Name: Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Erfahren Sie die optimierte NMDG-Schutz-Recovery-Methode zur Präparation akuter Gehirnschnitte für Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Diese Technik ermöglicht gesunde Schnitte aus erwachsenem Mäusegewebe und menschlichem Hirngewebe.

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Diese Arbeit wurde von Allen Institut für Hirnforschung finanziert. Die Autoren danken Allen Institute Gründer, Paul G. Allen und Jody Allen, für ihre Vision, Ermutigung und Unterstützung. Wir danken auch der Mitarbeiter des technischen Supports Allen Institut zur Durchführung Tierpflege, Tierhaltung und Genotypisierung.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Na + Spike-in verbessert Gigaohm Dichtung Bildung und Patch-Clamp Aufnahme Erfolg Die erste Version des NMDG-schützende Recovery-Methode wurde speziell für Erwachsene und alternde Tiere2,5. Einige "early adopters" haben auch versucht, diese Methodik für juvenile Tiere Gehirn aufschneiden gelten (d.h., Mäuse < 30 Tage alt). Allerdings wurde festgestellt, dass im Gegensatz zu den herausragenden visuell bestätigt neuronalen Erhaltung mit der NMDG schützende Wiederherstellungsmethode in dieser Altersgruppe, Gigaohm Dichtung Bildung häufig, stall kann zu fehlerhaften Patch Clamp Aufnahme Versuche. Eine Hypothese ist, dass NMDG kationen leichter in juvenile Gehirnscheiben im Vergleich zu Erwachsenen Gehirnscheiben gefangen sind und Dichtung Bildung behindern können; Allerdings Gigaohm Dichtungen können leicht bilden, während juvenile Gehirnscheiben in NMDG ACFS (Daten nicht gezeigt) vollständig untergetaucht sind, so zeigt, dass NMDG ACFS per se nicht behindert Gigaohm Dichtung Bildung.
Der rasche Übergang von niedrigen bis hohen Na+ Lösung am Ende der ersten Gehirn Slice Wiederherstellungsschritt verursacht Schäden an neuronalen Membranen und stört die Dichtung Entstehungsprozess. Dies ist intuitiv, angesichts der Tatsache, dass der Übergang von niedrigen bis hohen Na+, kalt-warmen Temperatur und dramatischen Erhöhung der Ca2 + Mg2 + -Verhältnis führen gemeinsam zu einem massiven Wiederaufflammen der spontane synaptische Aktivität. Diese hemmenden Zugstufenphase im Gehirn schneiden Verfahren wird voraussichtlich Reperfusion Verletzungen nach ischämischen Beleidigung zu spiegeln. Damit zur weiteren Abmilderung neuronalen Membran Schaden in der ersten Erholungsphase, die eine allmähliche Na+ Spike-Verfahren aufgenommen worden in der Höhe von Na+ -Konzentration in der NMDG schützende Erholung Inkubation Kammer langsam ist und reproduzierbar erhöhten mit präzisem Timing. Wie in der ursprünglichen schützende Recovery-Verfahren ist die zeitliche Trennung von Na+ Höhe von Temperatur und Ca2 +/Mg2 + Verhältnis Höhe vorteilhaft. Aber darüber hinaus das Na+ Spike-Verfahren führt zu kleinen inkrementellen Anstieg der extrazellulären Na+ -Konzentration über die frühen Zeitpunkten und hohe Zuwächse auf die späten Zeitpunkte, dadurch bieten das Hirngewebe ein Möglichkeit, besser auf die steigenden Na+ -Ebenen zu empfangen. Dieses Verfahren ist eine Alternative zur schrittweisen Lösung Austausch durch eine Perfusion Pumpe oder Schwerkraft Tropf Linien gesteuert, die führen zu einem ständigen Anstieg der Na+ Ebenen und erfordern Aufmerksamkeit auf Be- und Entlüftungsöffnungen