Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Forscher in die Lage zu versetzen, Viren zu entwerfen und zu verpacken, die ein fluoreszierendes Protein, CAS9 und sgRNAs, exprimieren, und sie dann stereotaktisch in das Gehirn von Mäusen zu injizieren. Diese Methode kann helfen, spezifische Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Rolle von Genen, die neurologischen und neurologischen Entwicklungsstörungen zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, bestimmte Gene zu manipulieren, ohne den zeit- und ressourcenintensiven Prozess der Erzeugung gentechnisch veränderter Tiere.

Bevor Sie die Zellen vorbereiten, verwenden Sie eine Website, um einen 20-Nukleotid-Leitstrang oder eine sgRNA zu generieren, die zum Design einzelsträngiger Oligos verwendet wird. Nachdem Sie Oligos bestellt und diese zur Herstellung eines endgültigen Plasmids verwendet haben, wie im Textprotokoll beschrieben, fahren Sie fort, indem Sie alle th-od-Zellen aus einem Kryoröhrchen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen pipettieren. Fügen Sie als nächstes 2 Milliliter vorgewärmtes CO2 hinzu, das vollständig IMDM ausgleicht.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang bei 500-facher G.Danach aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in 10 Millilitern vollständiger IMDM. Legen Sie die Zellen auf eine 10 cm große Zellkulturschale und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Wechseln Sie 24 Stunden nach dem Plattieren das Medium, indem Sie das vorhandene Medium ansaugen und 10 Milliliter vorgewärmtes IMDM hinzufügen.

Teilen Sie die Zellen, sobald sie zusammenfließen. Um die Zellen zu teilen, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Platte mit 5 Millilitern PBS. Geben Sie dann einen Milliliter 0,25%Trypsin auf die Platte und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen von der Platte abheben.

Fügen Sie anschließend 0,5 Milliliter IMDM hinzu, um die Trypsinreaktion zu neutralisieren, und pipettieren Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang mit dem 500-fachen G. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter IMDM und verdünnen Sie 10 Mikroliter Zellen in 90 Mikrolitern PBS.

Zählen Sie die Zellen entweder mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und beschichten Sie die Zellen mit vollständigem IMDM. Wechseln Sie am fünften Tag das Medium zwei Stunden vor der Transfektion und stellen Sie sicher, dass sich genau 10 Milliliter des Mediums in der 10-Zentimeter-Platte befinden. Bereiten Sie als Nächstes die Transfektionsreagenzien für zwei Disshes vor, indem Sie zwei Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden verwenden.

Markieren Sie das erste Röhrchen als DNA und das zweite Röhrchen als 2X HBS. Stellen Sie dann die DNA-Konzentration auf ein Mikrogramm pro Mikroliter in Tris EDTA bei PH 7,4 ein. Um Transfektionsreagenzien für Lentiviren und Retroviren herzustellen, fügen Sie langsam die erforderlichen Komponenten zu dem mit dem Röhrchen markierten DNA hinzu, während Sie kontinuierlich auf das Röhrchen klopfen, um es zu mischen.

Geben Sie danach einen Milliliter 2X HBS in das Röhrchen mit der Aufschrift 2X HBS. Geben Sie dann langsam einen Milliliter des Inhalts aus dem DNA-Röhrchen in das 2X HBS-Röhrchen, Tropfen für Tropfen. Klopfen Sie kontinuierlich auf das 2X HBS-Röhrchen und beobachten Sie, wie sich nach jedem Tropfen Calciumphosphatfällungen bilden, um eine erfolgreiche Bildung der Transfektionskomplexe zu gewährleisten.

Anschließend wird das Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Geben Sie nach 30 Minuten einen Milliliter des Transfektionsreagenzes in langsamen Tröpfchen auf jede 10 Zentimeter große Zellplatte und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie die Medien am sechsten Tag.

Am siebten Tag wird das Medium mit den Viruspartikeln mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt, bevor es bei vier Grad Celsius gelagert wird. Geben Sie dann acht Milliliter des 0,5%FBS-Mediums auf jede Zellplatte. Sammeln Sie am achten Tag die Zellmedien mit Viruspartikeln und kombinieren Sie sie mit der Ernte vom Vortag in der konischen 50-Milliliter-Tube.

In diesem Schritt zentrifugieren Sie den Virusüberstand bei 2000 mal G für 10 Minuten. Reinigen Sie anschließend das virale Medium, indem Sie es durch einen 0,45 Mikrometer großen Spritzenvorsatzfilter mit geringer Proteinbindung filtrieren. Geben Sie anschließend 5X Polyethylenglykol 6000-Lösung zu dem Medium.

Drehen Sie das Rohr zum Mischen mehrmals um. Dann inkubieren Sie das Virusgemisch mindestens 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie das Virusgemisch am neunten Tag 45 Minuten lang bei 2500 mal G.

Nach 45 Minuten den Überstand ablegen und erneut zwei Minuten lang drehen. Gefolgt von der erneuten Entfernung des Überstands. Anschließend wird das Pellet durch Zugabe von 320 Mikrolitern sterilem PBS resuspendiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert.

