Name: Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Lernen Sie die Herstellung hochwertiger CRISPR-Retroviren und Lentiviren für gezielte Gen-Knockouts im Mausgehirn. Diese stereotaktische Injektionsmethode ermöglicht effiziente Genomanipulationen ohne genetisch veränderte Tiere.

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Diese Arbeit wurde von der NINH unterstützt gewähren R01MH097949 und die Autism Speaks Pilot Grants 7359 zu BWL und der Norris Cotton Cancer Center Optical Imaging Geteilt Instrumentation Grants P30CA023108.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt einige wichtige Schritte, die wichtig für eine erfolgreiche virale Verpackungs sind. Zellgesundheit ist entscheidend vor und während der Transfektion, als ungesund Zellen wird die Menge des Virus produziert erheblich reduzieren. Wenn die Transfektionseffizienz und Verpackungs erfolgreich sind, dann werden 100% der Zellen sollte das Fluorophor exprimieren und die Zellen sollten eine funktionelle Syncytium bilden. In Schritt 3.2.4 wird das Rohr Klopfen notwendig hochtitrige Transfektion effizient, und der pH-Wert der HEPES-gepufferter Kochsalzlösung muß exakt sein. Die Maxi-Preps, die die Plasmide, die für die virale Verpackung produzieren muss extrem rein sein. Bis zu diesem Punkt ist es hilfreich, die endgültige DNA Elution zu Ethanol ausfällen und in Tris-EDTA-Puffer erneut suspendieren. Es ist auch sehr wichtig, die Menge an Serum zu 2% oder weniger in den Medien zu verringern, dass das Coffein an Tag 6 zugegeben wird (Schritt 3.4) vor viral Sammlung. Wenn das Serum nicht reduziert wird, dann ist die endgültige gereinigte Virus wird eine unerwünschte Menge an Serum enthalten protein. Die Verwendung von Polyethylenglykol 6000, wenn die viralen Partikel Ausfällen schließt die Notwendigkeit Ultrazentrifugation. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Cas9 CRISPR Viren enthalten typischerweise einen Titer etwa 10-fach weniger als Viren nur ein Fluorophor enthält. Für die Operation stereotaxische ermöglicht die Verwendung von inhalativen Anästhesie eine schnelle und präzise Kontrolle oder das Bewusstsein des Tieres im Vergleich zu injizierbaren Anästhetika und ermöglicht Anästhesie über einen größeren Altersbereich. Es ist sehr wichtig, dass die chirurgischen Instrumente sauber und steril zu halten und reproduzierbare Ausrichtung erfordert eine genaue Positionierung des Kopfes. Stellen Sie sicher, dass kein Nicken oder Rollen des Kopfes in der stereotaktischen Instrument ist und dass der Schädel fühlt sich fest an seinem Platz. Es kann sinnvoll sein, den Schädel zu ermöglichen, zu trocknen, um die Nähte zu finden, die Koordinaten stereotaxische zu bestimmen. Auch sollte die Rate und das Volumen für jeden werden stereotaktischen Koordinaten empirisch ermittelt. Diese Technik ist die Begrenzung, dass die Ausbreitung eines Retrovirus lenti- oder eingeschränkt ist, insbesondere im Vergleich zu den adeno-assoziierten Viren (AAV) .Daher Diese Viren sind wertvoll, wenn ein diskretes Hirnregion Infizieren, aber nicht für die Gesamt Infektion mit AAV für Verhaltensanalyse bei Tieren angewandt werden. Die Verwendung von Coffein in diesem Protokoll erhöht die Titer dieser Viren, aber sie sind immer noch nicht so hoch wie die in AAV Verpackung erreicht Titer. Auch die stabile Integration ist nur ein Vorteil von Fluorophor Ausdruck, als CRISPR / Cas9 stabile genomische Bearbeitungen sogar bildet, wenn transient und es ist möglich, dass die laufende Ausdruck des Cas9 und sgRNA kann schließlich Zielwirkungen ab. Die transiente Expression der CRISPR / Cas9 System mit AAV ausreichend genomische Veränderungen zu erzeugen, die im gesamten Zellteilungen propagiert werden, jedoch Fluorophore Ausdruck wird nicht aufrechterhalten werden. Erstellung von lenTi- und Retroviren die CRISPR / Cas9 System verwendet wird verleihen die Fähigkeit, jede neue Gen in einer Vielzahl von Organismen zu zielen. Die Effizienz des Gen-Bearbeitung wird in der Folge der Führungs RNA Targeting des Cas9 Spaltung abhängt. Es hat sich gezeigt, dass indels enthalten zwischen 10% und 80% der Klone empirisch bestimmt nach der Sequenzierung Neuro2A Zellen infiziert. Es ist derzeit nicht bekannt, ob indel Frequenzen berechnet in Neuro2A Zellen reflektiven von denen sind in Neuronen. Anleiten RNA-Design-Software wie Benchling umfassen nun einen &quot;on-target&quot; Punktzahl in der Lage sein kann, den Wirkungsgrad eines gegebenen Zielsequenz vorherzusagen. Inwieweit solche &quot;On-Target&quot; Scores sind zuverlässige Bedürfnisse empirisch in Neuronen und anderen Zelltypen als CRISPR-Cas9 System bestimmt werden wird breiter umgesetzt. Lentivirus-basierte transgenen Tierproduktion wurde mit Berichten variabel erfolgreich, dass die Lentivirus geliefert Transgene si gewordenlenced 11. CRISPR vermittelte Gen Bearbeitung von DNA kann durch die Keimbahn weitergegeben werden, um ganze Tiermodelle erzeugen. Somit können stabile genomische Bearbeitung trotz des Silencing von viralen Auslieferungs Fluorophore und Cas9 Transgene erreichbar sein. Dies kann eine effiziente Plattform für die gezielte genomische Veränderungen bieten. Die virale Lieferung des CRISPR / Cas9-System, während nicht transgenen Organismen erfordern, ist komplementär zu diesen Techniken. Zum Beispiel die Injektion solcher viralen Partikel in eine Verbindung transgenen Tier, das Cre und Cre induzierbar Transgene abhängige Opto- oder chemo genetischen Ausdruck sollten komplexe Studien über den Zusammenhang zwischen genetischen Manipulationen und neuronale Aktivität erleichtern. Ein zweites Beispiel ist diese Cas9 / sgRNA viralen Teilchen in eine bedingte knockout in einem Versuch, zu liefern, für die Gen-Gen-Interaktionen zu screenen. Schließlich ist eine weitere spannende Route dieser Forschung das Screening von Phänotypen und therapeutischen Verbindungen in Patienten gewonnenen Zellen, denenwerden verwendet, um genetische Netzwerke zu validieren und zu entdecken, die bei verschiedenen Erkrankungen gestört werden.