auf der Scheibe Kammer überläuft. Bemerkenswert ist, steigt in dieser Na+ Spike-Verfahren der Osmolalität die Lösung in der Slice-Kammer langsam über einen Zeitraum von mehreren Minuten bevor die Scheiben sind normale Osmolalität Lösung zurück, aber dies nicht die Slice-Gesundheit beeinträchtigen oder Patch-Clamp Aufnahme Erfolg. Eine hohe Osmolalität Schneidelösung hat zuvor für Mittelhirn Slice Vorbereitungen verwendet worden, um besser Dopamin-Neuronen für Patch Clamp Aufnahmen57,58, so demonstriert, dass diesem temporären bewahren Hyperosmolality kann in manchen Situationen hilfreich sein.
Durch die Implementierung eines optimierten Verfahrens Kombination der NMDG schützende Wiederherstellungsmethode und allmähliche Na+ hat Spike-in Schritt die Nützlichkeit dieses Gehirn-Scheibe-Methodik ausgeweitet durch reife Erwachsene Tiere Alter Jugendlicher. Dieses aktualisierte Protokoll eignet sich nun für eine Vielzahl von tierischen Alter mit einem einzigen optimale NMDG ACFS Formulierung und Verfahren. Falls erforderlich, das Na+ Spike-Verfahren aufgebracht werden, mit einer zunehmend längere Verzögerung und/oder langsamer zeitlichen Verlauf, die Lebensfähigkeit der Hirnschnitten von älteren Tieren zu verbessern, und wir schufen einen grundlegenden Leitfaden der empfohlenen Spike-in Zeitpläne gemäß zu Tier Alter (siehe Tabelle 2). Während wir ein Grundgerüst für eine Vielzahl von Anwendungen zur Verfügung gestellt haben, können Sie zusätzliche erweiterte Schritte erkunden für Wirtschaftlichkeit und Langlebigkeit von Hirnschnitten von Erwachsenen und alternde Tiere weiter zu verbessern. Z. B. Glutathion Restaurierung Strategien sind in dieser Hinsicht besonders effektiv und können an anderer Stelle beschrieben,2,6implementiert werden.
Verbesserung der Durchsatz für anspruchsvolle Experimente Die Analyse der synaptischen Konnektivität durch Patch-Clamp-Aufnahme ist eine anspruchsvolle Anwendung, die ausgezeichnete Erhaltungszustand der neuronalen Struktur und Funktion erfordert, um eine hohe Zuverlässigkeit der Erfolg zu erzielen. Als die Zahl der Neuronen gleichzeitig aufgezeichnet werden steigt linear, die technischen Schwierigkeitsgrad supra-linear steigt. Gibt es zahlreiche Fehlermöglichkeiten, und eine der häufigsten Ursachen von Fehlern ist die Unfähigkeit, Form ausreichend Gigaohm Dichtungen auf eine oder mehrere der gezielten Zellen. Dies kann dramatisch langsame Fortschritte, insbesondere dann, wenn drei oder mehr Neuronen müssen gleichzeitig aufgezeichnet werden. Einklang mit der Feststellung der schneller Gigaohm Dichtung Bildung Zeit mit der optimierten NMDG schützende Wiederherstellungsmethode, gab es eine deutliche Verbesserung der Erfolgsquote und Durchsatz der Multi-Neuron Patch Clamp Aufnahme Experimente mit beiden Erwachsenen transgenen Maus Gehirnscheiben und Erwachsenen menschlichen neurochirurgischen Gehirnscheiben. Die verbesserte Effizienz ist fast sicher auf die schnelle und zuverlässige Gigaohm Dichtung Bildung und die verbesserte neuronale Erhaltung der Scheiben mit diesem Protokoll zurückzuführen. Obwohl dieses Protokoll auf die Vorteile explizit für die Patch-Clamp Aufnahme Anwendungen konzentriert, sind ähnliche Gewinne für andere anspruchsvollen experimentelle Anwendungen erwarten wo Gehirn Slice Lebensfähigkeit von größter Bedeutung ist.