Am nächsten Tag aliquotieren Sie das Virus und frieren die Aliquote bei minus 80 Grad Celsius ein. Um diesen Vorgang zu beginnen, rasieren Sie den Kopf einer anästhesierten Maus, um sich auf die Injektionsstelle vorzubereiten. Leiten Sie 4% Isofluran in den Nasenkonus.

Platzieren Sie dann die Maus in das stereotaktische Instrument. Führen Sie die Beißstange in den Mund ein, bis die Zähne in den Schlitz fallen, bevor Sie die Ohrstangen befestigen. Stellen Sie sicher, dass sich der Körper des Tieres auf dem Heizkissen befindet und sich die Nase im Nasenkegel befindet.

Bestätigen Sie anschließend die Anästhesie, indem Sie den Fuß kneifen. Tragen Sie dann künstliche Tränen auf, um die Augen zu befeuchten. Anschließend den rasierten Kopf mit Povidon, Jod und Lidocain abtupfen.

Machen Sie nun einen kleinen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut. Trocknen Sie den Schädel mit einem Tupfer ab und tragen Sie Wasserstoffperoxid auf, um das Bregma sichtbar zu machen. Lokalisieren Sie das Bregma mit einem Präparierfernrohr auf dem Schädel und platzieren Sie den Bohrer darüber.

Legen Sie die digitalen stereotaktischen Koordinaten der X-, Y- und Z-Ebenen auf Null fest. Um sicherzustellen, dass der Kopf auf der rostralen kaudalen Y-Achse nivelliert ist, platzieren Sie den Bohrer auf Lambda und richten Sie den Kopf so aus, dass die Z-Koordinate bei Bregma und Lambda ungefähr gleich Null ist. Um sicherzustellen, dass der Kopf entlang der X-Achse nivelliert ist, platzieren Sie den Bohrer auf dem Mittelpunkt zwischen Bregma und Lambda und messen Sie die Z-Koordinaten auf beiden Seiten einen Millimeter vom Mittelpunkt entfernt, um sicherzustellen, dass sie gleich sind.

Senken Sie anschließend den Isofluran auf 2%, bevor Sie den Bohrer über die gewünschten Koordinaten setzen und vorsichtig durch den Schädel bohren. Nachdem Sie alle Löcher gebohrt haben, befestigen Sie die mit Viren gefüllte Spritze auf dem stereotaktischen Instrument. Zentrieren Sie die Spritze über dem Loch und setzen Sie die Z-Koordinate am Schädel auf Null.

Senken Sie die Spritze langsam auf die tiefste Z-Tiefe ab und beginnen Sie mit der Injektion mit einer Geschwindigkeit von 0,25 Mikrolitern pro Minute unter Verwendung eines stereotaktischen Injektors. Nachdem die Injektion in der tiefsten Z-Tiefe abgeschlossen ist, warten Sie eine Minute, bevor Sie sie auf die nächste Koordinate anheben, und beginnen Sie erneut mit der Injektion. Fahren Sie mit diesem Muster fort, bis alle Z-Injektionskoordinaten injiziert sind.

Warten Sie nach der letzten Injektion zwei Minuten, bevor Sie die Spritze entfernen. Entfernen Sie dann die Maus aus dem stereotaktischen Instrument und nähen Sie die Kopfhaut. Tragen Sie Lidocain und antibakterielle Creme auf die Operationsstelle auf und verabreichen Sie Schmerzmittel, bevor Sie das Tier in eine beheizte Aufwachkammer bringen.

Dieses 10-fache Weitfeld-Fluoreszenzbild zeigte, dass die Retroviren mit hohen Titern eine große Anzahl von Zellen infizieren, deren Morphologie über die Fluorophorexpression beurteilt werden kann. In diesem Beispiel wurden Viren, die GFP oder mCherry exprimieren, in den Gyrus dentatus coinjiziert. Mit einem System von Retroviren kann man ein Virus verwenden, um eine genetische Manipulation durchzuführen, die durch GFP markiert ist, und eine andere, die mit mCHerry markiert ist, und dann die einzelnen oder additiven Veränderungen zu bewerten, die auf jedes Virus zurückzuführen sind.

Dabei handelt es sich um eine 3D-Rekonstruktion des Injektionsausmaßes, in der geschlossene Konturen der Virusausbreitung über 21 serielle Schnitte verfolgt wurden. Die Konturzeichnungen wurden dann ausgerichtet, um 3D-Bilder für die Volumenquantifizierung zu erzeugen. Die gesamte Virusausbreitung ist grün und die dendatierte lokalisierte Ausbreitung violett dargestellt.

Dieses Bild zeigt, wie sich das Virus entlang der Nadelspur und des Corpus callosum ausbreitet und zusätzlich die rostrale kaudale Achse des Gyrus dentatus ausfüllt. Nach der in vivo Virusinjektion verwenden wir andere Methoden wie Histologie, Elektrophysiologie oder Live Twofold on Mikroskopie, um die Auswirkungen der genetischen Manipulation auf die neuronale Entwicklung zu untersuchen.