Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gesunde Hirnschnitte von ausgewachsenen Tieren zu präparieren, die für elektrophysiologische Experimente mit Patch-Clamps geeignet sind. Diese optimierte NMDG-Protektiv-Wiederherstellungsmethode für die Präparation von Hirnschnitten ermöglicht es Forschern, die intrinsischen und synaptischen Eigenschaften von Gehirnzelltypen in vielen verschiedenen Hirnregionen und für Tiere praktisch jeden Alters zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser speziellen Technik besteht also darin, dass sie es ermöglicht, Hirnschnitte zu präparieren, die im Vergleich zu früheren Methoden einen höheren Grad an neuronaler Konservierung aufweisen.

Und auch, dass diese Gehirnschnitte besser für die Aufzeichnung von Patch-Clamps geeignet sind. Diese Methode wurde für adultes Hirngewebe von Mäusen optimiert. Es kann für eine Vielzahl anderer Spezies verwendet werden, einschließlich neurochirurgisch reseziertem menschlichem Gehirngewebe.

Um diesen Vorgang zu beginnen, richten Sie die Schneidestation mit der Tissue-Slicer-Maschine und den chirurgischen Instrumenten ein. Befestigen Sie eine Zirkonium-Keramik-Injektorklinge mit Schnellkleber am Klingenarm. Setzen Sie dann den Probenhalter ein und richten Sie die Vorderkante der Klinge am Rand des Probenhalters aus.

Lassen Sie einen winzigen Spalt, um sicherzustellen, dass die Klinge das Metall nicht abkratzt. Füllen Sie ein 250-Milliliter-Becherglas mit 200 Millilitern NMDG HEPES aCSF. Und kühlen Sie es mehr als 10 Minuten lang auf Eis mit konstanter Kohlensäure vor.

Richten Sie dann die anfängliche Wiederherstellungskammer für Hirnschnitte ein, indem Sie sie mit 150 Millilitern NMDG HEPES aCSF füllen. Und stellen Sie die Kammer in ein Wasserbad bei 32 bis 34 Grad Celsius. Um eine Warmhaltekammer für Gehirnscheiben einzurichten, füllen Sie das Reservoir mit 450 Millilitern HEPES aCSF und lassen Sie es bis zur Verwendung unter ständiger Auffrischung auf Raumtemperatur erwärmen.

Bereiten Sie als Nächstes geschmolzene Agarose für die Gewebeeinbettung vor, indem Sie mit dem offenen Ende eines konischen 50-Milliliter-Fläschchens einen Block mit 2 % Agarose aus der zuvor zubereiteten Schale ausschneiden. Verschließen Sie das konische Fläschchen locker und erhitzen Sie es 10 bis 30 Sekunden lang in der Mikrowelle, bis die Agarose zu schmelzen beginnt. Nicht überhitzen.

Gießen Sie die geschmolzene Agarose in 1,5 Milliliter Röhrchen. Halten Sie die Agarose mit einem Thermomixer auf 42 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln im geschmolzenen Zustand. Und achten Sie sorgfältig darauf, dass sich die geschmolzene Agarose nicht vorzeitig verfestigt.

Kühlen Sie zu diesem Zeitpunkt den Zubehörkühlblock für den Slicer auf Eis vor. Machen Sie bei diesem Verfahren einen Schnitt auf der Haut des Kopfes, um die Schädeldecke freizulegen. Schneide dann mit einer feinen Super-Cut-Schere die Haut über der Schädeldecke ab.

Und machen Sie kleine Schnitte seitlich auf beiden Seiten der kaudalen ventralen Basis des Schädels. Machen Sie weitere flache Schnitte, beginnend an der kaudalen dorsalen Seite des Schädels, die sich in rostraler Richtung entlang der dorsalen Mittellinie bewegen. Darauf achten, das darunterliegende Gehirn nicht zu schädigen.

Machen Sie danach einen letzten T-Schnitt senkrecht zur Mittellinie auf Höhe der Riechkolben. Anschließend greifen Sie mit der Rundzange den Schädel beginnend bei der rostralen medialen Seite und schälen Sie ihn an einer Seite in Richtung kaudaler lateraler Richtung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, damit die andere Seite aufbricht.

Und entfernen Sie die dorsalen Hälften der Schädelkappe, um das Gehirn freizulegen. Schöpfen Sie das intakte Gehirn vorsichtig in das Becherglas mit vorgekühltem NMDG HEPES aCSF. Und lassen Sie das Gehirn etwa eine Minute lang gleichmäßig abkühlen.

Übertragen Sie nun mit einem großen Spatel das Gehirn aus dem Becherglas auf die mit Filterpapier bedeckte Petrischale. Trimmen und montieren Sie das Gehirn entsprechend dem bevorzugten Schnittwinkel und der gewünschten Hirnregion. Arbeiten Sie schnell, um einen längeren Sauerstoffmangel während der Handhabung zu vermeiden.

Befestigen Sie anschließend den Hirnblock mit Klebekleber auf dem Probenhalter. Ziehen Sie das innere Stück des Probenhalters zurück, um den Hirnblock vollständig nach innen zu ziehen. Gießen Sie dann die geschmolzene Agarose direkt in den Halter, bis der Gehirnblock vollständig mit Agarose bedeckt ist.

Anschließend wird der vorgekühlte Zubehörkühlblock zehn Sekunden lang um den Probenhalter geklemmt, bis die Agarose erstarrt ist. Setzen Sie den Probenhalter in die Aufnahme an der Schneidemaschine ein und überprüfen Sie die korrekte Ausrichtung. Füllen Sie anschließend das Reservoir mit dem restlichen vorgekühlten sauerstoffhaltigen NMDG HEPES aCSF aus dem 250-Milliliter-Becherglas und legen Sie den Blasenstein für die Dauer des Schneidens in das Reservoir, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten.