Die akute Gehirn Slice Vorbereitung ist eine wesentliche experimentelle Modellsystem in den Neurowissenschaften. Für etwa ein halbes Jahrhundert hat diese Plattform dynamische funktionelle Studien des lebenden Gehirns in einer Vielzahl von anatomischen Hirnregionen und Tierarten aktiviert. Ob die beabsichtigte Anwendung Biochemie, funktionelle Bildgebung, Morphologie oder Elektrophysiologie ist, ist es von größter Bedeutung für optimale Integrität und Lebensfähigkeit des geschnittenen Gewebes zu gewährleisten. Es ist aus diesem Grund, dass die hoch belastbare juvenile Nagetier Gehirn Slice Vorbereitung (d.h.jünger als postnatale 30 Tage für Mäuse) bis heute die am meisten bevorzugt wurde. Die Schwierigkeit bei der Beschaffung von ausreichend gesunden Gehirns Scheiben aus älterer Erwachsener und erweist sich eine gewaltige Herausforderung für die meisten Tiere altern und schwere Einschränkungen für die Untersuchung der funktionellen Architektur des Gehirns Reife auferlegt hat. Dies gilt insbesondere für die Patch-Clamp Aufnahme, eine Technik, die erfordert exzellente morphologische und funktionelle Erhaltung und ist unverzichtbar für die Charakterisierung von detaillierter intrinsischer und synaptischer Eigenschaften identifiziert einzelne Neuronen. Für die letzten Jahrzehnte haben die überwiegende Mehrheit der Patch-Clamp-Elektrophysiologen auf eine "schützende" Schnittmethode mit Saccharose ersetzt niedrige Na+ ACFS1 für die Zubereitung von gesunden Hirnschnitten von juvenilen und in weit geringerem verlassen. Umfang, junge Erwachsene Tiere. Diese Methode basiert auf der Prämisse, dass passive Na+ Zustrom und anschließende Wassereintritt und Zelle Schwellung während der Scheibe schneiden Schritt ist die vorherrschende Beleidigung, das führt zu schlechten Überleben der Neuronen, besonders für jene Neuronen befindet sich in der oberflächlichen Schichten, die am ehesten auf direktes Trauma von der Messerbewegung aufrecht zu erhalten. Allerdings lässt die schützende Schnittmethode noch viel zu wünschen übrig für Gehirn Slice Vorbereitung von reife Erwachsene Tiere unabhängig von der besonderen ACFS Rezeptur umgesetzt.
Eine einfache, aber effektive Lösung dieses Problems wurde2,3,4,5,6 beschrieben und bezeichnet die "schützenden" Gehirn Slice Wiederherstellungsmethode. Die ursprüngliche Version dieser Methode verwendet eine NMDG ersetzt ACFS NMDG als vielseitig und effektiv unter verschiedenen anderen Kandidaten Natrium Ion Ersatzstoffe (einschließlich Saccharose, Glycerin, Cholin und Tris) identifiziert wurde. Die Medien-Formulierung wurde weiter verbessert, durch Zugabe von HEPES Slice Hirnödem zu widerstehen und stärkere pH Pufferung7sowie die Zugabe von Ergänzungen, die schädlichen Auswirkungen von oxidativem Stress (Tabelle 1) entgegenzuwirken. Es wurde empirisch festgestellt, dass eine anfänglicher Besserung Inkubation in niedrigen Na+, niedrige Ca2 +, und hohe Mg2 + NMDG ACFS unmittelbar nach erwachsenen Gehirn Gewebe schneiden notwendig und ausreichend für neuronale verbesserte Konservierung über einen weiten Bereich von Gehirnregionen, Zelltypen und tierischen Alter3,5,6.
Vor allem frühere Inkarnationen von was jetzt die schützende Wiederherstellungsmethode genannt wird in der Literatur1,8,9,10,11,12, finden Sie 13, obwohl das Potenzial für älterer Erwachsener und Alterung tierischen Gehirn Slice und Patch Clamp-Aufnahme war nicht erkannt oder in diesen früheren Werken gezeigt. Darüber hinaus weiterhin differenzierte Verfahren Variationen zur Unterstützung der spezifischen experimentellen Anwendungen4,14,15,16entstehen. Die kollektive Körper der Arbeit von diesen zahlreichen Forschungsgruppen vermittelt hohes Vertrauen in die Robustheit des schützenden Wiederherstellungsmethode für verbesserte Gewebe Erhaltung. Die NMDG schützende Wiederherstellungsmethode hat jetzt weithin beschlossen und umgesetzt in zahlreichen veröffentlichten Studien nutzen Erwachsenen tierischen Gehirn Slice Vorbereitungen. Diese akuten Slice Studien umfassen neokortikalen3,17,18, hippocampal15,19,20,21, striatalen22 , 23 , 24, Mittelhirn25,26,27,28,29und Hinterhirn30,31,32, 33 , 34 Regionen und eine Vielzahl von Neurotransmitter und Neuromodulator Arten einschließlich glutamatergen4,30, GABAergen18,20,31,35 ,36, dopaminergen24,29,37,38, cholinerge14,37,38, 39, noradrenergen40und serotonergen27,28 Neurotransmission. Die Methode eignet sich auch gut für optogenetische Kontrolle neuronaler Aktivität in Scheiben von transgenen Tieren3,39 oder nach in-Vivo virale Injektionen17,27abgeleitet, 28,40,41,42,43, als auch funktionelle Ca2 + Bildgebung neuronaler Aktivität2,44 ,45,46. Analysen der kurzfristige Plastizität4,47,48 und vielfältige Formen der langfristigen Plastizität16,35,48 berichtet. Eine aktuelle Studie angewendet die NMDG schützende Wiederherstellungsmethode zur Erleichterung, umfassende und systematische Erforschung der synaptischen Verbindungen im visuellen Kortex in reife Erwachsene Maus Gehirnscheiben mit der Octopatch Aufnahme Konfiguration49 – ein leistungsfähiges Beweis für den nutzen und die Robustheit dieser Methode. Die schützende Wiederherstellungsmethode wurde sogar erfolgreich in zuvor unvorhergesehene experimentelle Kontexte, wie verbesserte Erhaltung der Gefäßsystem und Perizyten im erwachsenen Gehirn kortikale Scheiben50, Patch-Clamp Aufnahme vom angewendet Interneuron Populationen in 1-1,5 Jahr alt von Alzheimer Maus Modelle20und einem Erwachsenen Gehirn Slice Rezeptor Menschenhandel Assay51transplantiert.