Auf der Grundlage einer normalen Physiologie und Krankheitspathologie untersuchen, besteht ein Bedarf an genau Genexpression in Modellorganismen manipulieren. Für Säugetiermodellorganismen, wird dies auf die Schaffung und Entwicklung von transgenen Mäusen weitgehend zentriert, wobei ein genetisches Element von Interesse von Websites durch eine Rekombinase erkannt flankiert wird. Dies kann in einer ortsspezifischen Manipulation dieser Gene flankiert führen. Zwar ist dies eine erfolgreiche Strategie gewesen ist, ist es an der Zeit und ressourcenintensiv; beispielsweise eine dreifache transgenes Tier zu schaffen, die eine floxed Gen, Cre-Rekombinase, und ein Cre-Reportergens erfordert mehrere Paarungen und Validierung ausdrücken würde. Im Gegensatz dazu , codierend die stereotaxische Injektion von replikationsdefekte virale Partikel ein fluoreszierendes Protein und das Rekombinase - Gen in ein floxed Tier erfordert keine komplexe Genotypisierung oder Zuchtstrategien 1. Wenn ein fluoreszierendes Protein und Cre exprimierenden Virus weiter ist mit einem zweiten Virus enco coinjiziertding ein anderes fluoreszierendes Protein, dann stellt dies eine Kontrolle im Gewebe für die gezielte genetische Manipulation. Während diese Strategie immer noch die Verwendung von Knock-in Tieren erfordert, viral vermittelter RNA basierte Strategien umgehen die Notwendigkeit für transgene Tiere. Zum Beispiel können stereotaktische Injektion von replikationsdefizienten Viren, die ein fluoreszierendes Protein und eine kurze haarnadel RNA (shRNA) kodieren verwenden die endogenen RNAi-Maschinerie der Zelle in einem starken Reduktion des Transkripts eines Gens von Interesse zu führen. Allerdings produzieren shRNA Strategien subtile Gen knock-downs oft zu bescheiden zellulären Phänotypen 2. Während ein knock-down physiologisch für heterozygote Gen Dysfunktion relevant mehr sein kann, die im Vergleich verringerte Robustheit zu einem Knock-out ist für phänotypische Entdeckung neuer Gene nicht ideal. Eine dritte Technik, die vor kurzem entstanden ist, die CRISPR (Clustered regelmäßig auf Abstand Short Palindromic Repeat) / Cas9 (CRISPR-assoziiertenProtein 9) System beruht auf der Expression von sowohl einer kleinen exogene RNA und DNA Schneid Enzyms. Das CRISPR / Cas9 System wurde aus dem prokaryotischen Immunsystem angepasst , die ein Verfahren zur Identifizierung von Fremd entwickelt, eindringende DNA von Viren und zum Abbau über die Cas9 Enzyms 3,4 - Targeting. Diese leistungsstarke Genom Schnitttechnik kann zur Erstellung von gezielten Deletionen, Insertionen und Mutationen verwendet werden; und das folgende Protokoll wird darlegen , wie Deletionen in einem Gen von Interesse zu machen , um seine Expression in vivo KO. Das Cas9 Enzym muss mit einer Führung RNA homolog zu der Region von Interesse und angrenzend an ein Gerüst RNA exprimiert werden. Knockout eines Gens unter Verwendung dieser Technik erfordert bei einer Stelle von Interesse Cas9 auf eine bestimmte Region im Genom unter Verwendung von synthetischen Führungs RNAs (sgRNA) und induziert Doppelstrangbrüche (DSBs) Targeting. Diese DSBs werden dann durch die endogene Zellreparaturmaschinerie über nicht-homologous end-joining (NHEJ), die le repariertAnzeige an indels , dass Mutationen Missense oder Unsinn erzeugen kann und somit einen Verlust von funktionellen Proteinexpression 5 erstellen. Da dieses System genomische Veränderungen produziert, es erfordert nur die transiente Expression des Cas9 und sgRNA. Jedoch ist es wünschenswert, eine stabile Fluoreszenzindikatorzellen und deren Nachkommen in dieser Weise manipuliert zu identifizieren. Lenti- und Retroviren haben den Vorteil der DNA von Interesse in die Wirtszellen stabil zu integrieren, die langfristigen Ausdruck erhalten und sind bis auf die Tochterzellen während der Mitose übergeben. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion und Herstellung von zwei Arten von replikationsdefekten, hohe Titer-Retroviren: das menschliche Immunschwäche-Virus abgeleitet lentivirale Partikel (Lentivirus) sowie auf Basis von murinen Maloney-Leukämie-Virus (Retrovirus). Während diese beiden Viren stabile Lage sind, unterstützen großer Transgene exprimieren, können die retroviralen Partikel nur in das Genom integrieren duRing Zellteilung mit dem Abbau der Kernhülle und kann daher als Werkzeug Zellen zu markieren und Geburtstermin 6 verwendet werden. Während Lentiviren für einen Ruf haben relativ niedrige Titer 7 ist, diese Methode, einschließlich der Verwendung von Coffein 8 während der viralen Sammlung produziert routinemßig Titern von 10 9 und 10 10 Partikel / ml. Ein weiterer Vorteil der lenti- und Retroviren ist die Toleranz für sehr große Einsätze. Die folgende Sammlung von Protokollen beschreibt das Verfahren für die lenti oder Retrovirus Gestaltung kodieren ein fluoreszierendes