäß der AFNOR-Norm NF U47-600, die den französischen Vertreter im internationalen Normungsausschuss darstellt. Die Durchführung des Verfahrens wird Erika Hue, eine junge Forscherin aus meiner Einheit, demonstrieren. Um Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe von Atemwegsflüssigkeiten zu gewinnen, geben Sie unter einem Abzug zunächst 140 µL biologische Probe zu 560 µL Lyselösung hinzu und inkubieren 10 Minuten bei Raumtemperatur.Fügen Sie 560 Mikroliter Ethanol zur Probe hinzu und geben Sie 630 Mikroliter der Gesamtlösung auf eine Silica-Säule, anschließend zentrifugieren. Geben Sie die verbleibenden 630 Mikroliter auf die Silica-Säule und zentrifugieren erneut. Nachdem die Probe auf die Säule aufgetragen wurde, spülen Sie die Säule zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern der Waschpuffer AW1 und AW2. Um anschließend die Nukleinsäuren von der Säule zu eluieren, 50 Mikroliter Elutionspuffer oder AVE-Puffer mit Raumtemperatur hinzufügen. Die Kappe schließen und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend eine Minute bei 6.000 × g zentrifugieren.Um die DNA zu amplifizieren, bereiten Sie nach der Titration der Primer und der Sonde gemäß dem Textprotokoll für jede Reaktion 22,5 Mikroliter Reaktionsmix zu, indem Sie 12,5 Mikroliter PCR-Mastermix, 20 Mikromolar vorwärts- und rückwärtsgerichtete Primer, 10 Mikromolar der Sonde und so viel ultra-reines Wasser hinzufügen, wie erforderlich ist, um 22,5 Mikroliter zu erreichen. Um Kontaminationen zu vermeiden, bereiten Sie den PCR-Reaktionsmix stets in einem spezifischen Bereich vor. Portionieren Sie 22,5 Mikroliter des entsprechenden Reaktionsmixes in jedes Reaktionsgefäß einer 96-Loch-Platte. Verwenden Sie negative Kontrollen für die Extraktion und PCR, um sicherzustellen, dass keiner der Reagenzien mit unerwünschter DNA kontaminiert ist. Geben Sie anschließend 2,5 µL entweder der Probe, der Extraktions-Negativkontrolle, der PCR-Negativkontrolle oder der Positivkontrollprobe in die entsprechenden Reaktionsgefäße. Versiegeln Sie die Platte dann mit einer klebenden Plattenfolie.Und zentrifugieren Sie 10 Sekunden bei 6.000 × g. Stellen Sie die Platte in ein Echtzeit-PCR-System. Wählen Sie anschließend die hier gezeigte Vorlage für die Assayanordnung und die PCR-Programmeinstellungen und starten Sie den Lauf.Nachdem die Rohdaten vom Echtzeit-PCR-System in eine Tabellenkalkulation übertragen wurden, setzen Sie die Schwelle in den Amplifikationskurven oberhalb der Basislinie und innerhalb des exponentiellen Wachstumsbereichs, um die Schwellenzykluszahl für jede Probe zu ermitteln. Tragen Sie jeden Punkt des Standardansatzes als Standardkurve auf, um die Linearität zu überprüfen. Anschließend berechnen Sie die Kopienzahl für die verschiedenen Proben anhand der Standardkurve.Um die Nachweisgrenze der qRT-PCR-Ergebnisse zu bestimmen, geben Sie 90 Mikroliter ultra-reines Wasser in sechs Röhrchen. Um sechs zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids vorzubereiten, um die Abbaustufe anzuzielen, überführen Sie zunächst 10 Mikroliter aus der Arbeitsverdünnung des Plasmids in das Röhrchen mit 90 Mikrolitern ultra-reinem Wasser. Vortexen Sie das Röhrchen kurz und zentrifugieren Sie es anschließend.Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter aus dem Röhrchen in das nächste Wasser-Röhrchen. Nach dem Vortexen und Zentrifugieren wird die Übertragung wiederholt, bis alle Wasser-Röhrchen das Plasmid erhalten haben. Nach der Amplifikation der DNA in den sechs zehnfachen seriellen Verdünnungen, wie zuvor in diesem Video beschrieben, bestimmen Sie die Abbaustufe, also die letzte Verdünnung des Plasmids, die ein positives Signal ergibt, und die erste Verdünnung, bei der kein Nachweis erfolgt.Um sechs Verdünnungsreihen in zweifacher Verdünnung vorzubereiten, pipettieren Sie 25 Mikroliter ultra-reines Wasser in sechs Reagenzröhrchen. Übertragen Sie aus der letzten Plasmidverdünnung, die ein positives Signal in den zehnfachen Verdünnungen ergab, 25 Mikroliter aus dem Röhrchen in das erste Wasser-Röhrchen. Vortexen und zentrifugieren Sie, bevor Sie die verbleibenden