Das folgende Protokoll beschreibt Schritt für Schritt Verfahren für die Implementierung eines optimierten NMDG schützende Wiederherstellungsmethode Gehirn Slice Vorbereitung, um die Rentabilität der akuten Hirnschnitten zu verbessern. Die Grundsätze für verbesserte neuronale Erhaltung werden besprochen, sowie Demonstration der klare Vorteile dieser Methodik für komplexe Multi-Neuron Patch Clamp Aufnahme Experimente in jungen Erwachsenen transgenen Maus Gehirnscheiben und älterer Erwachsener menschlichen neurochirurgischen Gehirnscheiben. Das folgende Protokoll wurde für Mäuse aus 21 Tage alt, mehr als ein Jahr alt, als auch für menschliche neurochirurgischen Proben von erwachsenen Patienten abgeleitet validiert.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>Vibrierender Tissue-Slicer (empfohlen)</td></tr><tr><td>N-Methyl-D-Glucamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisches Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>Natriumascorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF-Bestandteil</td></tr><tr><td>Thioharnstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF Bestandteil</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF Bestandteil</td></tr><tr><td>Calciumchloriddihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF Bestandteil</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat Heptahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF Bestandteil</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromethanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anästhesiekomponente 1</td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Anästhesiekomponente 2</td></tr><tr><td>Gebogene stumpfe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td>Werkzeuge zum Sezieren des Gehirns</td></tr><tr><td>Feine Präparierschere (Supercut)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Werkzeuge zum Sezieren des Gehirns</td></tr><tr><td>Große Hochleistungsscheren 7'' Fine</td> <td>Science Tools</td><td>14000-18</td><td>Werkzeuge zum Sezieren des Gehirns</td></tr><tr><td>Metallspatel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Werkzeuge zum Sezieren des</td></tr><tr><td>Gehirns Rasierklingen</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Werkzeuge zum Sezieren des Gehirns</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td><td>Haltekammer für Gehirnscheiben</td></tr><tr><td>Nylonnetz&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Für den Bau von Rückgewinnungskammern für kleine Scheiben</td></tr><tr><td>Pyrex-Glasbecher (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Für den Bau von Rückgewinnungskammern für kleine Scheiben 35</td></tr><tr><td>mm Kunststoffschale, rund</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Für den Bau von Rückgewinnungskammern für kleine Scheiben</td></tr><tr><td>Gasdiffusorsteine (10 & Mikro; m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Für konstante Auffrischung (feine Blasen)</td></tr><tr><td>Agarose Typ I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Zum Einbetten von Gehirnproben</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Zum Befüllen von Patch-Clamp-Elektroden</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>Zur Herstellung einer kundenspezifischen Präparierplattform</td></tr><tr><td>Salzsäure&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Zur pH-Einstellung von Medien</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Für die pH-Einstellung von Medien</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Für die pH-Einstellung von Medien</td></tr><tr><td>Transferpipetten aus Kunststoff 3 mL graduiert</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Für den Schichttransfer</td></tr><tr><td>Zirkoniumkeramik-Injektorklingen</td><td>Cadence Spezialklingen</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 Borosilikatglas Kapillare mit Filament</td><td>King Glass Company</td><td>benutzerdefinierte</td><td>Angebots-ID: 0,87 mm, OD 1,50 mm</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Intern Pipettenlösung</td></tr><tr><td>Phosphokreatin Dinatrium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Intern Pipettenlösung</td></tr><tr><td>Kaliumgluconat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Intern Pipettenlösung</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Intern Pipettenlösung</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Intern Pipettenlösung</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Intern Pipettenlösung</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Intern Pipettenlösung</td></tr><tr><td>Erhitztes Wasserbad (2,5 l)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>Verschiedenes</td></tr><tr><td>Filterpapier Munition</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>Sonstiges</td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Kleber</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Sonstiges</td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Sonstiges</td></tr><tr><td>10X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Sonstige</td></tr><tr><td>30 mL Spritzen</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Sonstige</td></tr><tr><td>1 ml Spritzen</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Sonstige</td></tr><tr><td>25 5/8 Gauge Nadeln</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>Sonstige</td></tr><tr><td>Thermomischer (mit 1,5 mL Röhrchenblock)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Um Agarose geschmolzen zu halten&nbsp;</td></tr></tbody></table>