Reporter, sgRNAs und Cas9 das CRISPR / Cas9 System zu verwenden, DNA sowie exprimieren ein fluoreszierendes Protein zu modifizieren. Maus stereotaxische Neurochirurgie ist ein wertvolles Verfahren für Viren in vivo zu studieren Morphologie, Funktion und Konnektivität von infizierten Neuronen einzuspritzen. Virusinfektion in Neuronen können verwendet werden, um Expressionsspiegel über einen längeren Zeitraum von tim manipulierene, wie beispielsweise während der Entwicklung, und die Expression kann präzise durch die Verwendung von verschiedenen Arzneimittel induzierbare Systeme und spezifische Cre-Expression angetrieben gesteuert werden. Diese besondere Protokoll beschreibt, wie ein Virus zu injizieren eine sgRNA und Cas9 exprimieren im Gehirn eines erwachsenen Maus ein Gen von Interesse KO. Mäuse erholen sich sehr schnell von diesem Verfahren und die Expression des viralen Transgen kann innerhalb von 48 Stunden nach der Injektion zu sehen. Jedoch Fluorophor Ausdruck erscheint im Laufe von Wochen zu erhöhen, in einer nahezu maximalen Niveaus von 3 Wochen nach der Infektion resultiert. Mäuse, die virale stereotaktische Injektion unterziehen kann Verhalten, Elektrophysiologie oder morphologischen Untersuchungen verwendet werden. Insgesamt ist der Zweck dieser Verfahren zu demonstrieren, wie im erwachsenen Gehirn der Maus mit stereotaktischen Operation und ein Virus die Expression eines bestimmten sgRNA und Cas9 ein Gen Knockout.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Liste der Zellkulturreagenzien</td></tr><tr><td>293FT Zelllinie</td><td>Life Technologies</td><td>R700-07</td><td>Für die Lentivirus</td></tr><tr><td>293GP Zelllinie</td><td>Clontech</td><td>631458</td><td>Für Retrovirus</td></tr><tr><td>Iscove's Modifikation von DMEM (IMDM)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-016-CV</td><td>Vollständiges IMDM mit 10 % FBS, 1 % NEAA, 1 % L-Gln und&nbsp; 1 % P/S</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nichtessentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminlösung, 100x (L-Gln)</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pennicillin/Streptomycin-Lösung, 100x (P/S)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol 10&nbsp; cm Platte</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Liste der Transfektionsreagenzien</strong</td></tr><tr><td>>5&nbsp; ml Polystyrol-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C69-500</td><td>Herstellung einer 2,5 M Lösung in ddH2</td></tr><tr><td>O Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>BP2939-100</td><td></td></tr><tr><td>Zweibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>2x HEPES gepufferte Kochsalzlösung (HBS)</td><td></td><td></td><td>500 ml: 8,2 g NaCl, 5,95&nbsp; g HEPES, 0,106 g Na2HPO4, pH 7,01 (genau!)</td></tr><tr><td>Koffein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-5G</td><td></td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; M Spritzenvorsatz-Filtereinheit</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLGV033RS</tr><tr><td>0,45 &Mikro; M Spritzenvorsatz-Filtereinheit</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>60 cc L/L Spritze</td><td>Med-Vet International</td><td>MV60CCLL</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol&nbsp; &nbsp; 6000 (PEG 6000)</td><td>Millipore</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>(10x) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>Scientific AC41678-5000</td><td></td></tr><tr><td>Spender-Pferdeserum</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische Pipette</td><td>Fisher</td><td>Scientific 357551</td> Anti-GFP, <td></td></tr><tr><td>Kaninchen, 488 Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>A21311<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Stereotaktische Chirurgie Reagenzien</td></tr><tr><td>Vet-Spritze Tierarzt verwenden T.B. Spritze nur 1 cc Luer-Slip T.B. 100/bx</td><td>Med-Vet International</td><td>1CCVLS</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Skalpellklingen, #10, 100-pk</td><td>Med-Vet International</td><td>JOR580S</td><td></td></tr><tr><td>künstliche Tränensalbe</td><td>Med-Vet</td><td>International RXPARALUBE-O</td><td></td></tr><tr><td>PVP PrepSolution&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>HPIV108208H</td><td></td></tr><tr><td>normale Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>DYND500MLSH</td><td></td></tr><tr><td>Applikatoren mit Wattespitze</td><td>Med-Vet International</td><td>CTA6</td><td></td></tr><tr><td>Dreifache antibiotische Salbe&nbsp;</td><td>Med-Vet International</td><td>RXTRIP-OI15</td><td></td></tr><tr><td>MONOJECT&reg; Nadeln Soft Pack 25 g x 5/8"</td> <td>Med-Vet International</td><td>25058</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Seidennähte</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-711</td><td></td></tr></tbody></table>

