Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum über A Transcleral dorsalen Zugang

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, eine neuartige subretinale Injektionstechnik zu beschreiben, die verwendet werden kann, um virale Vektoren, pharmakologische Wirkstoffe oder pluripotente Stammzellen in den subretinalen Raum bei Mäusen zu induzieren. Diese Methode kann Schlüsselfragen in den Bereichen Sehwissenschaft und Ophthalmologie beantworten, wie z. B. die Beurteilung der Wirksamkeit neuartiger therapeutischer Interventionen bei Netzhautdegenerationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um Material in den subretinalen Raum zu bringen, mit hoher Wirksamkeit, minimaler Schädigung und schneller Wiederherstellung der Netzhautstruktur und -funktion.

Sachin P., ein Techniker aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Um diesen Vorgang zu starten, schneiden Sie die Schnurrhaare einer betäubten Maus ab, um die Visualisierung zu erleichtern, und halten Sie die Körpertemperatur des Tieres mit einem zirkulierenden Wasserkissen auf 37 Grad Celsius. Als nächstes erweitern Sie die Pupillen mit 2,5%igen Phenylephrin-Augentropfen.

Tragen Sie dann Methylcellulose-Augentropfen auf, um Trockenheit zu verhindern und anästhesieinduzierte vorübergehende Katarakte zu minimieren. Sterilisieren Sie die Instrumente vor der Operation. Bereiten Sie anschließend das verdünnte Fluorescein in einer Biosicherheitswerkbank vor.

Füllen Sie die Spritze mit der entsprechenden Menge Fluorescein. Führen Sie dann eine Zehenkneifung durch, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt ist, und positionieren Sie die Maus so, dass das zu injizierende Auge nach oben zeigt und im Präpariermikroskop deutlich sichtbar ist. Kneifen Sie die Schläfenbindehaut vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze zusammen.

Machen Sie dann mit der gebogenen Vannas-Schere einen Umfangsschnitt von etwa 90 Grad. Wiederholen Sie den Vorgang an der darunter liegenden Zapfenkapsel. Danach resezieren Sie das umgebende Bindeglied mit einer Pinzette mit feiner Spitze, während Sie den Globus nasal drehen.

Arbeiten Sie sich in einem Abstand von etwa 0,5 Millimetern zum Sehnerv auf die Injektionsstelle vor und achten Sie sehr darauf, dass der Sinus retroorbitalis nicht gestört wird. Ein kritischer Schritt ist die Freilegung der Injektionsstelle, die eine Drehung des Auges erfordert, ohne das Auge selbst oder die damit verbundenen Strukturen zu beschädigen, insbesondere um eine Schädigung des orbitalen Blutsacks zu vermeiden. Machen Sie bei diesem Verfahren einen kleinen Schnitt an der Sklera der Injektionsstelle, indem Sie die Augenmuschel vorsichtig mit einer 22,5 Grad starken Augenklinge zerkratzen.

Dieser Schnitt sollte gerade groß genug sein, damit die Spitze der Nadel durch die Sklera hindurchdringen kann. Führen Sie anschließend die abgeschrägte 33-Gauge-Nadel mit der Abschrägung nach oben und parallel zur Netzhaut abgewinkelt in die Sklelotomie ein. Injizieren Sie die gewünschte Menge 0,01 % Fluorescein, indem Sie den Kolben langsam und gleichmäßig drücken.

Beachten Sie, dass, wenn sich die Nadel im subretinalen Raum befindet, beim Drücken des Kolbens ein leichter Widerstand zu spüren ist. Es gibt keinen Widerstand, wenn die Nadel die Netzhaut durchsticht, aber einen hohen Widerstand, wenn die Nadel nicht in die Sklera oder RPE eindringt. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Injektion in den subretinalen Raum.

Dies muss erreicht werden, ohne durch die neurosensorische Netzhaut in die Glaskörperhöhle einzudringen. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel zurückziehen, um einen Rückfluss zu minimieren. Spülen Sie anschließend das Auge mit steriler Kochsalzlösung und stellen Sie sicher, dass sich das Auge wieder in seine normale Position gedreht hat.

Tragen Sie dann eine dicke Schicht dreifacher antibiotischer Augencreme auf die Hornhautoberfläche des injizierten Auges auf. Setzen Sie die Maus anschließend zur Bergung in einen sauberen Einzelkäfig. Überwachen Sie seine Atmung und Temperatur während der Wiederherstellung der Anästhesie und überprüfen Sie, ob es die sternale Liege aufrechterhalten kann.

Führen Sie zusätzliche geeignete postoperative Überwachungen und Behandlungen durch, einschließlich einer subkutanen Injektion von Carprofen, zur postoperativen Schmerzbehandlung. Hier ist eine 3D-Rekonstruktion der kuppelförmigen Blase an der Injektionsstelle. Die kuppelförmige Blase wird dann mit dichtem Weiß gefüllt, um das Ausmaß und die Ränder der Netzhautablösung zu zeigen.

Netzhautquerschnitte aus dem OCT sind in Weiß zu sehen, während der flüssigkeitsgefüllte Raum auf Höhe des RPE und der Photorezeptoren schwarz erscheint. Und in dieser Abbildung sind die repräsentativen OCTB-Scans an der Stelle der maximalen Netzhautablösung für die Zeit vor der Injektion, 10 Minuten nach der Injektion und vier Wochen nach der Injektion dargestellt. Dieses Bild zeigt die Entstehung und Auflösung einer flachen Blase aus einer 0,3-Mikroliter-Injektion

Und dieses Bild zeigt die Bildung und Auflösung einer gewölbten Blase aus einer 0,5-Mikroliter-Injektion, während dieses Bild die Bildung und Auflösung einer gewölbten Blase aus einer Ein-Mikroliter-Injektion zeigt. Abschließend noch ein Beispiel für schwere Aderhautnarben und Netzhautausdünnung an der Injektionsstelle. Die Netzhaut behält ihre normale Funktion nach der Auflösung der Bläse.

Bei neun Beleuchtungsintensitäten werden die Wellenformen für skotopische Stäbchen-vermittelte Reaktionen für die Prä-Injektion und vier Wochen nach der Injektion für 0,3 Mikroliter, 0,5 Mikroliter und 1 Mikroliter Injektionen gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 bis 15 Minuten pro Auge abgeschlossen werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Gesundheit der Augen zu beurteilen, bevor Sie beginnen.

Ausschließen von Augen mit Hornhaut- oder Linsentrübungen oder tiefliegenden Augen, bei denen dieses Verfahren sehr schwierig wäre. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie OCT- und Fundusbildgebung durchgeführt werden, um die Qualität der Injektion zu beurteilen.