vorbereitung der akuten gehirnscheiben mit einem optimierten n-methyl-d-glucamine-schützende recovery-methode

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Dieses Protokoll ist ein praktischer Leitfaden für die N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Zahlreiche Studien haben die Nützlichkeit dieser Methode zur Verbesserung der neuronalen Erhaltung und insgesamt Gehirn Slice Lebensfähigkeit validiert. Die Umsetzung dieser Technik von "early adopters" hat detaillierte Untersuchungen der Funktion des Gehirns mit vielfältigen experimentellen Anwendungen und umfasst eine Vielzahl von tierischen Alter, Hirnregionen und Zelltypen erleichtert. Die aufgeführten Schritte sind für die Durchführung der schützenden Erholung Gehirn Stück Technik mit einem optimierten NMDG künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) Medien Formulierung und verbesserte Verfahren, um gesunde Gehirnscheiben für Patch-Clamp-Elektrophysiologie zuverlässig zu erhalten. Mit diesem aktualisierten Ansatz eine wesentliche Verbesserung in der Geschwindigkeit eingehalten wird und Zuverlässigkeit der Gigaohm Dichtung Formation während gezielte Patch Clamp Aufnahme Experimente unter Beibehaltung der ausgezeichnete Erhaltungszustand der neuronalen, wodurch es schwierig experimentelle Anwendungen. Repräsentative Ergebnisse werden bereitgestellt von Multi-Neuron Patch Clamp Experimente zur Testdurchführung Aufnahme synaptischen Konnektivität in neokortikalen Hirnschnitten von jungen Erwachsenen transgenen Mäusen und reifen Erwachsenen menschlichen neurochirurgischen Proben vorbereitet. Darüber hinaus ist die optimierte NMDG schützende Wiederherstellungsmethode des Gehirns schneiden kompatibel mit juvenilen und adulten Tieren, damit eine Einschränkung der ursprünglichen Methode zu lösen. Zusammenfassend lässt sich sagen sind ein einzelnes Medium Formulierung und Gehirn schneiden Verfahren in verschiedenen Arten und Altersklassen, ausgezeichnete Erhaltungszustand der Lebensfähigkeit und Gewebe zu erreichen realisierbar.