planung, verpackung und lieferung von hohen titern crispr retro und lentiviren über stereotaktische injektion

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replikationsdefekte Lentiviren oder Retroviren sind in der Lage, Transgene stabil in das Genom einer infizierten Wirtszelle zu integrieren. Diese Technik wird häufig verwendet, um fluoreszierende Proteine, opto- oder chemogenetische Controller der Zellaktivität oder die heterologe Expression menschlicher Gene in Modellorganismen zu kodieren. Diese Viren wurden auch erfolgreich eingesetzt, um Rekombinasen an relevante Zielstellen in transgenen Tieren zu bringen oder sogar kleine Haarnadel- oder Mikro-RNAs zu liefern, um die Genexpression zu manipulieren. Diese Techniken haben sich zwar als fruchtbar erwiesen, beruhen aber auf transgenen Tieren (Rekombinasen) oder sind häufig nicht hochwirksam und spezifierbar (shRNA/miRNA). Im Gegensatz dazu verwendet das CRISPR/Cas-System eine exogene Cas-Nuklease, die über eine exogene Guide-RNA auf bestimmte Stellen im Genom eines Organismus abzielt, um doppelsträngige Brüche in der DNA zu induzieren. Diese Brüche werden dann durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) repariert, wodurch Insertions- und Deletionsmutationen (Indel) entstehen, die zu schädlichen Missense- oder Nonsense-Mutationen führen können. Dieses Manuskript enthält detaillierte Methoden für das Design, die Produktion, die Injektion und die Validierung einzelner Lenti/Retro-Viruspartikel, die Neuronen stabil transduzieren können, um einen fluoreszierenden Reporter, Cas9, und sgRNAs zu exprimieren, um Gene in einem Modellorganismus auszuschalten.

