Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen

Unser Protokoll quantifiziert Adeno-assoziierte virale Vektoren in komplexen Matrices. Ein genauer Nachweis und eine genaue Quantifizierung sind für die Beurteilung ihrer Leistung in klinischen Studien unerlässlich. Dieses Protokoll zielt insbesondere darauf ab, die derzeitigen regulatorischen Lücken bei der Gestaltung von molekularen Studien zu schließen, die der guten Laborpraxis entsprechen.

Im Rahmen der Entwicklung viraler Vektoren verlangen die Regulierungsbehörden die Bewertung der Bioausscheidung von Vektoren. Die ddPCR ist eine vielversprechende Technologie für diese Bewertung, da sie eine genaue Quantifizierung ohne die Verwendung einer Standardkurve und eine verbesserte Sensitivität im Vergleich zur qPCR ermöglicht. Die genaue Quantifizierung in den komplexen Matrices, die in klinischen Umgebungen auftreten, wie z. B. Risse, kann aufgrund von PCR-Interferenz und -Hemmung schwierig zu validieren sein.

Begrenzte klinische Probenmengen können auch die Fähigkeit einschränken, seltene Ereignisse zu erkennen, wenn der Assay nicht empfindlich genug ist. Unser Ansatz entwickelt ein wiederholbares und anpassungsfähiges ddPCR-basiertes Framework zur Validierung von Assays für den Einsatz in regulierten Studien. Diese Methode vermeidet einen bestimmten DNA-Extraktionsschritt, ermöglicht eine effizientere Validierung und bietet klare Kriterien, anhand derer die Assay-Leistung bewertet werden kann, um Robustheit und Wiederholbarkeit zu gewährleisten.

Dieses Protokoll hat das Potenzial, auf jede Studie zur Ausscheidung viraler Vektoren angewendet zu werden, nicht nur auf den Nachweis von AAV in Tränen, wie hier vorgestellt. Es schafft einen robusten und wiederholbaren Rahmen, auf dem mehrere zweckmäßige, regulierte Programme entwickelt werden können.