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gesunde Hirnschnitte von ausgewachsenen Tieren zu präparieren, die für elektrophysiologische Experimente mit Patch-Clamps geeignet sind. Diese optimierte NMDG-Protektiv-Wiederherstellungsmethode für die Präparation von Hirnschnitten ermöglicht es Forschern, die intrinsischen und synaptischen Eigenschaften von Gehirnzelltypen in vielen verschiedenen Hirnregionen und für Tiere praktisch jeden Alters zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser speziellen Technik besteht also darin, dass sie es ermöglicht, Hirnschnitte zu präparieren, die im Vergleich zu früheren Methoden einen höheren Grad an neuronaler Konservierung aufweisen.Und auch, dass diese Gehirnschnitte besser für die Aufzeichnung von Patch-Clamps geeignet sind. Diese Methode wurde für adultes Hirngewebe von Mäusen optimiert. Es kann für eine Vielzahl anderer Spezies verwendet werden, einschließlich neurochirurgisch reseziertem menschlichem Gehirngewebe.Um diesen Vorgang zu beginnen, richten Sie die Schneidestation mit der Tissue-Slicer-Maschine und den chirurgischen Instrumenten ein. Befestigen Sie eine Zirkonium-Keramik-Injektorklinge mit Schnellkleber am Klingenarm. Setzen Sie dann den Probenhalter ein und richten Sie die Vorderkante der Klinge am Rand des Probenhalters aus.Lassen Sie einen winzigen Spalt, um sicherzustellen, dass die Klinge das Metall nicht abkratzt. Füllen Sie ein 250-Milliliter-Becherglas mit 200 Millilitern NMDG HEPES aCSF. Und kühlen Sie es mehr als 10 Minuten lang auf Eis mit konstanter Kohlensäure vor.Richten Sie dann die anfängliche Wiederherstellungskammer für Hirnschnitte ein, indem Sie sie mit 150 Millilitern NMDG HEPES aCSF füllen. Und stellen Sie die Kammer in ein Wasserbad bei 32 bis 34 Grad Celsius. Um eine Warmhaltekammer für Gehirnscheiben einzurichten, füllen Sie das Reservoir mit 450 Millilitern HEPES aCSF und lassen Sie es bis zur Verwendung unter ständiger Auffrischung auf Raumtemperatur erwärmen.Bereiten Sie als Nächstes geschmolzene Agarose für die Gewebeeinbettung vor, indem Sie mit dem offenen Ende eines konischen 50-Milliliter-Fläschchens einen Block mit 2 % Agarose aus der zuvor zubereiteten Schale ausschneiden. Verschließen Sie das konische Fläschchen locker und erhitzen Sie es 10 bis 30 Sekunden lang in der Mikrowelle, bis die Agarose zu schmelzen beginnt. Nicht überhitzen.Gießen Sie die geschmolzene Agarose in 1,5 Milliliter Röhrchen. Halten Sie die Agarose mit einem Thermomixer auf 42 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln im geschmolzenen Zustand. Und achten Sie sorgfältig darauf, dass sich die geschmolzene Agarose nicht vorzeitig verfestigt.Kühlen Sie zu diesem Zeitpunkt den Zubehörkühlblock für den Slicer auf Eis vor. Machen Sie bei diesem Verfahren einen Schnitt auf der Haut des Kopfes, um die Schädeldecke freizulegen. Schneide dann mit einer feinen Super-Cut-Schere die Haut über der Schädeldecke ab.Und machen Sie kleine Schnitte seitlich auf beiden Seiten der kaudalen ventralen Basis des Schädels. Machen Sie weitere flache Schnitte, beginnend an der kaudalen dorsalen Seite des Schädels, die sich in rostraler Richtung entlang der dorsalen Mittellinie bewegen. Darauf achten, das darunterliegende Gehirn nicht zu schädigen.Machen Sie danach einen letzten T-Schnitt senkrecht zur Mittellinie auf Höhe der Riechkolben. Anschließend greifen Sie mit der Rundzange den Schädel beginnend bei der rostralen medialen Seite und schälen Sie ihn an einer Seite in Richtung kaudaler lateraler Richtung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, damit die andere Seite aufbricht.Und entfernen Sie die dorsalen Hälften der Schädelkappe, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie das intakte Gehirn vorsichtig in das Becherglas mit vorgekühltem NMDG HEPES aCSF. Und lassen Sie das Gehirn etwa eine Minute lang gleichmäßig abkühlen.Übertragen Sie nun mit einem großen Spatel das Gehirn aus dem Becherglas auf die mit Filterpapier bedeckte Petrischale. Trimmen und montieren Sie das Gehirn entsprechend dem bevorzugten Schnittwinkel und der gewünschten Hirnregion. Arbeiten Sie schnell, um einen längeren Sauerstoffmangel während der Handhabung zu vermeiden.Befestigen Sie anschließend den Hirnblock mit Klebekleber auf dem Probenhalter. Ziehen Sie das innere Stück des Probenhalters zurück, um den Hirnblock vollständig nach innen zu ziehen. Gießen Sie dann die geschmolzene Agarose direkt in den Halter, bis der Gehirnblock vollständig mit Agarose bedeckt ist.Anschließend wird der vorgekühlte Zubehörkühlblock zehn Sekunden lang um den Probenhalter geklemmt, bis die Agarose erstarrt ist. Setzen Sie den Probenhalter in die Aufnahme an der Schneidemaschine ein und überprüfen Sie die korrekte Ausrichtung. Füllen Sie anschließend das Reservoir mit dem