Nach dem &quot;Protokoll zur Auslegung eines Führer Strand (sgRNA) für CRISPR / Cas9 Retrovirus&quot;, Oligos eine bestimmte Zielsequenz eingefügt werden in die PXL Klonierungsvektor stromabwärts des HU6 Promotor und stromabwärts einer Führungs RNA Gerüst unter Verwendung der BbsI Klonierungsstellen (Abbildung 1, Schritt 1). Diese sgRNA wird dann aus PXL ausgeschnitten und in die pRubi Rückgrat eingefügt unter Verwendung der BstBI und PacI Seiten (1, Schritt 2). Schließlich cloniert weiteres sgRNA in PXL kann in pRubi-Guide1 (Abbildung 1, Schritt 3), Targeting einen anderen Bereich des Gens und die Erhöhung der Chancen eines knockout über NHEJ stromabwärts von der ersten Führung angeordnet werden. Die Überprüfung der korrekten Konstrukte sollten durch Sequenzanalyse bestimmt werden. Sobald dieses Konstrukt hergestellt wird, kann es zu einem Virus, das das &quot;Protokoll für Retro / Lentivirale Produktion- CaPO 4-Methode&quot; nach verpackt werden. Erfolgreiche Verpackung wird durch eine Infektion des Virus in HEK293-Zellen, um bestätigten die v titriertirus. Wenn es kein Fluorophor Ausdruck ist dann gab es wahrscheinlich ein Fehler bei der Verpackung des Virus. 2 ist ein repräsentatives Ergebnis von 2 - Retroviren, ein GFP exprimieren und das andere exprimierenden mCherry, koinjiziert in den Gyrus dentatus der neonatalen Maus (7 Tage alt) und abzubildenden 21 Tage nach der Injektion. Markierung von Neuronen mit mCherry oder GFP ermöglicht morphologische Beurteilung verschiedener genetischer Manipulationen in demselben Gewebe, wobei ein Virus einen CRISPR / Cas9 vermittelten KO und der andere ein Kontrollvirus exprimieren kann, exprimieren ausschließlich ein Fluorophor. Stereotaktische Injektion ermöglicht eine präzise anatomische Selektivität wie durch die diskrete Infektion der beabsichtigten Koordinaten gezeigt, Gyrus dentatus. Wenn Hirnschnitten für eine Infektion zu analysieren, ist es wichtig, das umgebende Gewebe zu halten, bis es, dass die korrekte anatomische Region bestimmt ist, infiziert war. Wenn es keine Anzeichen einer Infektion ist, dann ist es möglich, dass die Injektion erfolgte in einer benachbarten Region eind können in den umliegenden Abschnitte identifiziert werden. Es kann auch hilfreich sein, die Nadelbahn zu finden, die genaue Injektionsbereich zu finden. VSVg pseudotypisierten Viren aus den Rändern des Gyrus dentatus selten verteilt , wenn sie in vivo injiziert werden , und neigen dazu , entlang der rostral / kaudal Achse infizierenden Zellen entlang der gesamten Gyrus dentatus zu verteilen, wie es durch 3D - Rekonstruktion analysiert (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig1.jpg" /> Abb . 1: Klonierungsstrategie für die retroviralen pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR Plasmid Diese Strategie ist identisch für die FU-basierten lentiviralen Plasmide. sgRNA Oligos sind geglüht und eingefügt in PXL die Klonierungsstellen BsbI verwenden. Nach der Sequenzierung , um sicherzustellen , dass der sgRNA erfolgreich in PXL eingeführt wird, verdauen das Plasmid mit BstBI und PacI. Der Einsatz, der fallen gelassen wird aus (Black Box) wird dann in das virale zurück b geklonteine (schwarze gepunktete Linien) pRubi-Guide1 CRISPR. Ein zweiter sgRNA kann auch in PXL eingeführt werden und verdaut , um die PacI Enzym verwendet. Diese wird dann in den CRISPR Vektor pRubi-Guide1 geklont (rot gestrichelte Linien) die PacI - Stelle mit. Das resultierende Plasmid enthält dann beide Führungsstränge sowie die notwendigen viralen Elemente, Förderer und Fluorophore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/53783fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig2.jpg" /> Fig . 2: Retrovirale Injektion der Maus Gyrus dentatus exprimierenden Retroviren mCherry (rot) oder GFP (grün) wurden in den Gyrus dentatus einer p7 Maus injiziert. 21 Tage später wurden die Mäuse perfundiert und die Gehirne geschnitten und gefärbt für GFP und mCherry. (A) Ein 5 - fach Weitfeld - Fluoreszenzbild zeigt die prNTSCHEIDUNG der dentatus Injektion Gyrus und die Spezifität des Gyrus dentatus Körner Kennzeichnung Neuronen. Die Morphologie des Hippocampus kann über die Dapi (blau) Färbung sichtbar. Maßstabsbalken misst 200 um. (B) Ein 10fach Weitfeld - Fluoreszenzbild zeigt , dass diese hohen Titer Lentiviren eine große Anzahl von Zellen , deren Morphologie infizieren kann über Fluorophor Ausdruck zugegriffen werden. Maßstabsbalken misst 100 &amp; mgr; m. (C) Viren GFP oder mCherry exprimieren , wurden Co-Injections in die Gyrus dentatus. Mit einem System von Retroviren, kann man ein Virus verwenden, um eine genetische Manipulation von GFP markiert machen und eine andere Manipulation durch mCherry markiert, und dann einzelne oder additive Änderungen beurteilen aufgrund jedes Virus. Maßstabsbalken misst 10 &amp; mgr; m. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53783/53783fig3.jpg" /> Abb . 3: Anatomische Ausbreitung von lentiviralen Injektion Stereotaktische Koinjektion<html> eines GFP-shPten Virus und einem mCherry Kontrollvirus in das Gehirn eines Erwachsenen Pten loxP / + Maus führte zu einer Ausbreitung des Virus entlang der gesamten rostral / Schwanzachse des Gyrus dentatus des Hippocampus. Dies wird in einer 3D - Rekonstruktion des Ausmaßes der Injektion gezeigt , in dem geschlossene Konturen der viralen Ausbreitung über 21 serielle Abschnitte zurückgeführt wurden (Z = 50 &amp; mgr; m / section) unter Verwendung von Rekonstruktionssoftware. Die Konturzeichnungen wurden dann ausgerichtet, die 3D-Bilder für die Volumen Quantifizierung zu erzeugen. Insgesamt virale Verbreitung ist in grün (Volumen = 54730800 &amp; mgr; m 3) und gezähnt lokalisierte Ausbreitung wird gezeigt in lila (Volumen = 27275200 &amp; mgr; m 3). Das Virus breitet sich entlang der Nadelbahn und das Corpus callosum an der Kreuzung der Nadelbahn zusätzlich die rostral / Schwanzachse des Gyrus dentatus zu füllen. Maßstabsbalken misst 200 um. les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg &quot;/&gt; Supplemental Video 1. Design von sgRNAs retroviralen und lentiviralen Rückgrat zu klonen in. In dieser Syntheseführung RNA (sgRNA) Ausführungsbeispiel wird die genomische Sequenz von Maus CHD8 von NCBI heruntergeladen. Das Startcodon und Exon-Struktur werden dann in Vector NTI visualisiert. Dies ermöglicht es uns, die genomische Region um das erste Codierexon zu kopieren und diese Sequenz in Benchling eingeben. Benchling ermöglicht es uns, alle potentiellen sgRNAs in der Region zu visualisieren. Ferner wird nach der genomischen Region angibt, wir Eingang haben, zeigen Benchling wird uns die On-Target und Off-Target-Scores für jede Führungs RNA. Der Benutzer kann dann wählen Sie die Führung RNA mit den höchsten On- und Off-Target - Scores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53783/Benchling_GuideRNA_Design.mp4" target="_blank">.)</a>