Stellen Sie als Nächstes das Mikrometer ein, um mit dem Vorschieben der in Agarose eingebetteten Gehirnprobe zu beginnen. Starten Sie den Slicer und stellen Sie die Vorschubgeschwindigkeit und die Schwingungsfrequenz empirisch auf den gewünschten Pegel ein. Fahren Sie fort und schneiden Sie das Gewebe in 300-Mikrometer-Schritten, bis die gewünschte Gehirnregion vollständig geschnitten ist.

Die Gesamtzeit für den Schneidevorgang sollte weniger als 15 Minuten betragen. Für die erste NMDG-Wiederherstellung. Nach Abschluss des Schnittvorgangs sammeln Sie alle Scheiben mit einer abgeschnittenen Kunststoffpipette und geben Sie sie in eine 34 Grad Celsius heiße Auffangkammer, die mit 150 Millilitern NMDG HEPES aCSF gefüllt ist.

Das Timing des akuten Schritts zur Wiederherstellung von Hirnschnitten ist sehr wichtig, um ein Gleichgewicht zwischen morphologischer Erhaltung und funktioneller Wiederherstellung der elektrophysiologischen Eigenschaften jedes Neurons herstellen zu können. Nach der Bestimmung des optimalen Natrium-Spike-in-Zeitplans entsprechend dem Alter der Maus führen Sie das Natrium-Spike-in-Verfahren der Stufe Y durch, indem Sie die angegebenen Mengen an Natrium-Spike-in-Lösung zu den angegebenen Zeitpunkten hinzufügen. Geben Sie die Natrium-Spike-in-Lösung direkt in den Bubbler-Schornstein der ersten Rückgewinnungskammer, um ein schnelles Mischen zu ermöglichen.

Der Natrium-Spike-in-Zeitplan, der mit einer Vielzahl verschiedener Altersgruppen bereitgestellt wurde, ist ein wirklich guter Ausgangspunkt. Es sollte jedoch optimiert und für Ihr eigenes spezifisches Versuchsdesign verwendet werden. Übertragen Sie anschließend alle Scheiben in die HEPES aCSF-Langzeithaltekammer, die bei Raumtemperatur gehalten wird.

Lassen Sie die Scheiben eine weitere Stunde in der HEPES-Haltekammer ruhen, bevor Sie die Experimente mit der Patch-Clamp-Aufzeichnung durchführen. Hier sind die repräsentativen IR-DIC-Bilder zu sehen, die von verschiedenen Hirnregionen und akuten Schnitten einer drei Monate alten Maus zur Bewertung des morphologischen Erhalts von Neuronen aufgenommen wurden. Die hier gezeigten Ergebnisse stammen aus der Anwendung des Schutzschneidverfahrens control NMDG ohne einen schützenden Rückgewinnungsschritt.

Diese Ergebnisse stammen hingegen aus der optimierten NMDG-Schutzrückgewinnungsmethode. Insgesamt wird eine verbesserte neuronale Konservierung mit der optimierten NMDG-protektiven Wiederherstellungsmethode beobachtet. Die optimierte NMDG-protektive Rückgewinnungsmethode mit einem allmählichen Natrium-Spike-in-Verfahren wurde mit der ursprünglichen NMDG-protektiven Rückgewinnungsmethode verglichen.

Die durchschnittliche Zeit für die Bildung von GigaOhm-Dichtungen und die Aufzeichnung von Patch-Clamps wurde drastisch und signifikant reduziert, wenn das allmähliche Natrium-Spike-in-Verfahren zusammen mit dem NMDG-Schutzrückgewinnungsschritt angewendet wurde. Die verbesserte Neuronenkonservierung, die mit dieser Brain-Slice-Methode erreicht wird, ermöglicht anspruchsvolle experimentelle Anwendungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Elektrophysiologie von Patch-Clamps mit mehreren Elektroden, um die lokale synaptische Konnektivität zu untersuchen. Wie hier gezeigt, unter Verwendung von neokortikalen Ex-Vevo-Hirnschnitten bei Erwachsenen, die aus der Neurochirurgie stammen.

Wissenschaftler sollten durch das Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie sie unsere optimierte NMDG Protective Recovery-Methode implementieren können, einschließlich des neuen Natrium-Spike-in-Verfahrens, das wir beschrieben haben, um Gehirnschnitte vorzubereiten, die für Patch-Clamp-Aufzeichnungen geeignet sind. Nach der Beherrschung dieses Protokolls sollte es also möglich sein, das Brain-Slice-Verfahren in weniger als einer Stunde pro Tag abzuschließen. Und sollte qualitativ hochwertige, reproduzierbare Hirnschnitte liefern und funktioniert für Tiere praktisch jeden Alters.

Dieses Verfahren, diese Methode kann also dazu beitragen, Hirnschnitte zu präparieren, die geeignet sind, Fragen zur Gehirnfunktion unter Verwendung von Techniken wie Elektrophysiologie, optischer Live-Bildgebung und Optogenetik, Rezeptortransport-Assays und anderen Arten von funktionellen Assays zur Erforschung der Funktion von Gehirnzelltypen zu beantworten. Diese Technik ist also auch deshalb nützlich, weil sie den Forschern helfen wird, verschiedene Gehirnregionen funktionell zu untersuchen, einschließlich Gehirnregionen, die traditionell nicht für die Aufzeichnung von Patch-Clamps von erwachsenen Tieren in Hirnschnitten geeignet sind.