restlichen vorgekühlten sauerstoffhaltigen NMDG HEPES aCSF aus dem 250-Milliliter-Becherglas und legen Sie den Blasenstein für die Dauer des Schneidens in das Reservoir, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten.Stellen Sie als Nächstes das Mikrometer ein, um mit dem Vorschieben der in Agarose eingebetteten Gehirnprobe zu beginnen. Starten Sie den Slicer und stellen Sie die Vorschubgeschwindigkeit und die Schwingungsfrequenz empirisch auf den gewünschten Pegel ein. Fahren Sie fort und schneiden Sie das Gewebe in 300-Mikrometer-Schritten, bis die gewünschte Gehirnregion vollständig geschnitten ist.Die Gesamtzeit für den Schneidevorgang sollte weniger als 15 Minuten betragen. Für die erste NMDG-Wiederherstellung. Nach Abschluss des Schnittvorgangs sammeln Sie alle Scheiben mit einer abgeschnittenen Kunststoffpipette und geben Sie sie in eine 34 Grad Celsius heiße Auffangkammer, die mit 150 Millilitern NMDG HEPES aCSF gefüllt ist.Das Timing des akuten Schritts zur Wiederherstellung von Hirnschnitten ist sehr wichtig, um ein Gleichgewicht zwischen morphologischer Erhaltung und funktioneller Wiederherstellung der elektrophysiologischen Eigenschaften jedes Neurons herstellen zu können. Nach der Bestimmung des optimalen Natrium-Spike-in-Zeitplans entsprechend dem Alter der Maus führen Sie das Natrium-Spike-in-Verfahren der Stufe Y durch, indem Sie die angegebenen Mengen an Natrium-Spike-in-Lösung zu den angegebenen Zeitpunkten hinzufügen. Geben Sie die Natrium-Spike-in-Lösung direkt in den Bubbler-Schornstein der ersten Rückgewinnungskammer, um ein schnelles Mischen zu ermöglichen.Der Natrium-Spike-in-Zeitplan, der mit einer Vielzahl verschiedener Altersgruppen bereitgestellt wurde, ist ein wirklich guter Ausgangspunkt. Es sollte jedoch optimiert und für Ihr eigenes spezifisches Versuchsdesign verwendet werden. Übertragen Sie anschließend alle Scheiben in die HEPES aCSF-Langzeithaltekammer, die bei Raumtemperatur gehalten wird.Lassen Sie die Scheiben eine weitere Stunde in der HEPES-Haltekammer ruhen, bevor Sie die Experimente mit der Patch-Clamp-Aufzeichnung durchführen. Hier sind die repräsentativen IR-DIC-Bilder zu sehen, die von verschiedenen Hirnregionen und akuten Schnitten einer drei Monate alten Maus zur Bewertung des morphologischen Erhalts von Neuronen aufgenommen wurden. Die hier gezeigten Ergebnisse stammen aus der Anwendung des Schutzschneidverfahrens control NMDG ohne einen schützenden Rückgewinnungsschritt.Diese Ergebnisse stammen hingegen aus der optimierten NMDG-Schutzrückgewinnungsmethode. Insgesamt wird eine verbesserte neuronale Konservierung mit der optimierten NMDG-protektiven Wiederherstellungsmethode beobachtet. Die optimierte NMDG-protektive Rückgewinnungsmethode mit einem allmählichen Natrium-Spike-in-Verfahren wurde mit der ursprünglichen NMDG-protektiven Rückgewinnungsmethode verglichen.Die durchschnittliche Zeit für die Bildung von GigaOhm-Dichtungen und die Aufzeichnung von Patch-Clamps wurde drastisch und signifikant reduziert, wenn das allmähliche Natrium-Spike-in-Verfahren zusammen mit dem NMDG-Schutzrückgewinnungsschritt angewendet wurde. Die verbesserte Neuronenkonservierung, die mit dieser Brain-Slice-Methode erreicht wird, ermöglicht anspruchsvolle experimentelle Anwendungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Elektrophysiologie von Patch-Clamps mit mehreren Elektroden, um die lokale synaptische Konnektivität zu untersuchen. Wie hier gezeigt, unter Verwendung von neokortikalen Ex-Vevo-Hirnschnitten bei Erwachsenen, die aus der Neurochirurgie stammen.Wissenschaftler sollten durch das Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie sie unsere optimierte NMDG Protective Recovery-Methode implementieren können, einschließlich des neuen Natrium-Spike-in-Verfahrens, das wir beschrieben haben, um Gehirnschnitte vorzubereiten, die für Patch-Clamp-Aufzeichnungen geeignet sind. Nach der Beherrschung dieses Protokolls sollte es also möglich sein, das Brain-Slice-Verfahren in weniger als einer Stunde pro Tag abzuschließen. Und sollte qualitativ hochwertige, reproduzierbare Hirnschnitte liefern und funktioniert für Tiere praktisch jeden Alters.Dieses Verfahren, diese Methode kann also dazu beitragen, Hirnschnitte zu präparieren, die geeignet sind, Fragen zur Gehirnfunktion unter Verwendung von Techniken wie Elektrophysiologie, optischer Live-Bildgebung und Optogenetik, Rezeptortransport-Assays und anderen Arten von funktionellen Assays zur Erforschung der Funktion von Gehirnzelltypen zu beantworten. Diese Technik ist also auch deshalb nützlich, weil sie den Forschern helfen wird, verschiedene Gehirnregionen funktionell zu untersuchen, einschließlich Gehirnregionen, die traditionell nicht für die Aufzeichnung von Patch-Clamps von erwachsenen Tieren in Hirnschnitten geeignet sind.