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Forschern die Möglichkeit zu geben, Viren zu konstruieren und zu verpacken, die ein fluoreszierendes Protein, CAS9 und sgRNAs exprimieren, und diese anschließend stereotaktisch in das Maushirn zu injizieren. Diese Methode kann helfen, spezifische Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise zur Rolle von Genen, die neurologischen und neurodevelopmentellen Störungen zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass gezielt bestimmte Gene manipuliert werden können, ohne den zeitaufwändigen und ressourcenintensiven Prozess der Erzeugung genetisch veränderter Tiere durchlaufen zu müssen.Bevor die Zellen vorbereitet werden, verwenden Sie eine Website, um einen 20 Nukleotide langen Leitstrang oder sgRNA zu generieren, der zur Konstruktion einzelsträngiger Oligos verwendet wird. Nachdem die Oligos bestellt und zur Herstellung eines endgültigen Plasmids gemäß dem schriftlichen Protokoll verwendet wurden, pipettieren Sie alle aufgetauten Zellen aus einer Kryoröhre in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Geben Sie anschließend 2 Milliliter vorgewärmtes, CO2-äquilibriertes vollständiges IMDM hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen danach fünf Minuten bei 500 × g. Entfernen Sie im Anschluss den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter vollständigem IMDM. Säen Sie die Zellen in eine 10 cm große Zellkulturschale aus und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator. 24 Stunden nach der Aussaat wechseln Sie das Medium, indem Sie das vorhandene Medium absaugen und 10 Milliliter vorgewärmtes IMDM hinzufügen. Teilen Sie die Zellen, sobald sie konfluent sind. Um die Zellen zu teilen, saugen Sie das Medium ab und waschen die Schale mit 5 Milliliter PBS. Geben Sie dann 1 Milliliter 0,25 %iger Trypsin zur Schale hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C, bis sich die Zellen von der Schale lösen.Im Anschluss 0,5 Milliliter IMDM hinzufügen, um die Trypsinreaktion zu neutralisieren, und die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pipettieren. Danach die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Die Zellen in einem Milliliter IMDM resuspendieren und 10 Mikroliter Zellen in 90 Mikroliter PBS verdünnen.Zählen Sie die Zellen entweder mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und impfen Sie die Zellen erneut mit komplettem IMDM aus. Am fünften Tag wechseln Sie das Medium zwei Stunden vor der Transfektion und stellen Sie sicher, dass sich genau 10 Milliliter Medium in der 10-Zentimeter-Platte befinden. Bereiten Sie anschließend die Transfektionsreagenzien für zwei Schalen unter Verwendung von zwei 5-Milliliter-Rundbodenzentrifugenröhrchen aus Polystyrol vor. Beschriften Sie das erste Röhrchen als DNA und das zweite Röhrchen als 2X HBS. Anschließend stellen Sie die DNA-Konzentration auf ein Mikrogramm pro Mikroliter in Tris-EDTA bei pH 7,4 ein. Um Transfektionsreagenzien für Lentiviren und Retroviren herzustellen, fügen Sie die erforderlichen Bestandteile langsam dem als DNA beschrifteten Röhrchen hinzu, während Sie kontinuierlich auf das Röhrchen klopfen, um eine Vermischung zu gewährleisten. Danach geben Sie ein Milliliter 2X HBS in das als 2X HBS beschriftete Röhrchen. Anschließend fügen Sie langsam ein Milliliter des Inhalts aus dem DNA-Röhrchen tropfenweise, einen Tropfen nach dem anderen, dem 2X HBS-Röhrchen hinzu. Klopfen Sie dabei kontinuierlich auf das 2X HBS-Röhrchen und beobachten Sie die nach jedem Tropfen entstehende Calciumphosphat-Fällung, um die erfolgreiche Bildung der Transfektionskomplexe sicherzustellen. Inkubieren Sie danach das Röhrchen 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach 30 Minuten geben Sie ein Milliliter des Transfektionsreagenz langsam tropfenweise auf jede 10-Zentimeter-Zellkulturplatte und inkubieren die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius.Wechseln Sie das Medium am sechsten Tag.Am siebten Tag überführen Sie das Medium, das virale Partikel enthält, mit einer 10-Milliliter-Serologiepipette in ein 50-Milliliter-Konischglas und lagern es bei vier Grad Celsius. Geben Sie anschließend acht Milliliter des 0,5 %igen FBS-Mediums in jede Zellkulturplatte. Am achten Tag sammeln Sie das Zellkulturmedium, das virale Partikel enthält, und vereinigen es mit der Ernte des Vortags in dem 50-Milliliter-Konischgefäß. Zentrifugieren Sie in diesem Schritt das virale Überstandsgemisch bei 2000 × g für 10 Minuten. Danach reinigen Sie das virale Medium, indem Sie es durch einen 0,45-Mikrometer-Spritzenfilter mit geringer Proteinbindung filtrieren. Fügen Sie anschließend 5X-Polyethylenglykol-6000-Lösung zum Medium hinzu. Invertieren Sie das Röhrchen mehrmals, um es zu mischen. Inkubieren Sie