fünf Verdünnungen wie gerade gezeigt vorbereiten.Amplifizieren Sie die DNA aus den zweifachen seriellen Verdünnungen, wie zuvor in diesem Video beschrieben. Nach der Amplifikation der DNA aus den drei unabhängigen Versuchen berechnen Sie die Anzahl der positiven Replikate von insgesamt 24 Replikaten für jedes Niveau der Plasmidkonzentration. Bestimmen Sie die Nachweisgrenze mit einer Konfidenz von 95 Prozent oder LOD 95 Prozent PCR, also das Niveau, das zur Detektion von 23 positiven Replikaten von 24 Replikaten führt.Um die Nachweisgrenze (LOD) der Methode zu bestimmen, bereiten Sie fünf Verdopplungsverdünnungen vor, beginnend mit 25 Mikrolitern der Plasmid-Arbeitsverdünnung, die viermal konzentrierter ist als die letzte Konzentration einer zehnfachen Verdünnung, die ein positives Signal ergab. Das im Amplifikationsschritt verwendete Plasmid stammt aus einer Plasmid-Arbeitsverdünnung, die in einem spezifischen Bereich vorbereitet wurde, um Kontaminationen zu vermeiden. Dies ist ein kritischer Schritt.Übertragen Sie 5 Mikroliter von jeder Verdünnung des Plasmids auf vier Röhrchen mit jeweils 135 Mikrolitern des negativen Ressourcenmaterials, um vier Replikate der fünf positiven Standardproben zu erhalten. Führen Sie die Extraktion der vier Replikate für die fünf positiven Standardproben durch und führen Sie die Amplifikationsprozedur wie zuvor in diesem Video beschrieben durch. Zählen Sie die Anzahl der positiven Replikate von insgesamt acht Replikaten für jede Konzentrationsstufe des Plasmids.Bestimmen Sie abschließend die Nachweisgrenzenmethode, also die letzte Stufe, bei der acht von acht Replikaten positiv sind. Die in diesem Video beschriebene quantitative RT-PCR-Methode weist Equid Herpesvirus-2 in Atemwegsflüssigkeiten nach und quantifiziert es. In diesem Experiment wurden zehnfache serielle Verdünnungen durchgeführt, um die Abschwächungszone abzuschätzen, die zwischen den Verdünnungen 10 hoch minus 9 und 10 hoch minus 10 liegt.Der LOD-PCR-Wert wurde mit einer neuen zweifachen seriellen Verdünnung in der Abbaustufe bestimmt. Um den Linearitätsbereich und den LOQ-PCR zu ermitteln, wurde der LOD-PCR-Wert verwendet, um einen Bereich von sechs zehnfachen seriellen Verdünnungen zwischen 2,6, dem LOD-PCR-Wert, und 260.000 Kopien pro 2,5 Mikroliter Probe abzudecken. Der LOQ-PCR ist die niedrigste Konzentration innerhalb des Linearitätsbereichs.Die Charakterisierung des gesamten Verfahrens umfasst die Validierung aller Schritte, die notwendig sind, um qRT-PCR-Daten von der DNA-Extraktion aus der Atemwegsprobe bis zur Amplifikation und Quantifizierung des Zielbereichs zu erhalten. Die quantitative Leistungsfähigkeit des gesamten analytischen qRT-PCR-Verfahrens wurde anhand eines in diesem Diagramm dargestellten Genauigkeitsprofils bewertet und validiert. Die EHV2-Virusgenomlasten in 172 Nasenabstrichproben von Pferden mit Atemwegserkrankungen wurden wie hier gezeigt quantifiziert.Die Virusgenomlasten waren bei jungen Pferden höher, wobei die höchste Last mit 1,9 × 1011 Kopien pro Milliliter nachgewiesen wurde. Sobald die Technik beherrscht ist, kann jeder Amplifikationsschritt in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, und die gesamte Validierung kann bei korrekter Durchführung in weniger als vier Wochen abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Risiko einer Kontamination zu vermeiden, insbesondere beim Arbeiten mit einer Plasmidlösung.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Sequenzierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen wie die Genomidentifizierung zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Extraktion und Amplifikation von DNA durchgeführt und die resultierenden PCR-Produkte charakterisiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben wie Pathogenen äußerst gefährlich sein kann.Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten stets einige Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem Abzug und in einem Bereich mit angepasstem Sicherheitsniveau getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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