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Gewinnung von Hirnschnitten mit einer auf N-Methyl-D-Glucamin (NMDG) basierenden protektiven Rückgewinnungsmethode. Ein präpariertes Gehirn wird in einem aCSF mit NMDG und HEPES inkubiert, um den neuronalen Zelltod und die Schädigung während der Schnittung zu minimieren. Der Schnitt darf sich im Liquor erholen, um die zellulären Aktivitäten...

Präparation von Hirnschnitten mit einer NMDG-basierten protektiven Wiederherstellungsmethode

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Stabilisierung der Sauerstoffgehalt in einem kleinen Volumen der recycelten Puffer und methodischen Aspekten der Aufnahme aktivitätsabhängige synaptische Plastizität in getauchten akute hippocampal Scheiben.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Dieser Artikel zielt darauf ab, ein systematisches Protokoll zu beschreiben, um horizontale Hippocampus-Gehirnscheiben bei Mäusen zu erhalten. Das Ziel dieser Methode ist es, die Integrität von Hippocampus-Faserwegen zu erhalten, wie dem Perforantenweg und dem moosigen Fasertrakt, um dentate Gyrus-bezogene neurologische Prozesse zu bewerten.

Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

In dieser Arbeit wird gezeigt, wie ein waches geschlossenes Kopfverletzungsmodell verwendet werden kann, um die Auswirkungen eines wiederholten leichten Schädel-Hirn-Traumas (r-mSHT) auf die synaptische Plastizität im Hippocampus zu untersuchen. Das Modell repliziert wichtige Merkmale des r-mSHT bei Patienten und wird in Verbindung mit der in vitro Elektrophysiologie eingesetzt.

Beurteilung von Veränderungen in der synaptischen Plastizität unter Verwendung eines wachen geschlossenen Kopfverletzungsmodells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

In dieser Studie wird ein Protokoll zur Etablierung eines hochgradig reproduzierbaren Tiermodells der hämorrhagischen Transformation (HT) unter Verwendung von Verschluss/Reperfusion der mittleren Hirnarterie (MCAO/R) bei C57BL/6-Mäusen mit akuter Hyperglykämie vorgestellt.

Ein Mausmodell der hämorrhagischen Transformation, die durch akute Hyperglykämie in Kombination mit transienter fokaler Ischämie induziert wird

Erfahren Sie die optimierte NMDG-Schutz-Recovery-Methode zur Präparation akuter Gehirnschnitte für Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Diese Technik ermöglicht gesunde Schnitte aus erwachsenem Mäusegewebe und menschlichem Hirngewebe.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

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