dann das virale Gemisch bei vier Grad Celsius für mindestens 12 Stunden.Am neunten Tag die Virusmischung bei 2500 × g für 45 Minuten zentrifugieren. Nach 45 Minuten das Überstand entfernen und erneut für zwei Minuten zentrifugieren. Danach erneut den Überstand entfernen. Anschließend das Pellet durch Zugabe von 320 µL steriler PBS resuspendieren und 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubieren. Am nächsten Tag das Virus aliquotieren und die Aliquots bei −80 °C einfrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, rasieren Sie den Kopf einer anesthetisierten Maus, um die Injektionsstelle vorzubereiten. Leiten Sie 4 % Isofluran in die Nasenkappe. Platzieren Sie anschließend die Maus im stereotaktischen Instrument. Führen Sie die Bissstange in den Mund ein, bis die Zähne in den Schlitz rutschen, bevor Sie die Ohrstifte fixieren. Stellen Sie sicher, dass sich der Körper des Tieres auf der Heizplatte befindet und die Nase in der Nasenkappe sitzt.Als Nächstes bestätigen Sie die Anästhesie durch einen Fußquetschtest. Tragen Sie anschließend künstliche Tränen zur Befeuchtung der Augen auf. Wischen Sie danach den rasierten Kopf mit Povidon-Iod und Lidocain ab.Nun einen kleinen Einschnitt entlang der mittigen Kopfhautlinie vornehmen. Den Schädel mit einem Tupfer trocknen und Wasserstoffperoxid auftragen, um die Bregma besser sichtbar zu machen. Mithilfe eines Stereomikroskops die Bregma am Schädel lokalisieren und den Bohrer darüber positionieren.Stellen Sie die digitalen stereotaktischen Koordinaten der X-, Y- und Z-Ebene auf null ein. Um sicherzustellen, dass der Kopf entlang der rostral-kaudalen Y-Achse ausgerichtet ist, platzieren Sie das Bohrgerät auf Lambda und richten Sie den Kopf so aus, dass die Z-Koordinate an Bregma und Lambda ungefähr null beträgt. Um sicherzustellen, dass der Kopf entlang der X-Achse ausgerichtet ist, platzieren Sie das Bohrgerät auf dem Mittelpunkt zwischen Bregma und Lambda und messen Sie die Z-Koordinaten jeweils ein Millimeter seitlich vom Mittelpunkt auf beiden Seiten, um sicherzustellen, dass diese übereinstimmen.Verringern Sie anschließend die Isoflurankonzentration auf 2 %, bevor Sie den Bohrer über die gewünschten Koordinaten bringen und vorsichtig durch den Schädel bohren. Nachdem alle Löcher gebohrt wurden, befestigen Sie die mit Virus gefüllte Spritze am stereotaktischen Instrument. Zentrieren Sie die Spritze über dem Loch und stellen Sie die Z-Koordinate am Schädel auf null. Senken Sie die Spritze langsam bis zur tiefsten Z-Tiefe ab und beginnen Sie die Injektion mit einer Rate von 0,25 Mikrolitern pro Minute unter Verwendung eines stereotaktischen Injektors. Sobald die Injektion auf der tiefsten Z-Tiefe abgeschlossen ist, warten Sie eine Minute, bevor Sie die Spritze zur nächsten Koordinate anheben und die Injektion erneut beginnen. Setzen Sie dieses Muster fort, bis alle Z-Injektionskoordinaten injiziert wurden.Nach der letzten Injektion zwei Minuten warten, bevor die Spritze entfernt wird. Anschließend das Maus entfernen, das im stereotaktischen Instrument befestigt ist, und die Kopfhaut nähen. Lokalanästhetikum und antibakterielle Creme auf die Operationsstelle auftragen und Schmerzmittel verabreichen, bevor das Tier in eine beheizte Erholungskammer transferiert wird.Dieses fluoreszierende Weitfeldbild mit 10facher Vergrößerung zeigt, dass Retroviren mit hoher Titerzahl eine große Anzahl von Zellen infizieren, deren Morphologie über die Expression von Fluorophoren beurteilt werden kann. In diesem Beispiel wurden Viren, die GFP oder mCherry exprimieren, gemeinsam in den Gyrus dentatus injiziert. Mithilfe eines Retrovirus-Systems kann ein Virus verwendet werden, um eine genetische Modifikation, die durch GFP markiert ist, und eine weitere Modifikation, die durch mCherry markiert ist, vorzunehmen, und anschließend die einzelnen oder additiven Veränderungen, die auf jedes Virus zurückzuführen sind, analysieren.Dies ist eine 3D-Rekonstruktion des Injektionsumfangs, bei der geschlossene Konturen der viralen Ausbreitung über 21 serielle Schnitte verfolgt wurden. Die Konturen wurden anschließend ausgerichtet, um 3D-Bilder zur Volumenquantifizierung zu erzeugen. Die gesamte virale Ausbreitung ist grün dargestellt, die auf das Dentatgebiet beschränkte Ausbreitung ist lila dargestellt. Auf diesem Bild ist die Ausbreitung des Virus entlang der Nadelbahn und des Balkens sowie entlang der rostral-kaudalen Achse des Dentatgyrus zu sehen. Nach der in-vivo-Virusinjektion verwenden wir andere Methoden wie Histologie, Elektrophysiologie oder Live-Zweifachmikroskopie, um die Auswirkungen der genetischen Manipulation auf die neuronale Entwicklung zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Controlling und Analyse von neuronalen...

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Lentivirale Expressionsvektoren sind die wirksamsten Fahrzeuge für verschiedene stabil exprimieren Effektormoleküle oder Reporter-Konstrukte in Teilen auch sich nicht teilende Säugerzellen und ganzen Organismen. Hier stellen ein Protokoll, wie lentivector Expressionskonstrukte in pseudoviral Teilchen zu verpacken und Zielzellen unter Verwendung der pseudoviral Teilchen zu transduzieren.

Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Quelle: Chen, S., et al., Stereotaxische Chirurgie zur genetischen Manipulation in striatalen Zellen von Neugeborenen-Mausgehirnen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines viralen Vektors, der für Cre-Rekombinase und grünes Fluoreszenzprotein (GFP) kodiert, in das Striatum eines genetisch veränderten Maus-Welpen, um eine Genmanipulation zu erreichen, indem eine loxP-flankierte STOP-Kassette herausgeschnitten und das rote Fluoreszenzprotein oder RFP als Reporter...

Stereotaktische Mikroinjektion eines viralen Vektors zur Genmanipulation in einem Striatum eines Maus-Jungtiers

Quelle: Pereira, M. et. al., In vivo direkte Reprogrammierung von residenten Gliazellen in Interneuronen durch intrazerebrale Injektion viraler Vektoren. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines Adeno-assoziierten Virus in die Großhirnrinde einer transgenen Maus, um Cre-abhängige neuronale Reprogrammierung und fluoreszierende Reportergene in Gliazellen zu bringen.

Stereotaktische Injektion von viralen Vektoren für die Reprogrammierung von Gliazellen in einem Mausmodell

Quelle: Fricano-Kugler, C. J., et al. Design, Verpackung und Verabreichung von CRISPR-Retro- und Lentiviren mit hohem Titer durch stereotaktische Injektion. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die stereotaktische Virusinjektion zur präzisen neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen. Das Protokoll gewährleistet eine genaue Virusabgabe an den Gyrus dentatus und ermöglicht die Fluoreszenzmarkierung und den CRISPR-vermittelten Gen-Knockout, um neuronale Schaltkreise, Genfunktionen und...

Stereotaktische Virusinjektion zur gezielten neuronalen Geneditierung im Gehirn von Mäusen

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Stereotaktische Injektion von Lentiviren ausdrücken cDNAs oder shRNAs die Genexpression in spezifischen Hirnarealen von Mäusen zu modulieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur stereotaktischen Injektionen mit Verhaltensaufgaben, wie der Open Field Test (OFT) und Forced Swim Test (FST) zu kombinieren.

Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Polyglutamin spinocerebellare Ataxien werden durch CAG-Expansionen verursacht, die aggregationsanfällige Proteine erzeugen. Dieses Protokoll beschreibt die Vektorproduktion, die stereotaxische Abgabe sowie die Analyse von Einschlüssen und neuronalem Markerverlust und bietet eine kontrollierte Plattform, um Mechanismen zu untersuchen und gezielte Therapien für neurodegenerative Erkrankungen zu evaluieren.

Lentiviral-induzierte striatale Pathologie als präklinisches Modell der polyglutamin-spinocerebellären Ataxie

Lernen Sie die Herstellung hochwertiger CRISPR-Retroviren und Lentiviren für gezielte Gen-Knockouts im Mausgehirn. Diese stereotaktische Injektionsmethode ermöglicht effiziente Genomanipulationen ohne genetisch veränderte Tiere.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

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